第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 2 創薬研究の初期段階において しばしば直面する問題 1. 興味深い創薬標的があるものの 創薬研究の出発点となる阻害物質等がな創薬研究の出発点となる阻害物質等がない ( 阻害物質等に関する論文情報 特許情報等が見当たらない )

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1 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 1 3F04 酵素 受容体阻害剤開発のアプローチ 10 月 17 日 ( 金 ) 14:00~16:00 第 4 会場 (C-1) オーガナイザー : 保川清先生 ( 京都大学大学院農学研究科 ) 高橋砂織先生 ( 秋田県総合食品研究センター ) 様々な蛋白質間相互作用 (I) の制御を可能にする多面的創薬アプローチ インタープロテイン株式会社 最高科学責任者兼事業開発本部長 小松弘嗣

2 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 2 創薬研究の初期段階において しばしば直面する問題 1. 興味深い創薬標的があるものの 創薬研究の出発点となる阻害物質等がな創薬研究の出発点となる阻害物質等がない ( 阻害物質等に関する論文情報 特許情報等が見当たらない ) 2. High throughput screening(hts) を実施したが 良いヒット化合物が見つからなかった 3. 何らかの理由で HTS を実施できなかった ( できない ) 4. 活性化合物 ( の情報 ) はあるが 種々の理由により骨格変換を図りたい骨格変換を図りたい 5. SBDD (structure-based drug design/discovery) を実施したいが 標的蛋白質の立体構造が明らかになっていない 創薬のアイデアはあるものの 阻害物質 ( または作動物質 ) の探索に関し 実効性のある研究ステージに移行できない

3 様々な状況に対応した創薬アプローチ 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 3 A 標的蛋白質の X 線結晶構造は判明しているが 結合化合物に関する情報はない INTENDD による分子設計的アプローチ ( 低分子化合物 ) B C D 活性化合物 ( の情報 ) はあるが 骨格変換を図りたい標的蛋白質の X 線結晶構造が判明しておらず 結合物質に関する情報もない標的蛋白質の X 線結晶構造が判明しており かつ α-helix 構造が結合に関与することが判っている Helix-loop-helix peptide 技術によるアプローチ (hage-displayed library からのスクリーニング ) (α-helix 構造が結合に関与している場合 ) Helix-loop-helix peptide 技術によるアプローチ ( 構造に基づいた rational design) 各種の酵素 受容体を含め 実質的に ほぼすべての標的に対し 実践的実践的な ( 実効性の高い ) 創薬研究をスタートさせることが可能である

4 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 4 Helix-loop-helix peptide とは? 大阪府立大学藤井郁雄教授によって考案された立体構造規制ペプチドの 1 種であり マイクロ抗体マイクロ抗体 とも呼ぶ 右図のように 2 本の α-helix が上部の loop で結ばれた構造を有し 総計約 35 個のアミノ酸からからなる ( 右の α-helix の外側又は上部のリンカー部分が標的蛋白質に結合する ) 2 本の α-helix の内側には leucine 間の疎水的相互作用が存在し これにより 安定な構造が保たれている 下部も結合する ( 環状化する ) ことにより 安定安定性がさらに増大する 右の α-helixの外側の外側の一部および上部のリンカー部分のアミノ酸は自由に置き換えることが可能であり 10 9 個程度の phage-displayed random peptide library からのスクリーニングにより 高い親和性で標的蛋白質に結合するペプチドを得ることができる 標的蛋白質が α -helix を認識することが判明している場合には その α-helix 構造を模倣したペプチドを rational design により取得することができるすることができる

5 p53 および p53/mdm2 (HDM2) 結合阻害 helix-loop-helix peptide の結合イメージ p53 MDM2 / p53 1YCR.pdb 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 5 HLHp53-1R 2 本の α-helix のうちの 1 本 ( 標的蛋白質に結合する方 ) he19 he30 Leu22 Trp23 Leu33 Leu37 Trp34 Leu26 結合に寄与する p53 のアミノ酸を rational design によって helix-loo-helix peptide の鋳型に載せることで高親和性 (KD ( 値 10 nm) ) の結合阻害 peptide を取得できた

6 Helix-loop-helix peptide による Is 阻害の結合イメージ Case A: α-helix が結合に関与する α-helix in the interface IL-4 IL-4Rα 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 6 Helix-loop-helix peptide [3BL] Case B: α-helix が結合に関与しない CD86 が結合に関与しない ( 立体構造が不明 ) CTLA-4 Rational design and synthesis of helixloop-helix peptide (no requirement of screening from peptide libraries) Helix-loop-helix peptide [1I85] No α-helix in the interface (or no information on structure) Screening of helix-loop-helix peptide from phage-displayed random peptide libraries 各種の酵素 受容体を含め 実質的に ほぼすべての標的に対して helix-loop-helix peptideを取得する取得することが可能である

