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けいざぶろうきちや
4 years ago
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 22(2008) 62. IL-15/IL-15Rα 複合体の構造生物学的研究池水信二 Key words: サイトカイン, 受容体, 分子認識機構, 結晶構造解析, 免疫熊本大学大学院医学薬学研究部分子機能薬学講座緒言免疫応答を司る主要な細胞である T 細胞は, サイトカインと呼ばれる蛋白質により制御されている. インターロイキン (IL)-15 は, メモリー T 細胞の維持活性化, ナユラルキラー (NK) 細胞の分化などにおいて重要なはたらきをしているサイトカインである 1,2).IL-15 は 114 アミノ酸からなる糖蛋白質で, 抗原提示細胞などで発現している.IL-15 受容体 (R) は,IL-2R と共有される β(rβ) および γ 鎖, 特異的な IL-15Rα の3 種類のサブユニットから構成される.γ 鎖は,IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 および IL-21 の受容体として共有されることから共通 γ 鎖 (γc) と呼ばれる 1,2).IL-15 と IL-2 は,Rβ と γc を共有することから,T 細胞の増殖活性化などの機能を共有する.IL-2R の3 種類のサブユニット α, β, γc は活性化 T 細胞上に発現するのに対して,IL-15 の系では抗原提示細胞上に発現している IL-15Rα が IL-15 と結合し,Rβ と γc を発現している T 細胞に IL-15 を提示する trans-presentation により免疫応答を誘導する 1-4). また,IL-15 は関節リウマチ患者の患部で異常発現しており,IL-15 と IL-15Rα の結合を阻害すると炎症が沈静化する. そのため,IL-15 は抗リウマチ薬開発のターゲットとして研究されていたが,IL-15 の構造は未知であり,IL-15 と IL-15Rα の認識機構については知見が得られていなかった. そこで, IL-15/IL-15Rα 複合体の構造解析を行い,IL-15 と IL-15Rα の認識機構の解明を計画した. 方法結果および考察 1.IL-15/IL-15Rα 複合体結晶の調製および構造解析 IL-15Rα の細胞外領域 (1-102 アミノ酸残基 ) と IL-15 をチオレドキシン融合蛋白質として大腸菌を用いて発現させた後, 精製した. 両蛋白質を混ぜた後, ゲルろ過により複合体として精製した. 更に, エンテロキナーゼ処理によりチオレドキシンタグを切除した後, ゲルろ過により IL-15/IL-15Rα 複合体を精製した. この様に調製した IL-15/IL-15Rα 複合体を用いて, 結晶化を行った. その後, 高エネルギー加速器研究機構の放射光実験施設 PF-AR のビームライン NW-12A において回折実験を行い,1.85Å 分解能までのデータを収集した. さらに, 白金誘導体結晶の調製を行い, 同ビームラインにおいて 2.9 Å 分解能までのデータを得た. これらのデータを用いて,IL-15/IL-15Rα 複合体の結晶構造解析を 1.85Å 分解能で行った 5). 構造解析の結果, 非対称単位中に IL-15 と IL-15Rα が2 分子ずつ含まれていることが分かった ( 図 1). 1

