平成14年度研究報告

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きよたつのあき
5 years ago
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1 平成 14 年度研究報告研究テーマ HDR 症候群患者で同定された変異 GATA3 遺伝子の機能解析および GATA3 の性腺における発現 - GATA3 の機能解析と性腺における発現 - 旭川医科大学研究生向井徳男現所属 : 旭川医科大学小児科学講座

2 サマリー副甲状腺機能低下症感音性難聴腎形成不全を三主徴とする常染色体優性遺伝形式の稀な疾患である HDR 症候群の患者において原因遺伝子である GATA3 の遺伝子解析を行ったところ新規のミスセンス変異 (p.g260s) を同定したこれまでの報告例にミスセンス変異は少なく変異体の機能解析としてルシフェラーゼアッセイを用いて転写活性化能について検討したその結果新規変異 G260S および既報告の W275R ともに転写活性化能の低下を認めた両変異ともに GATA3 に 2 カ所ある Zn finger のうち N 末端側の Zn finger 内部における変異であることから DNA 結合もしくは相互作用因子として同定されている FOG (Friend of GATA) との結合に影響している可能性が考えられたまたこの症例に特徴的な点は原発性性腺機能低下症を合併していることでありこれまでのところ HDR 症候群に性腺機能低下を合併するとの報告はなく GATA3 遺伝子の変異が性腺機能に及ぼす影響に関してもこれまでのところ報告はないさらに性腺における GATA3 の発現に関する報告もないそこで成獣マウスの組織を用いて RT-PCR 法により性腺における Gata3 の発現について検討したその結果マウス性腺における Gata3 の発現量は雌雄ともにごく微量なものであったヒト性腺における GATA3 の発現に関する報告はないため推測の域を出ないが少なくともマウス Gata3 の性腺における機能は限定的なものと考えざるを得なかった

3 研究報告緒言 HDR 症候群 (MIM146255) は副甲状腺機能低下症感音性難聴腎形成不全を三主徴とする常染色体優性遺伝形式の稀な疾患である 1) 2000 年に GATA3 遺伝子のハプロ不全が本症候群を引き起こすことが報告された 2) ヒト GATA3 遺伝子は 10p15 に位置し 3) 6 個のエクソンから構成され約 17kb の DNA に 443 アミノ酸がコードされている 4) GATA3 は (A/T) GATA (A/G) のコンセンサス配列に結合する zinc finger タイプの転写因子 GATA ファミリーの一員であり血球系の細胞や腎臓内耳副甲状腺中枢神経胸腺などでの発現が報告されている 5) これまでの GATA3 異常報告例においてはそのほとんどがナンセンス変異やフレームシフト変異欠失型変異でありミスセンス変異は 1 報告 (W275R) しか存在しない 6) Gata3 ノックアウトマウスの報告 7) では造血障害および中枢神経の形成異常を起こすために胎生致死となってしまうことからその他の臓器における Gata3 の機能に関しては未知の状態である我々はこの HDR 症候群を呈する 2 家系 3 症例において GATA3 遺伝子解析を行い遺伝子変異を見出したこのうちの 1 症例に関してはこれまでに報告のない新規の変異であり 2 カ所ある zinc finger のうち N 末端側の 1 st zinc finger 内のアミノ酸変異を引き起こすミスセンス変異 (p.g260s) であった ( 図 1) 両親には遺伝子変異は認めず de novo の遺伝子変異と考えられたまたこの症例に特徴的な点は原発性性腺機能低下症を合併していることでありこれまでのところ HDR 症候群に性腺機能低下を合併するとの報告はなく GATA3 遺伝子の変異が性腺機能に及ぼす影響に関してもこれまでのところ報告はない性腺における GATA3 の発現に関する報告もないそこで本研究においては同定した新規遺伝子変異の機能解析とマウス性腺における Gata3 の発現について検討した方法 1 変異 GATA3 の機能について COS-7 細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを行い転写活性化能について検討したルシフェラーゼレポータープラスミドとして GATA 結合配列の 3 回繰り返しを有するものを用いた GATA3 発現ベクター (pssrα-hgata3) については野生型を鋳型として site-directed mutagenesis によりミスセンス変異 2 種類 (G260S W275R) を作製したヒト正常 GATA3 ないしは変異 GATA3 の発現ベクターをリポフェクション法にてトランスフェクトして行った

