バイナリーパターン法によるデノボタンパク質WA20の

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ためひとはかまや
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1 配列パターンデザインによる新規人工設計タンパク質の半合理的創製と構造解析およびナノ構造構築への応用信州大学繊維学部応用生物科学系新井亮一 1. はじめに新規人工設計タンパク質 ( デノボタンパク質 de novo protein) とは天然タンパク質のアミノ酸配列をもとにせず新規にアミノ酸配列を設計した人工タンパク質であるタンパク質を自由自在にデザインし望みの構造や機能を創り出すことができるようになれば新規酵素や医薬品の開発さらにはナノバイオテクノロジーの発展等にも大きく貢献できると考えられタンパク質工学研究の究極的目標であるしかしながら 20 種類のアミノ酸をランダムに 100 残基つなげる場合 = 約通りもの莫大な配列組み合わせがありその中から安定な構造や優れた機能を持つタンパク質の配列を探索することは極めて困難である新規人工設計タンパク質の創製において安定な構造や優れた機能を持つタンパク質の配列をいかにしてデザインし選択するかは非常に本質的で重要な課題であるが現在でも大変困難な問題であるこれまでに新規人工設計タンパク質の創製は主に三種類の方法で行われてきた立体化学的および物理化学的なアプローチにより合理的に設計する方法ランダムな組合せのアミノ酸配列ライブラリーから選択する方法そしてこれらの合理的な方法とランダムな組合せの方法の両方の要素を取り入れた配列パターンデザインによる半合理的方法である本研究ではこの半合理的方法であるバイナリーパターン法を用いて創製した新規人工設計タンパク質 WA20 について X 線結晶構造解析法を用いてユニークなドメインスワップ二量体構造を解明したさらに最近ではこの特徴的な構造を活かしたタンパク質ナノブロックを開発しナノ構造複合体構築への応用を目指した研究を展開しているので併せて紹介する 2. 配列パターンデザインによる新規人工設計タンパク質の半合理的創製著者が 2006~2007 年に研究留学したプリンストン大学の Michael H. Hecht 教授の研究室ではその半合理的方法であるバイナリーパターン法により配列パターンをデザインしたアミノ酸配列ライブラリーを用いて新規人工設計タンパク質を創製する研究が早くから盛んに行われてきた (1,2) バイナリーパターン法とは水溶性球状タンパク質の表面には親水性アミノ酸が多く配置され内部には疎水性アミノ酸が多く配置される性質に着目して目的タンパク質の二次構造及び三次構造に応じて親水性アミノ酸 (Asn Asp Gln Glu His Lys のいずれか ) と疎水性アミノ酸 (Ile Leu Met Phe Val のいずれか ) の2 種類の繰り返し配列パターンを半合理的にデザインする方法であるこれまでにバイナリーパターン法を用いて α へリックスの周期に従って 1~3 残基毎に親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸のパターンをデザインした両親媒性 α ヘリックス構造や親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸のパターンを 1 残基毎に交互にデザインした β ストランド構造を持つ新規人工設計タンパク質等が創製されてきた (2) 1

Hecht 研究室ではこのバイナリーパターン法を用いて特に 4 本の両親媒性 α ヘリックスを順にループでつないで束とした 4 本ヘリックスバンドル構造の新規人工設計タンパク質についてこれまでに重点的に研究してきた特に機能を持つ人工設計タンパク質の創製を目指してバイナリーパターンを保持し α ヘリックスの両端以外の部分とループ部分のアミノ酸残基をライブラリー化した第 3 世代の 4

線結晶構造解析による立体構造解析を試みた A B 親水性疎水性ループ図 1 バイナリーパターン法による4 本ヘリックスバンドルデノボタンパク質ライブラリー (A) バイナリーパターン法によりデザインされた第 3 世代 4 本ヘリックスバンドル新規人工設計タンパク質ライブラリー模式図 (3) 数珠状の球のひとつひとつはアミノ酸残基を表す 2~3 残基毎に疎水性アミノ酸を配置し