2 図 1. IL-15/IL-15Rα 複合体の結晶構造. (A) 非対称単位中の構造.(B) (A) を左から見たもの. 2.IL-15 の構造 IL-15 は,4つのヘリックスが up-up-down-down トポロジーをもつ. データベース Dali 6) を用いた類似構造検索の結果, IL-2(PDB アクセスコード :3ink) と最も構造が似ており,98 アミノ酸残基の Cα 原子間の根平均二乗偏差 (RMSD) が 2.7Å であることが分かった.IL-15 と IL-2 の構造を基にしたアミノ酸配列の一致度は 20.2% であり, 類似性は 39.5% であった.IL-15 と IL-2 は, ヘリックス A, C 及び D で最も構造が良く似ており, これらの領域は IL-2 シグナリング複合体の結晶構造 7,8) において,IL-2 が共通の受容体である Rβ および γc と結合している領域である. 一方,AB-ループ,CD-ループ, およびヘリックス B の構造は異なっている. この領域は IL-15 または IL-2 と各々の α 鎖との結合領域であることから, 構造の違いが α 鎖との結合特異性に影響していると考えられる. 3.IL-15Rα の構造 IL-15Rα の SUSHI ドメイン (1-65 アミノ酸残基 ) の構造は,NMR 法により解析された 9). しかしながら,IL-15Rα SUSHI ドメインの C 末端側 20 アミノ酸残基を含むコンストラクトが IL-15 に対する親和性を増す 10) ことから, 我々はアミノ酸残基を含むコンストラクトを構造解析に用いた. 構造解析の結果,IL-15Rα の細胞ガイドメインは,SUSHI ドメインの後, 一巻きの α-ヘリックス, 続いてランダムな構造のリンカー領域をもつことが分かった.IL-2Rα には SUSHI ドメインが2つあり,2 本の β 鎖を交換した構造をしているが,IL-15Rα は SUSHI ドメインが1つだけであり,IL-2Rα で見られた様な構造はとらない.IL-15Rα と IL-2Rα のリガンド結合 SUSHI ドメインを比較すると, 交換された β 鎖の以外の領域の RMSD が 37 アミノ酸残基で 1.65 Å とよく一致していた. 特に CC および C D ループ領域には β-turn が2つあり, この2つ目の β-turn は IL-15 と IL-2 の両方の系において結合領域の中心に位置し, 類似の結合様式をもつ. 更に, この β-turn の2アミノ酸残基前には Arg(IL-15 では 35 番目 ) があり, このアミノ酸は IL-2 中にも保存されており, リガンドとの結合において重要な役割を担っている.IL-15Rα の SUSHI ドメインには, ジスルフィド結合が2 組あり, これらは IL-2Rα でも保存されている.IL-2Rα には, さらにもう一組 (Cys28-Cys59) のジスルフィド結合があり,IL-15Rα よりも安定な構造をしていると思われる. 4.IL-15 と IL-15Rα の認識機構 IL-15 と IL-15Rα は, 約 10Å * 25Å の細長い領域を介して相互作用し,1,214-1,224Å 2 の結合領域を介して形状の相補性の高い複合体を形成する (SC 値が )( 図 2 A). この IL-15 と IL-15Rα の結合領域は, 上部 ( 図 2 B(i)), コア ( 図 2 B(ii)) および下部 ( 図 2 B(iii)) の3 領域に分けられる. コア領域の中心部は,IL-15Rα の C D-ループの Arg35, Ala37 および Gly38 により形成された凸型領域が,IL-15 にある凹型結合面にはまり込む様に結合している ( 図 2 B(ii)). IL-15Rα の Arg35 は,IL-15 の Glu46 と塩橋を形成している.IL-15 の Tyr26 の側鎖は,IL-15Rα の Arg35 の主鎖のカルボニルと水素結合を形成している. さらに, この Tyr26 は塩橋を形成している IL-15Rα の Arg35 および IL-15 の Glu46 の 2

3 側鎖がスタックする様に相互作用している. これらの IL-15/IL-15Rα の結合様式は,IL-2/IL-2Rα 複合体においても見られる. コア領域は,IL-15 の AB-loop 上の Asp22 とヘリックス B 上の Glu53 と IL-15Rα の C ストランド上の Arg24 および Arg26 と E ストランド上の Ser40 と Leu42 から形成される上部領域 ( 図 2 B(i)) と,IL-15 の CD-loop 上の Glu87 および Glu90 と,IL-15Rα の C ストランドの Lys34 と短いヘリックスにある Pro67 と His71 から形成される下部結合領域 ( 図 2 B(iii)) に挟まれている. 上部領域には,IL-15 の Glu53 と IL-15Rα の Arg36 から形成される塩橋があるが, この塩橋は IL-2/IL-2Rα 複合体中には見られない. また, 下部領域 IL-15Rα の Ile64 と Pro67 が IL-15 の Glu90 などと疎水相互作用を, また IL-15Rα の His71 が Glu87 と水素結合を形成している. この領域は,IL-2/IL-2Rα 複合体中にはない. IL-15/IL-15Rα 複合体の全体構造は IL-2/IL-2Rα 複合体と似ており,RMSD 値は 126 アミノ酸残基で 1.96 Å である. 負に荷電した IL-15 の結合面と正に荷電した IL-15Rα が静電相互作用により kd 値が約 10pM という非常に強い結合親和力を示すことが, 本構造解析により明らかになった. また,IL-15 と IL-15Rα の結合領域には複数の水分子が存在し, これらが水素結合ネットワークを形成することにより安定な複合体を形成することが分かった. この結合様式は, 結合親和力が強いことで知られる barnase/barstar 複合体中においても見られる 11,12). 図 2. IL-15 と IL-15Rα の認識機構. (A) IL-15/IL-15Rα 複合体の構造. (B) (i) 上部結合領域. (ii) コア結合領域.(iii) 下部結合領域. 5.IL-15 のシグナル複合体 IL-2 のシグナル伝達複合体である IL-2/IL-2Rα/Rβ/γc 複合体の構造は,Stanford 大学の Garcia らにより既に明らかにされた 6). この構造中の IL-2 に今回解析した IL-15/IL-15Rα 複合体の IL-15 を重ね合わせることにより,IL-15/ IL-15Rα/Rβ/γc 複合体のモデルを作成した ( 図 3). このモデル中の IL-15Rα の C 末端領域は,Rβ および γc と反対方向に伸びており,IL-15Rα が抗原提示細胞上で発現した IL-15Rα が IL-15 と結合した後,Rβ および γc を発現している T 細胞に IL-15 を提示する trans-presentation を行うのに適した構造をしている. 3

図 3. IL-15 のシグナル伝達複合体モデル. このモデルは, 抗原提示細胞上の IL-15Rα が IL-15 と結合し,Rβ および γc を発現している T 細胞に IL-15 を提示する transpresentation に適した構造をしている. おわりに IL-15 は, 免疫の調節において重要なはたらきをしており, 様々な自己免疫疾患と深く関わっている.