7 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 7 Helix-loop-helix peptide (MicroAntibody) 技術の特徴 結合親和性 選択性 安定性 抗原性 汎用性 標的蛋白質に対して高い親和性を示す (10 nm> KD 値 > 0.5 nm) ) 標的蛋白質に対して高い選択性を有する 血清中で高い安定性を示す ( 環状化したペプチドの半減期は 15 日以上 ) マイクロ抗体単独では抗体産生を誘導せず 抗原性のリスクが低い α-helix を認識しない標的およびおよび細胞内の標的に対しても適応が可能である interaction p53 HDM2 KD = 3 nm IC50 = 36 nm KD = 10 nm 医薬品として必要とされる特性を有する ペプチド を多くの創薬標的に対して比較的容易に取得するすることができ ペプチド医薬 の新たな道を切り開く

8 1. 低分子結合部位の同定 a. 精密な立体分子模型立体分子模型を使用 b. 約 1 ヶ月で低分子結合部位を決定決定すると共に大まかな分子設計戦略も策定 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 8 INTENDD (INTerprotein s Engine for New Drug Design) の概要 主なステップと特徴主なステップと特徴 ( 立体分子模型は 2-3 時間で作製可能 ) 2. SBSG (structure-based scaffold generation) 法による in silicoscreening a. 期間は約 3 ヶ月 b. 通常 ( 約 1000 万個の市販化合物ライブラリーから ) 個の化合物を提案 (HTSは必要としない ; 化合物購入費用も高額ではない ) 1 回の検討で複数の基本骨格を見出すことが可能 分子量 log 値などの観点からも drug-likeness の高い化合物を選定可能 c. 各標的 ( 結合部位 ) ごとに unique なアルゴリズムを作成する d. ジグソーパズルと同様に 形 ( 結合部位の空間の形状と化合物の構造の相補性 ) と 色 ( 原子間の相互作用のメカニズム ) を合致させることを基本的戦略とする e. 化合物選定の最終段階において 通常のドッキング法のような結合エネルギー計算 (molecular dynamics) ) に依存した化合物の順位付けは行わない f. 想定した 結合メカニズム に合致する化合物 結合メカニズム に合致する化合物のみを選定する

9 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 9 M1 モデル (M3 改変 ) とAM-GSK26 のドッキング シミュレーション GSK26 L216 A217 I229 Q227 K517 D518 E522 E526 L128 H132 L129 S226 / O L225 / O 45 Y506 / OH All contacts H-bonds H-bonds 可能性のあるすべての相互作用を考慮するのではなく ある特定の結合メカニズムのみを抽出し それに合致する化合物を選定する

10 MD に基づいた化合物の順位付と wet 評価の結果との相関 IC 50 values for I (μmol/l) Low activity High activity 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 10 Low activity > Low MD score but high I inhibitory activity MD score High activity -11 Theoretical correlation High MD score but low I inhibitory activity Wet 評価での活性と MD スコア上の順位が相関しないケースが数多く存在する (MD の計算結果には false positiveが多数多数存在する )

11 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 11 低分子 IL-6/IL-6 受容体間相互作用制御化合物の ( 作用機序面の ) コンセプト Small molecule IL-6 inhibitor IL-6R STAT3 STAT3 STAT3 IL-6 JAK gp130 JAK SH2 IL-6R への IL-6 結合量 (RU) SH2 IL-6/IL-R 結合が部分的に阻害される High concentration of compound(tt002) No compound Time (sec) STAT3 STAT3 SH2 Grb2 Sos Gab SH2 I3K Ras/ERK AKT 1. IL-6 に結合することにより IL-6/IL-6 受容体間の相互作用を不完全 ( 不安定 ) なものにする 2. その結果 IL-6/IL-6 受容体 /gp130 の複合体 (6 量体 ) からのシグナルを減弱させる 備考 : IL-6/IL-6 受容体間の結合を完全に阻害する化合物群も同定されている