2 Hecht 研究室ではこのバイナリーパターン法を用いて特に 4 本の両親媒性 α ヘリックスを順にループでつないで束とした 4 本ヘリックスバンドル構造の新規人工設計タンパク質についてこれまでに重点的に研究してきた特に機能を持つ人工設計タンパク質の創製を目指してバイナリーパターンを保持し α ヘリックスの両端以外の部分とループ部分のアミノ酸残基をライブラリー化した第 3 世代の 4 本ヘリックスバンドル新規人工設計タンパク質ライブラリーが作製された ( 図 1)(3) この人工タンパク質ライブラリーから獲得した高発現タンパク質クローンの中より構造が特に安定であり変性剤によって二状態転移を示し弱い酵素活性も有する新規人工設計タンパク質 WA20 が得られた (3) そこでこの WA20 の構造的特徴を詳細に解明することを目的として X 線結晶構造解析による立体構造解析を試みた A B 親水性疎水性ループ図 1 バイナリーパターン法による4 本ヘリックスバンドルデノボタンパク質ライブラリー (A) バイナリーパターン法によりデザインされた第 3 世代 4 本ヘリックスバンドル新規人工設計タンパク質ライブラリー模式図 (3) 数珠状の球のひとつひとつはアミノ酸残基を表す 2~3 残基毎に疎水性アミノ酸を配置し親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸のパターンをデザインした両親媒性 αヘリックスが4 本形成しループでつなぐように設計されている (B) デザインした4 本ヘリックスバンドル構造の断面模式図 4 本の両親媒性 αヘリックスからなる束の内側に疎水性アミノ酸残基が集中し外側には親水性アミノ酸残基が配置するように設計されている 3. 新規人工設計タンパク質 WA20の立体構造解析新規人工設計タンパク質 WA20は大腸菌を用いてSeMet 置換体を発現し各種クロマトグラフィーにより高純度に精製した様々な結晶化条件を検討して得られた結晶についてKEK PF BL-5A にてX 線回折データを収集し多波長異常分散を用いて X 線結晶構造解析法により2.2 A 分解能で立体構造を決定した (PDB: 3VJF) (4) 非常に意外だったことに WA20の結晶構造は設計の際に想定していた単量体の4 本ヘリックスバンドル構造ではなく二量体の4 本ヘリックスバンドル構造であったそれぞれのWA20 単量体は 40~46 残基の長いαヘリックス2 本からなるヌンチャクのような構造を取りその構造がもう一方の単量体の構造とお互いに深く挟み込むように絡み合ったドメインスワップ二量体構造を形成していた ( 図 2) ( ドメインスワップとは複数の 2

タンパク質分子が互いに部分的に絡み合うようにして他の分子の構造の一部分をあたかも自らの分子の構造の一部分として取り込むように折り畳みながら多量体形成することである ) WA20の結晶構造ではバイナリーパターン法によりデザインした通りに疎水性アミノ酸の側鎖は内側に向いており親水性アミノ酸の側鎖は外側に向いていた二量体形成の接触面は疎水性クラスターのコアが形成されおり

3 タンパク質分子が互いに部分的に絡み合うようにして他の分子の構造の一部分をあたかも自らの分子の構造の一部分として取り込むように折り畳みながら多量体形成することである ) WA20の結晶構造ではバイナリーパターン法によりデザインした通りに疎水性アミノ酸の側鎖は内側に向いており親水性アミノ酸の側鎖は外側に向いていた二量体形成の接触面は疎水性クラスターのコアが形成されおり二量体接触面は塩橋や水素結合によりさらに安定化していた WA20の熱安定性を測定したところ変性温度 Tmは約 70 と比較的高く WA20の二量体構造では単量体の4 本ヘリックスバンドル構造の場合と比較して疎水性コア部分が約 2 倍程度増加しており高い安定性の要因となっていると考えられた A C C 3 nm B N 8 nm N + ヌンチャク型人工タンパク質 WA20 3 ドメインスワップ二量体構造図 2 新規人工設計タンパク質 WA20の立体構造 (A) X 線結晶構造解析により解明した新規人工設計タンパク質 WA20の4 本へリックスバンドルドメインスワップ二量体構造 ( リボン図 )(PDB: 3VJF) (4) (B) ヌンチャク型構造の WA20がドメインスワップ二量体構造を形成することを説明する模式図 WA20 の二量体形成の鍵となるアミノ酸残基を推定するために単量体 4 本へリックスバンドル新規人工設計タンパク質 S-824 の構造 (PDB: 1P68) およびアミノ酸配列を WA20 と比較すると番残基と番残基の第 1 第 3 ループ設計領域において顕著な違いが見られた特に立体構造上で His26 と Glu78 の側鎖間で塩橋を形成しこの領域の構造を安定化していたさらに小角 X 線散乱法により溶液中においても WA20 の全体的な大きさと概形は長さ約 8 nm 直径約 3 nm の円筒状であり二量体の 4 本ヘリックスバンドル構造を形成していることが示されたまた WA20 はヘムと結合して紫外可視吸収スペクトルでソーレー帯のピーク ( 約 410 nm) を示し弱いペルオキシダーゼ活性を持つことやさらに天然の酵素と比較すると非常に低い活性ではあるが WA20 は弱いエステラーゼ活性やリパーゼ活性を持っている (3) WA20 のミカエリスメンテン定数 Km は天然酵素の値と同程度であり代謝回転数 kcat は天然酵素に比べて約分

