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へいぞうもちやま
5 years ago
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1 Coffea liberica var. dewevrei における DAPI および PI を用いた化学量論的不均衡を起った核 DNA 含量の推定フローサイトメトリを用いて Coffea 木 (Coffea sp.) のゲノムサイズを推定した 2 種類の蛍光染色 (DAPI(4',6- ジアミジノ -2- フェニリンドール ) および PI( ヨウ化プロピジウム )) を用いて核 DNA を染色した Petunia (P-PI および P-DAPI) の植物対照と Coffea 木の細胞核の蛍光発光を比較したもし化学量論的不均衡がなかったなら細胞核の対照および細胞核の標準の蛍光発光の比率はゲノムサイズに比例する予想される PI および DAPI を用いて Coffea liberica var. dewevrei における木内の変異の対象に対して蛍光発光の標準の比率を調査した Coffea 木のピークと Petunia のピークを比較する時木内の変異は比例の欠如が見られた種内のゲノムサイズの変異は蛍光の比率の対象に対して蛍光の比率の標準を明らかにしてなかった両方の染色とも蛍光の比率の対象に対して蛍光の比率の標準に比例の欠如を違った PI の方は収束点の回帰線があって木内では誤差がなかったところが DAPI の方は収束点の回帰線がなかった正確なゲノムサイズを推定するときは PI の方が得られた近接性および接合様式について議論を進めていく背景植物の核 DNA 含量は1C-value( 半数体のゲノム ) または2C-value( 二倍体ゲノム ) で表される Bennet and Leitch (1995) により被子植物における 1C-value は 0.2 pg (Arabidopisis thaliana) から pg(fritilaria assyrica) である種内の不変性な DNA 含量は基準の染色体数および種類を表す (Bennent and Smith (1976), Furuta ら (1978) 種内の変異における DNA 含量を調査することとなる原因は (1) 方法の問題 (Greilluber and Ebert, 1994)(2)Zea may spp. Mays のようなヘテロクロマチンの変更 (Rayburn ら,1985)(3)DNA を染色する機能の変異 (Darzynkiewics ら, 1984; Evenson ら,1986; Darzynkiewics, 1990; Biradar and Rayburn, 1994). Coffea 属の Coffea 亜属 (Rubiaceace) は熱帯地域のアフリカとマダガスカルの原産である約 80 野生種は多くが二倍体 (2n=22) であり C. arabica (2n=44) と違う種である (Louarn, 1992) DNA 含量の変異におけるアフリカの二倍体は 0.98 から 1.78pg である (Cros ら 1995). 最近報告された研究では細胞核とシトソル間の相互作用と化学量論的不均衡が核 DNA 含量の推定を狂わせる原因である (Noirot ら,2000; Price ら,2000) ヤムの細胞質成分に影響する Petunia の蛍光発光は最大 20% バイアス補正した Coffea の葉では細胞質成分の影響がなく種内の Coffea は異なる細胞質成分の原因の変異が DNA 含量を変わる本研究では異なる染色液におよぼす種内の DNA 含量を測定する方法植物試料は Coffea liberica spp dewevrei と植物標準対照として Petunia hybrid(2c=2.85pg; Marie and Brown, 1993) である植物試料は人工気象 (24 0 C 昼 / 18 0 C 夜, 70% 湿度 ) のグリンハウスに栽培していたチョッピンッグ法 (Galbraith ら, 1983) により Dolozel ら (1989) の Lysis バッファー (0.5% triton X-100, ph=8 を用い細胞核を抽出した葉の重さは Coffea が 400mg ml -1, Petunia が 200 mg ml -1 50μM を通してフィルターし RNaseA(5unit ml -1 ) を加え DAPI 用か PI 用の細胞核液を分けた PI 濃度の 333μg ml -1 および DAPI 濃度の 10μg ml -1 は細胞核を約 3 分染色した PI の方は FACScan Cytometer(585nm±22nm を発光した Argon Laser の 488nm, 557V, を用いて細胞核の量を測定した DAPI の方は FACSVoltage Cytometer(Argon Laser, 345nm の励起蛍光 455nm の発光蛍光 ) を用いて細胞核の量を測定したヒストグラムは 1024 チャーネルを検出しやく細胞核を抽出した Petunia を用いてアナログからディジタルに変更した Zero Offset を調整した GAIN は変わらない