4 図 3. IL-15 のシグナル伝達複合体モデル. このモデルは, 抗原提示細胞上の IL-15Rα が IL-15 と結合し,Rβ および γc を発現している T 細胞に IL-15 を提示する transpresentation に適した構造をしている. おわりに IL-15 は, 免疫の調節において重要なはたらきをしており, 様々な自己免疫疾患と深く関わっている. 関節リウマチ患者の患部において IL-15 は異常発現しており,IL-15 と特異的受容体 IL-15Rα の結合を阻害すると炎症が抑制される. 我々は, 本研究により IL-15/IL-15Rα 複合体の構造を解析し,IL-15 と IL-15Rα の認識機構を解明した. さらに IL-15/IL-15Rα 複合体が trans-presentation に適した構造をしていることを明らかにした. 本研究により解明された認識機構により,IL-15Rα の凸型の結合面が,IL-15 の凹型の結合面に形状および電荷の相補性良く結合することが明らかになった.IL-15 のこの領域は, 中心に疎水的な部位が, 四方に電荷又は極性をもったアミノ酸が配置しており, 創薬の対象として適している. この知見は IL-15 を標的とした炎症性疾患の創薬の手掛りとなることが期待される. 本研究の共同研究者は, 熊本大学大学院医学薬学研究部機能分子構造解析学分野の池鯉鮒麻美, 林千陽, 中村照也, 山縣ゆり子, 熊本大学大学院医学薬学研究部遺伝子機能応用学分野の首藤剛, 甲斐広文, 東京大学大学院薬学系研究科の藤間祥子, オックスフォード大学の Simon Davis である. 本研究の遂行にあたり, 研究費を御支援頂きました上原記念生命科学財団に深く感謝する. 4

5 文献 1) Waldmann, T. A. : The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nat. Rev. Immunol., 6: , ) Ma, A., Koka, R. & Burkett, P. : Diverse functions of IL-2, IL-15, and IL-7 in lymphoid homeostasis. Annu. Rev. Immunol., 24: , ) Lodolce, J. P., Burkett, P. R., Boone, D. L., Chien, M. & Ma, A. : T Cell independent Interleukin 15Rα Signals Are Required for Bystander Proliferation. J. Exp. Med., 194: , ) Dubois, S., Mariner, J., Waldmann, T. A. & Tagaya, Y. : IL-15Rα recycles and presents IL-15 In trans to neighboring cells. Immunity, 17: , ) Chirifu, M., Hayashi, C., Nakamura, T., Toma, S., Shuto, T., Kai, H., Yamagata, Y., Davis, S. J. & Ikemizu, S. : Crystal structure of the IL-15 - IL-15Rα complex, a cytokine-receptor unit presented in trans. Nat. Immunol., 8: , ) Holm, L. & Sander, C. : Dali: a network tool for protein structure comparison. Trends Biochem. Sci., 20: , ) Wang, X., Rickert, M. & Garcia, K. C. : Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with it s α, β, and γc receptors. Science, 310: , ) Stauber, D. J., Bebler, E. W., Horton, P. A., Smith, K. A. & Wilson, I. A. : Crystal structure of the IL-2 signaling complex: paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103: , ) Lorenzen, I., Dingley, A. J., Jacques, Y. & Grotzinger, J. : The structure of the interleukin-15 α receptor and its implications for ligand binding. J. Biol. Chem., 281: , ) Wei, X. Q., Orchardson, M., Gracie, J. A., Leung, B. P., Gao, B. m., Guan, H., Niedbala, W., Paterson, G. K., McInnes, I. B. & Liew, F. Y. : The Sushi domain of soluble IL-15 receptor α is essential for binding IL-15 and inhibiting inflammatory and allogenic responses in vitro and in vivo. J. Immunol., 167: , ) Buckle, A. M., Schreiber, G. & Fersht, A. R. : Protein-protein recognition: crystal structural analysis of a barnase-barstar complex at 2.0-Å resolution. Biochemistry, 33: , ) Schreiber, G. & Fersht, A. R. : Rapid, electrostatically assisted association of proteins. Nat. Struct. Biol., 3: ,

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が参考資料配布 2014 年 11 月 10 日独立行政法人理化学研究所国立大学法人東北大学血小板上の受容体 CLEC-2 は糖鎖とペプチド鎖の両方を認識 - マムシ毒は糖鎖に依存せず受容体と結合 - 本研究成果のポイントレクチンは糖鎖とのみ結合するというこれまでの考え方を覆す CLEC-2 受容体は同じ領域でマムシ毒とがんに関わる糖タンパク質に結合糖鎖を模倣したペプチド性薬剤の設計への応用に期待