の1 程度であったそこでエステラーゼ活性やリパーゼ活性の基質結合部位を推定するために WA20 結晶構造上のポケット部位を探索したところ二つの比較的大きなポケット部位がA 鎖とB 鎖の間に見つかったおそらく WA20は基質結合部位を有するが触媒残基は未だ適切に配置されていないことが推察される今後このようなポケット部位を持つWA20のドメインスワップ二量体構造をもとにして

新規人工タンパク質 WA20を利用したタンパク質ナノブロックの設計開発及びナノ構造構築への応用上述のようにバイナリーパターン法によりデザインした新規人工タンパク質 WA20はユニークな4 本へリックスバンドルドメインスワップ二量体構造を形成することを明らかにしたさらに最近ではこのWA20の特徴的なドメインスワップ二量体構造を活かしたタンパク質ナノブロック (Protein

WA20-foldonを大腸菌で発現精製し Native-PAGEにより分析すると数種類の複合体 ( 多量体 ) 構造を同時に形成したこれらを分離精製しゲルろ過クロマトグラフィーと小角 X 線散乱法により主要な2 種類の複合体 small form (S-form) とmiddle form (M-form) の分子量を推定したところ S-formは6 量体 M-formは12

4 の1 程度であったそこでエステラーゼ活性やリパーゼ活性の基質結合部位を推定するために WA20 結晶構造上のポケット部位を探索したところ二つの比較的大きなポケット部位がA 鎖とB 鎖の間に見つかったおそらく WA20は基質結合部位を有するが触媒残基は未だ適切に配置されていないことが推察される今後このようなポケット部位を持つWA20のドメインスワップ二量体構造をもとにして分子進化工学的手法により触媒残基を最適化することにより酵素工学分野への応用に向けて新規人工設計酵素開発のためのシンプルでユニークな基本骨格構造として利用できる可能性も期待される 4. 新規人工タンパク質 WA20を利用したタンパク質ナノブロックの設計開発及びナノ構造構築への応用上述のようにバイナリーパターン法によりデザインした新規人工タンパク質 WA20はユニークな4 本へリックスバンドルドメインスワップ二量体構造を形成することを明らかにしたさらに最近ではこのWA20の特徴的なドメインスワップ二量体構造を活かしたタンパク質ナノブロック (Protein Nano-building Block, PN-Block) を設計開発し新たに人工タンパク質のナノ構造複合体を創出することを目的とした研究を展開しているそこでこのWA20を利用したタンパク質ナノブロックの第 1 弾として WA20とT4ファージfibritinの三量体形成 foldonドメインとの融合タンパク質 WA20-foldon 人工融合タンパク質を設計開発した ( 図 3)(5) WA20-foldonを大腸菌で発現精製し Native-PAGEにより分析すると数種類の複合体 ( 多量体 ) 構造を同時に形成したこれらを分離精製しゲルろ過クロマトグラフィーと小角 X 線散乱法により主要な2 種類の複合体 small form (S-form) とmiddle form (M-form) の分子量を推定したところ S-formは6 量体 M-formは12 量体を形成していることが示されたまた小角 X 線散乱法より得られた二体間距離分布関数 p(r) 等からS-formとM-formのナノ構造複合体の概形はそれぞれ樽型構造と正四面体 ( テトラポッド ) 型構造であることが示唆された A B C WA20 (PDB: 3VIJ) Foldon (PDB: 1RFO) 連結融合 WA20-foldon タンパク質ナノブロック (Protein Nano-building Block) 自己組織化樽型構造 (S-form 6-mer) 正四面体型構造 (M-form 12-mer) S-form model M-form model 図 3 タンパク質ナノブロック WA20-foldon の設計開発及びナノ構造複合体構築 (A) 新規人工タンパク質 WA20 と T4 ファージ fibritin の三量体形成 foldon ドメインのリボン図と模式図 (B) タンパク質ナノブロック WA20-foldon 人工融合タンパク質の設計構築模式図 (C) WA20-foldon ナノ構造複合体デザイン模式図と小角 X 線散乱より得られた構造モデル 4