3 結果 PI を用いる異なる木内では Coffea のピークと Petunia のピークの比率における変異があるだが葉の間には変異がなかった ( 表 1) Coffea のピークと Petunia のピークの割合に基づいて DNA 含量の予想を推定するのができた木内の線形回帰評を示したが原点を通らずピークの勾配とは直線で異なったさらに P PI の値では C-PI の値とほぼ同じく両方の比率も変異がなかった ( 図 1) この状態では R-PI の木内の変異がないためゲノムサイズの変異がなかったと考える実際に原点を交差しない直線のため Coffea liberica var. dewevrei の細胞質成分の及ぼす細胞核の蛍光発光の影響は Coffea liberica var. dewevrei と Petunia が異なったそれから異なる交差は Coffea の細胞質成分を及ぼす両方の細胞核の影響が異なったもし線形回帰は点で交わることなら R-PI の変異がなくなり交差と勾配は負数と線形の関係を予想する Y=-894.8x の式を用いて座標 (C-PI=450.3; P-PI=894.8) を推定し化学量論的不均衡を起こさずに R-PI の比率も計算出来る ( 表 2 図 2) さらに Coffea liberica var. dewevrei の DNA 含量は PI を用いて 2C=1.434 を推定できた ANOVA のモデルを用いて木内では 44.6% の変異を表示され R-DAPI を計算した PI と比較すると Coffea の細胞質成分を及ぼす Petunia のピーク (P-DAPI) がなかった線形回帰では C-DAPI と P-DAPI を計算した PI と比較すると直線は平行線を表し値が違ったそらに Petunia のピークを通じない直線のため R-DAPI では木内の変異がなかった結論化学量論的不均衡は Feulgen Cytophotometric (Greilhuber., 1988) and flow cytometry methods (Noriot et al., 2000) を用いて DNA 含量を推定したとき報告したピークの位置はサイトメトリ機械の設定を変わらず推定した DNA 含量は変わらないと考えるさらにサンプル対標準対照の比率は変わらないことと考えるだが Mithramycine (Galbraith et al., 1983) または PI (barre et al, 1996) の染色液を用いると DNA 含量はほぼ変わらなかった PI(50μgmL-1) で Brassica campestris の DNA 含量は 0.95 から 1.27 pg と推定し 2 倍の PI の濃度を使うと DNA 含量が減った (1.03pg 0.02) (Arumuganathan and Early, 1991) 前の研究結果では PI で Coffea 種の DNA 含量は偏誤差のピーク蛍光発光を報告しました (Barre et al, 1996) 異なる染色液の濃度により安定させる DNA 含量の推定はサンプルと標準対照の染色性が違うそれからサンプルのピークの位置は絶対に標準対照とともに割合が合わない化学量論的不均衡の原因は抽出した細胞核の中に含まれた細胞質成分の及ぼす DNA 蛍光発光の影響と考えるゲノムサイズの偏り誤差は約 20% と報告した (Noirot et al., 2000) 異なる蛍光染料により DNA の接合部位および接合モードにおける蛍光発光の DNA 含量も違う Godelle et al (1993) により Binding-site Number differences (BSND) に基づく EthidiumBromide の推定と Hoecst(AT- 特徴 ) の推定または Mithramycine(GC- 特徴 ) の推定が違うと報告したそれにしても BSND は塩基構成によって決まりサンプルと標準対照の蛍光発光における直線の平行性と収束を説明できなかった染色染料により接合部位モードは AT 接合 (DAPI,Hoechst) または GC- 接合 (Mithramycine) に対して蛍光染料 (PI または EthidiumBromide) が違う接合部位モードは AT-/GC- 接合とともに異なる AT 対 GC によりゲノムサイズの推定を比較できない (Dolozel et al, 1998) それからヘテロクロマチン濃縮により染色染料の染色性は違う Feulgen Densitometry の結果を通じて DAPI または PI の推定結果ではほぼ同じゲノムサイズの推定と報告した (Michaelson et al, 1991; Dolozel et al, 1998)

4 NASA/ アメリカガン協会高度フローサイトメトリプロジェクト -II. での ph および DAPI の濃度が DNA/DAPI の蛍光発光 DNA/DAPI および細胞核量のデュアルパラメトリック解析および電子核容積 (ENV) に及ぼす影響本研究では ph および DAPI の濃度に及ぼすデュアルパラメトリック解析により DNA/DAPI の蛍光発光を分布したヒストグラムを行う NASA/American Cancer Society (ACS) を用いて細胞組織培養と凍結した人間の固形腫瘍細胞から異なる DAPI の濃度と ph レベルの Nuclear Isolation Media を用い細胞核を抽出した PI/ 低張クエン酸を染色したサンプルは Coulter XL Flow Cytometry を用いてサンプルを推定した 1-3μg/ml の DAPI 濃度と ph 6.0 は二倍体および四倍体の個体群を一番強度が高い推定数同時に ENV と DAPI/DNA 蛍光発光の条件を用いて DNA 解析しか使わない方が亜個体群を明らかにした異数性の個体群における細胞核を推定するため特に二倍体と四倍体の個体群において 1-3μg/ml の DAPI 濃度と ph 6.0 は最適な方法である背景低い異数性レベル (DNA index<1.1) を検出するため最近のフローサイトメトリを利用できる RATCOM とともに NASA/ アメリカガン会によって開発したフローサイトメトリは電子核容積を用いる Unique Triangular Flow cell という技術を利用した本研究ではその DI の 1.02 を用いて個体群解析するため機械を調整してきた ph および蛍光濃度に及ぼす CV( 変動係数 ) の G0/G1 ピークの影響を研究した方法試料は