12 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 12 低分子 IL-6/IL-6 受容体間相互作用を制御する代表的化合物を用いた NMR 解析 IL-6 alone (40 µmol/l) IL-6 alone (40 µmol/l) IL-6 + TT001 (500 µmol/l) IL-6 alone (40 µmol/l) IL-6 + TT002 (500 µmol/l) AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA7 AA8 AA9 AA10 1. A binding site that consists of 10 amino acids (AA1-10) was proposed. 2. Compounds that are expected to bind to the binding site were designed and synthesized. 3. Experimental condition of NMR was carefully examined with TT001, which showed IL-6-binding activity and inhibitory effect on IL-6/IL-6R binding by SR. 4. TT001 was clarified to interact with 5 amino acids (AA3, 4, 5, 8, 9) of 10 amino acids consisting of the binding site. 5. Under the same condition, TT002, more efficacious than TT001 in SR, showed interactions with 7 amino acids (AA3, 4, 5, 7, 8, 9, 10). 代表的化合物の一つである TT002( ( 分子量約 430) ) は NMR 解析 ( 15 N-HSQC 法 ) によって IL-6 表面上の想定結合部位と相互作用していることが強く示唆された

13 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 13 低分子 IL-6/IL-6 受容体間相互作用を制御する代表的化合物の STAT3 リン酸化阻害作用 ( ヒト肝臓系細胞株 Hep3B 細胞 ) STAT3 phosphorylation (% of control) IC 50 : μm x1/33 IC 50 : 0.86 μm x5 IC 50 : 4.3μM Concentration (μm) Tocilizumab HM003 TT002 代表的化合物の一つである HM003( ( 分子量約 590) ) は tocilizumab の約 1/33のpotency で IL-6 刺激時の STAT3 リン酸化 ( ヒト肝臓系細胞株 Hep3B 細胞 ;SureFire 法 ) を阻害した 備考備考 独立行政法人科学技術振興機構 (JST) ( の研究成果展開研究成果展開事業 (A-STE) 採択課題 低分子 IL-6 阻害薬 (IL-6/IL-6 ( 受容体間相互作用制御薬 ) の実用化研究 におけるにおける研究成果

14 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 14 I 制御薬を効率的に最適化するための戦略的評価システム ( 一例 ) 標的蛋白質とその相手方蛋白質 標的蛋白質に対する 標的蛋白質が関与する ( 上流 ) との結合に対する作用の評価 結合能の評価 シグナルに対する作用の評価 (SR, AlphaScreen, etc.) (SR, etc.) (SureFire, etc., cell-based) ヒット化合物の同定 / バリデーション 標的蛋白質との相互作用に関する詳細解析 (NMR, ITC, etc.) 細胞機能等に対する (phenotypic) 作用 ( 含細胞毒性 ) 選択性に関する検討 ( 蛋白質レベル 細胞レベル ) 共結晶化検討 (X 線結晶構造解析 ) ヒット又はリード化合物 ( ぺプチド ) の包括的評価 In vivo 薬効評価 In vitro 及び in vivo eadmet 化合物 ( ペプチド ) の合成及び評価のサイクルリード化合物 ( ペプチド ) の最適化 特に 注意深い first line 評価による質の高いヒット化合物の同定及びバリデーションが重要

15 様々な創薬標的に対する多面的アプローチ 酵素 受容体 ( 蛋白質以外のリガンド ) など 転写因子 / 転写調節因子 エピ ジェネティック因子など Extracellular Intracellular Non-I 第 87 回日本生化学会大会 ( 平成 26 年 10 月 17 日 ) 15 Target selection I 受容体 - 蛋白質リガンド 酵素 - 活性修飾分子 低分子の利点 : CNS 移行性の高い低分子で CNSの I 標的を狙える 外用剤への配合が容易など サイトカイン / 成長因子 接着分子 ( 免疫チェックポイント分子を含む ) など サイトカイン / 成長因子 接着分子 ( 免疫チェックポイント分子を含む ) Antibody-drug conjugate (ADC) 的応用 創薬の研究開発における課題 Antagonist 標的分子へのアプローチ効率の低下 研究開発の生産性の低下 など Agonist 今後へ向けてのメッセージ サイトカイン / 成長因子 接着分子 ( 免疫チェックポイント分子を含む ) など 多くの標的分子への効率的なアプローチ 画期的新薬数の増大による生産性の向上

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1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 と ある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質 ポドプラニン やマムシ毒 ロドサイチン が結合すると 血小板が活性化され 血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が 参考資料配布 2014 年 11 月 10 日 独立行政法人理化学研究所 国立大学法人東北大学 血小板上の受容体 CLEC-2 は糖鎖とペプチド鎖の両方を認識 - マムシ毒は糖鎖に依存せず受容体と結合 - 本研究成果のポイント レクチンは糖鎖とのみ結合する というこれまでの考え方を覆す CLEC-2 受容体は同じ領域でマムシ毒とがんに関わる糖タンパク質に結合 糖鎖を模倣したペプチド性薬剤の設計への応用に期待

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