5 さらに最近リンカーを介してWA20タンパク質 2 個を直列につないだタンデムWA20のタンパク質ナノブロックを構築し様々な人工タンパク質複合体を創出している今後もこれらのユニークな構造や特性を活かしてさらなるタンパク質ナノブロックを開発し組み合わせて自己組織化することにより多様な人工タンパク質複合体の創出を目指していく 5. おわりに新規人工設計タンパク質を用いてタンパク質ナノブロックを設計開発しナノ構造複合体を創出する研究は世界でも未だに報告例は少ない今後タンパク質が持つ特異的自己組織化能や高機能性を活かしたタンパク質ナノブロックの創出へ向けて新規人工設計タンパク質を応用する研究をさらに進めていく例えばより安定性を向上させたナノブロックやお互いが特異的に会合するナノブロック金属等のリガンド依存的に自己組織化が誘導されるナノブロックなど他にも様々な有用なタンパク質ナノブロックの設計開発を目指すさらにこれらを自在に組み合わせていくことにより天然タンパク質では実現できないような多様な構造や機能を持つ人工タンパク質ナノ構造複合体のデザインや創製につながると考えられタンパク質工学や酵素工学分野のみならず合成生物学やナノバイオテクノロジー等の広範な研究分野に新たな可能性を拓いていくことが期待できる謝辞本研究は信州大学博士課程学生の小林直也氏を中心にプリンストン大学の Michael H. Hecht 教授や信州大学の佐藤高彰准教授らとの共同研究の成果であり心より感謝致しますまた本研究は文部科学省テニュアトラック普及定着事業科学研究費補助金日本学術振興会の海外特別研究員特別研究員制度等の多大な支援を受けて行われたもので心より御礼申し上げます最後になりましたが学生時代から長年にわたり御指導頂きこのたびの酵素工学奨励賞に御推薦頂きました東京大学の長棟輝行教授をはじめ酵素工学研究会の先生方及び関係者の皆様にこの場を借りて厚く御礼申し上げます参考文献 1. Kamtekar, S., Schiffer, J. M., Xiong, H., Babik, J. M., and Hecht, M. H. (1993) Protein design by binary patterning of polar and nonpolar amino acids. Science 262, Hecht, M. H., Das, A., Go, A., Bradley, L. H., and Wei, Y. (2004) De novo proteins from designed combinatorial libraries. Protein Sci. 13, Patel, S. C., Bradley, L. H., Jinadasa, S. P., and Hecht, M. H. (2009) Cofactor binding and enzymatic activity in an unevolved superfamily of de novo designed 4-helix bundle proteins. Protein Sci. 18, Arai, R., Kobayashi, N., Kimura, A., Sato, T., Matsuo, K., Wang, A. F., Platt, J. M., Bradley, L. H., and Hecht, M. H. (2012) Domain-swapped dimeric structure of a stable and functional de novo four-helix bundle protein, WA20. J. Phys. Chem. B 116, Kobayashi, N., Yanase, K., Sato, T., Unzai, S., Hecht, M. H., and Arai, R. (2015) Self-assembling nano-architectures created from a protein nano-building block (PN-Block) using a intermolecularly folded dimeric de novo protein. J. Am. Chem. Soc., in press. 5

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が参考資料配布 2014 年 11 月 10 日独立行政法人理化学研究所国立大学法人東北大学血小板上の受容体 CLEC-2 は糖鎖とペプチド鎖の両方を認識 - マムシ毒は糖鎖に依存せず受容体と結合 - 本研究成果のポイントレクチンは糖鎖とのみ結合するというこれまでの考え方を覆す CLEC-2 受容体は同じ領域でマムシ毒とがんに関わる糖タンパク質に結合糖鎖を模倣したペプチド性薬剤の設計への応用に期待