RPMI164(10% fetal bovine serum) を用いマウスの P388/R84 の細胞を栽培したそれから Dulbeccos modified Eagle Mdeium (DMEM) で短時間の栽培を持つ MAT-BI(Murine Cell Line) を栽培した人間の固形腫瘍細胞 ( 乳がん細胞 ) は Miami 大学の病理学科からもらった標準対照は TRBC( ニジマス赤血球 ) を利用した異なる染色溶液の条件 : 1. DAPI (1μg/ml) + クエン酸 (1% w/v) ph Level (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0) + NP-40 (0.1% v/v) 2. DAPI (0.1, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10 μg/ml) + ph 6.0 (1% クエン酸 ) + NP-40 (0.1% v/v) 3. PI (1,5,10,25,50) + クエン酸 (1% w/v) または NaOH (1 M) ph (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0) + NP-40 (0.1% v/v) 遠心分離 (600xg, 5 分 ) により細胞を収集し 1xPBS( リン酸緩衝生理食塩水 ) を洗浄し DAPI/PI を染色した NASA/ACS Flowcytometer を用いて DAPI の染色した細胞を推定し Coulter XL Cytometry を用いて PI を染色した細胞を推定した Modifit 5.1 で細胞周期の DNA ヒストグラムを解析し WinMDI 2.7 で多重パラメーターを解析した

5 結果解析したデータにより高い増殖性の P388/R84 と低い増殖性の MAT-B1 を示す ( 図 1) 両方とも DAPI を染色し低い CV( %) の G0/G1 ピークを検出でき ph6 で最小細胞残屑を表す ph8 で細胞残屑を高くなり蛍光減少を見られる P388/R84 では ph7 または 8 で染色された細胞の G2/M のピークがなくなり細胞残屑も増加した CV と Mean Fluorescence Channel (MFC) の G0/G1 ピークが DAPI 濃度に及ぼす影響が主要な原因である ( 図 2) TBRC の CV は DAPI 濃度 (1 から 10μg/ml) によってあまり変化がなかった ( 図 2) P388 R84 と MAT-B1 と乳がんの細胞により DAPI 濃度は 1-3μg/ml が一番適当 CV( それぞれの 3.1%, 2.3%, 1.9%) と考える乳がん細胞では DAPI 濃度と CV が増加すると異数性の細胞は見られなくなってきた DAPI(10μg/ml) で染色した乳がん細胞のとき DAPI-Free クエン酸に再混合し CV とピークの品質が高める異数性の細胞を検出する時乳がん細胞は PI( クエン酸法 ) と DAPI(1μg/ml, ph6) を染色した ( 図 3) PI( クエン酸法 :ph4-8, 10-75μg/ml) で CV の変化はなかった一方 DAPI で染色した細胞は PI の方に対して CV が 3 4 倍狭くなる両方の染色液では乳がん細胞がほぼおなじピークを表し主要な異数性個体群と考える PI で染色した細胞は 2 倍体の異数性の個体群が区別出来なかった異数性のピークは図 3.B と図 3.C を表し DI は 0.83 と 0.89 である ENV の MAT1-B と P388/R84 が ph(5-7) と DAPI 濃度に及ぼす影響を表す ( 図 4) ph5 から 6 を増加するとき ENV のピークが広がった ph6 で染色した細胞は ENV の分布を区別でき十分に形を作れている両方の細胞では DAPI 濃度 (1-10μ g/ml) を増加するとき ENC のピークチャネルが減少した本研究では DAPI 濃度 (1-3μg/ml) と ph6 においてデュアルパラメトリック解析により人間のガン細胞が適当に使えることを証明した結論 DAPI はフローサイトメトリにおいて DNA 含量および細胞周期を推定するため一般的な染色溶液が用いられている DNA の AT 配列に接合する DAPI は安定した複合体結合である DAPI/DNA の蛍光発光が AT- 塩基含量クロマチン濃縮存在アニオン性溶液に及ぼす影響と報告したまたは細胞種類により DAPI/DNA の蛍光発光を異なることと報告した本研究では DAP 濃度の 1-3 μg/ml と ph を用いて G0/G1 ピークの品質が一番良かった DAPI 濃度が 3μ/ml 以上では DAPI の蛍光強度を減少し過飽和を起こったと考える発光強度が減少したとき DAPI-free medium によって戻せるそれから DAPI の染色の ph は影響が強いと考える ph6 の染色条件は一番適当な条件である細胞残屑を減少し CV が小さく G2/M のピークを見られる状態と言う影響である本研究では染色準備が必要と考え 5 分以内が一番良い結果が見られ最大保存期間は 72 時間であり遮光で 4 0 C に保存する必要がある

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Microsoft Word - zemi2.docx DAPI のフローサイトメトリにより維管束植物の乾燥組織を確実な DNA 倍数性を推定近年フローサイトメトリによる DNA 倍数性の推定には生葉しか使われていないこれは生物系統学集団生物学生態学において FCM の研究を制限している乾燥法は植物学における試料保存技術を進めた本研究では FCM の研究をするため乾燥させた維管束植物を利用する可能を検討した標準 DAPI 法で風乾した60の種の検討をし