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1 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 カラムと Agilent HPLC による既存アミノ酸分析法の改良アプリケーション食品医薬品著者 John W Henderson Jr Anne Brooks Agilent Technologies, Inc. 5 Centerville Rd Wilmington, DE 19 USA はじめに HPLC カラムや分析機器の性能改善に伴い既存の HPLC メソッドを改良することができます HP 9 シリーズ HPLC システムで開発された実証済みのオルトフタルアルデヒド /9 フルオレニルメチルクロロギ酸 (OPA/FMOC) 誘導体化アミノ酸分析メソッドはその後 Agilent 1 シリーズ HPLC システム用に更新され Agilent シリーズ SL および Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 固定相カラムをさらに活用するように進化しました [1-5] このプロトコルが以前のプロトコルより優れている点は次のとおりです最初に溶出するつのアミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸の保持が強くなります使用されるカラム構成に応じて隣接して溶出するいくつかのアミノ酸ペアの分解能が向上します 3 種類の粒子径複数のカラム長さや内径などの種類のカラム構成により分析者は自身の仕様と制約 ( たとえば使用可能な Agilent HPLC モデル希望するスループットまたは希望する分解能 ) に合わせて分離をカスタマイズできますクォータナリポンプのオプション当然以前のプロトコルの利点 ( 特に自動オンライン OPA/FMOC 誘導体化 ) は維持されています

2 クロマトグラムはカラムまたはメソッドごとに提示されますこれらは 3 つのカテゴリに分かれます高分解能を提供する従来型 5 µm 粒子径カラム 5 および 1. µm 粒子径カラム ( ラピッドレゾリューション ) の高分解能とスピードを組み合わせた実用的な 3.5 µm 粒子径カラム ( ラピッドレゾリューションハイスループットの ) 優れた分解能を提供するスループットが最高の 1. µm 粒子径カラム.1 15 mm 3.5 µm ラピッドレゾリューションメソッドはカラム P/N 79916AA-57 を使用したオリジナルの AminoQuant メソッドの置き換えメソッドとして推奨されますすべてのメソッドは以前の Agilent メソッドに基づいて同じ化学薬品と OPA/FMOC 誘導体化を使用します [1-6] これらのメソッド間の違いは移動相グラジエントプログラムと流路ですこのつのパラメータはカラムサイズと LC 機器のモデルに応じて最適化されます個のメソッドは 5 mm カラムと 1. µm 粒子を使用した最低 1.5 の R s 係数のハイスループット分析 ( 分未満のサイクルタイム ) から 5 mm カラムと 5 µm 粒子を使用した分の高分解能メソッド ( すべてのピークペアで R s >) に及びますオプションとして粒子が 3.5 µm で長さが 15 mm のカラムまたは粒子が 1. µm で R s > の mm カラムを使用できます表 1 を参照してください使用できる LC メソッドの選択は LC モデルと構成によって決まります Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 メソッドは次の機器用に開発されましたクォータナリポンプを搭載した Agilent 1 バイナリポンプを搭載した Agilent 1 バイナリポンプ ( bar) を搭載した Agilent バイナリポンプ (6 bar) を搭載した Agilent 種類のメソッドはそれぞれのカラムサイズと特定の LC モジュールにより独自のものになっています他のメソッドパラメータの大部分は同じです.1 15 mm 3.5 µm カラムメソッドの分析時間は AminoQuant メソッドに匹敵しカラムサイズはほぼ同じであるため.1 15 mm カラムメソッドは既存の Amino Quant ユーザーに推奨される置き換えメソッドです実験 : 同様のメソッドパラメータ : 化学的前処理移動相 A: mm Na HPO : mm Na B O 7 ph.: 5 mm NaN 3 1 リットルの場合 : 約 97 mlの水に1. g の無水 Na HPO と3. g のNa B O 7 H O +3 mg NaN 3 を加えて溶かし濃塩酸で約 ph. 