2 マウス性腺における Gata3 の発現について Mouse Gata3 に対する PCR プライマーを GATA 因子間で比較的相同性の低い領域でイントロン 1 を挟み込むように設計したこのプライマーを用いて 10 週齢のマウスから摘出した組織より抽出した total RNA をテンプレートとして RT-PCR を行った結果 1 COS-7 細胞を用いて行ったルシフェラーゼアッセイにより

4 2 マウス性腺における Gata3 の発現について Mouse Gata3 に対する PCR プライマーを GATA 因子間で比較的相同性の低い領域でイントロン 1 を挟み込むように設計したこのプライマーを用いて 10 週齢のマウスから摘出した組織より抽出した total RNA をテンプレートとして RT-PCR を行った結果 1 COS-7 細胞を用いて行ったルシフェラーゼアッセイにより G260S W275R ともに野生型 GATA3 に比して転写活性の量依存的活性化能が著しく損なわれていた ( 図 2) 2 精巣と卵巣での Gata3 の発現はほぼ同程度のごく微量な発現しか検出することができなかった ( 図 3) 考察転写活性化能については検討した 2 種類のミスセンス変異ともに著しい機能低下を示した両変異ともに N 末端側の Zn finger 内部における変異であることから DNA 結合もしくは相互作用因子として同定されている FOG ( Friend of GATA) との結合に影響している可能性が考えられた今後は FOG との結合能について yeast two-hybrid 法などを用いて検討を加えていきたいと考えているまたマウス性腺における Gata3 の発現量は雌雄ともにごく微量であったヒト性腺における GATA3 の発現に関する報告はないため推測の域を出ないが少なくとも Gata3 の性腺における機能は限定的なものと考えざるを得なかった ( 図 1) 新規 GATA3 遺伝子変異 :codon260 のヘテロ変異 GGC (Gly)->AGC (Ser)

5 ( 図 2) ルシフェラーゼアッセイ 6 5 Fold activation mock WT-GATA3 G260S W275R ( 図 3) RT-PCR Primer ZF1 ZF2 mouse Gata3 N- -C E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 E 6 ng / µg total RNA 4.0e e e e e -3 Testis Ovary Male Adrenal Female Adrenal Female Liver Female Kidney Mouse Gata3 (10wk-old) Mouse Gapdh 0.0e -0

6 < 参考文献 > 1. Bilous RW, Murty G, Parkinson DB, Thakker RV, Coulthard MG, Burn J, Mathias D, Kendall-Taylor P: Autosomal dominant familial hypoparathyroidism, sensorineural deafness, and renal dysplasia. New Eng. J. Med. 327: , Van Esch H, Groenen P, Nesbit MA, Schuffenhauer S, Lichtner P, Vanderlinden G, Harding B, Beetz R, Bilous RW, Holdaway I, Shaw NJ, Fryns JP, Van de Ven W, Thakker RV, Devriendt K: GATA3 haplo-insufficiency causes human HDR syndrome. Nature 406: , Joulin V, Bories D, Eleout JF, Labastie MC, Chretien S, Mattei MG, Romeo PH: A T-cell specific TCR delta DNA binding protein is a member of the human GATA family. EMBO J. 10: , Labastie MC, Bories D, Chabret C, Gregoire JM, Chretien S, Romeo PH: Structure and expression of the human GATA3 gene. Genomics 21: 1-6, Debacker C, Catala M, Labastie MC: Embryonic expression of the human GATA-3 gene. Mech. Dev. 85: , Muroya K, Hasegawa T, Ito Y, Nagai T, Isotani H, Iwata Y, Yamamoto K, Fujimoto S, Seishu S, Fukushima Y, Hasegawa Y, Ogata T: GATA3 abnormalities and the phenotypic spectrum of HDR syndrome. J. Med. Genet. 38: , Pandolfi PP, Roth ME, Karis A, Leonard MW, Dzierzak E, Grosveld FG, Engel JD, Lindenbaum MH: Targeted disruption of the GATA3 gene causes severe abnormalities in the nervous system and in fetal liver haematopoiesis. Nature Genet. 11: 40-44, 1995

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Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011) 86. 線虫 C. elegans およびマウスをモデル動物とした体細胞レベルで生じる性差の解析井上英樹 Key words: 性差, ストレス応答,DMRT 立命館大学生命科学部生命医科学科緒言性差は雌雄の性に分かれた動物にみられ, 生殖能力の違いだけでなく形態, 行動などそれぞれの性の間でみられる様々な差異と定義される. 性差は, 形態や行動だけでなく疾患の発症リスクの男女差といった生理的なレベルの差異も含まれる.