前後にしてから ph. になるまで1 M 程度の希塩酸液滴を添加し ph 調整後水で全容を 1 Lとしますなお NaN 3 は防腐剤として添加しており添加をしない場合もアミノ酸の分離に影響はありません表 1. さまざまな分離目標を満たす Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 カラム再平衡化を典型的な概算のメソッドカラム / 含む最小分離 ml 溶媒 / Agilent HPLC 番号メソッドカテゴリメソッド名部品番号分析時間係数分析 * 機器 1 従来型高分解能.6 5, 5 um 分. 6 or SL 3. 5, 5 µm カスタム分. or SL 3 ラピッドレゾリューション.6 15, 3.5 µm 分 or SL 3. 15, 3.5 µm 分 1 or SL , 3.5 µm 分 1 or SL 6 ラピッドレゾリューションハイスループット.6, 1. µm 分. SL 7.1, 1. µm 分. SL.6 5, 1. µm 分 SL , 1. µm 分 1.7 SL.1 5, 1. µm 分 SL * インジェクタプログラムとプレラン DAD オートバランス (. 分 ) および再平衡時間を含みます AminoQuant メソッドに推奨される置き換えメソッド SL は推奨される AminoQuant 置き換えメソッドに必要です

3 .5 μm の再生セルロース被膜 (Agilent P/N ) でろ過します移動相 B: アセトニトリル : メタノール : 水 (5:5: v: v: v) すべての移動相溶媒は HPLC クラスです移動相 A は B より速い速度で消費されるため B を 1 L ごとに A を L 作成すると便利です注入希釈剤 : ml ボトルに ml の移動相 A +. ml の濃 H 3 PO ºC で保管します.1 N HCl:. ml の濃 HCl (36 %) を一部水で満たした 5 ml のメスフラスコに添加します混合しマーク位置まで水を入れます溶液は拡張アミノ酸と内部標準原液を作成するためのものです ºC で保管します誘導体化試薬 : ホウ酸塩緩衝液 OPA および FMOC はアジレントによって提供される既成の溶液ですこれらは単純にコンテナからオートサンプラバイアルに移すだけですいくつかの注意点を次に示します OPA は酸化を防ぐために不活性ガスを充てんしたアンプルで出荷されます OPA は開封後約 7~ 日間有効です OPA の µl をマイクロバイアルインサートに移して名前と日付のラベルを付けキャップを閉めて冷蔵することをお勧めしますマイクロバイアルインサートに移してからは日以内に使い切ってくださいまたオートサンプラにセットしたマイクロバイアルは毎日交換してください FMOC は乾燥空気中で安定しますが湿度が高いと劣化します FMOC の µl をマイクロバイアルインサートに移して名前と日付のラベルを付けキャップを閉めて冷蔵することをお勧めしますマイクロバイアルインサートに移してからは日以内に使い切ってくださいまたオートサンプラにセットしたマイクロバイアルは毎日交換してくださいホウ酸塩緩衝液はバイアルインサートを使用せずに 1.5 ml オートサンプラバイアルに移すことができますこれは日ごとに交換しますアミノ酸標準試料の前処理アミノ酸標準試料の前処理は以前のアジレントの手順またはアプリケーションノートから変わっていません [ 5 6] 部品番号のリストについては最終ページの表 7 を参照してくださいアミノ酸標準試料 ( pmol/μl ~ 1 nmol/μl): 検量線用に 5 種類の濃度の 17 のアミノ酸の溶液をアジレントから入手できます P/N ~ の標準試料の各 1 ml アンプルを円錐形バイアルインサートに µl ずつ分けますキャップを閉めて ºCで冷蔵します拡張アミノ酸 (EAA) 原液 59.5 mg のアスパラギン 59. mg のヒドロキシプロリン mg のグルタミンおよび mg トリプトファンを計量して 5 ml のメスフラスコに入れます.1 N HCL で半分ほど満たし溶解するまで攪拌または超音波処理しますマーク位置まで水を入れ各アミノ酸の合計濃度が 1 nmol/μl になるようにします高感度 EAA 原液の場合はこの標準感度溶液を 5 ml 取り出し 5 ml の水で希釈します (1. nmol/μl) 拡張アミノ酸を含む溶液は室温では不安定です凍結して保存し強度が低下した場合は破棄してください内部標準 (ISTD) 原液一級アミノ酸については 5.5 mg のノルバリンを計量して 5 ml メスフラスコに入れます二級アミノ酸については.5 mg のサルコシンを計量して同じ 5 ml メスフラスコに入れます.1 N HCl で半分ほど満たし溶解するまで攪拌または超音波処理してからマーク位置まで水を入れて各アミノ酸 nmol/μl の最終濃度にします ( 標準感度 ) 高感度 ISTD 原液の場合は標準感度溶液を 5 ml 取り出し 5 ml の水で希釈します ºC で保管します検量線は実験のニーズに応じて ~ 5 種類の標準試料を使用して作成できます通常は pmol/μl 5 pmol/μl および 1 nmol/μl を標準感度分析の 3 ポイント検量線に使用します内部標準試料またはその他のアミノ酸 ( たとえば拡張アミノ酸 ) が添加される場合は次の表に従う必要があります表では UV 分析で一般に使用される標準感度濃度について説明します表 3 は一般に高感度蛍光分析で使用されます表. 標準感度較正用標準溶液最終 AA 溶液の濃度 (pmol/μl) ml の 1 nmol EAA を取得 5 ml 5 ml 5 ml 水で希釈 15 ml 5 ml 希釈した EAA 混合物質 5 ml ml 5 ml 5 ml の希釈済み EAA 混合物質を取得 5 ml 5 ml 5 ml nmol ISTD 溶液を添加 5 ml 5 ml 5 ml EAA-ISTD 混合物質 ml ml ml μl の EAA-ISTD 混合物質を取得 µl µl µl 添加 1 nmol AA 9 µl 添加 5 pmol AA 9 µl 添加 pmol AA 9 µl EAA および 5 pmol/μl ISTD 1 ml 1 ml 1 ml を含む最終 AA 溶液 3

4 表 3. 高感度較正用標準溶液個々のメソッドパラメータ LC ポンプ表を参照してくださいすべてのメソッドのその他のポンプパラメータは次のとおりです圧縮率 ( -6 bar) A: 35 B: 最小ストローク A B: μl 最終 AA 溶液の濃度 (pmol/μl) ml の 1. nmol EAA を取得 5 ml 5 ml 5 ml 水で希釈 15 ml 5 ml 希釈した EAA 混合物質 5 ml ml 5 ml 5 ml の希釈済み EAA 混合物質を取得 5 ml 5 ml 5 ml 1 nmol ISTD 溶液を添加 5 ml 5 ml 5 ml EAA-ISTD 混合物質 ml ml ml μl の EAA-ISTD 混合物質を取得 µl µl µl 添加 pmol AA 9 µl 添加 5 pmol AA 9 µl 添加 pmol AA 9 µl EAA および 5 pmol/μl ISTD 1 ml 1 ml 1 ml を含む最終 AA 溶液オートサンプラ (ALS): オンライン誘導体化オートサンプラのモデルに応じて自動オンライン誘導体化プログラムは若干異なります G1376C ウェルプレートオートサンプラ (WPALS) 注入プログラムあり : 1. ホウ酸塩バイアル (Agilent P/N ) から.5 µl 注入します. サンプルバイアルから 1. µl 注入します µl を洗浄ポートで 5 回混合します.. 分待ちます 5. OPA バイアル (Agilent P/N ) から.5 µl 注入します 6. デフォルトのスピードで. µl を洗浄ポートで回混合します 7. FMOC バイアル (Agilent P/N ) から. µl 注入します. デフォルトのスピードで. µl を洗浄ポートで回混合します 9. 注入希釈剤バイアルから 3 µl 注入します. µl を洗浄ポートで回混合します 11. 注入します 1..1 分待ちます 13. バルブをバイパスします表. 移動相グラジエントプログラム従来型高分解能メソッドグラジエント 5 µm.6 5 mm 3. 5 mm P/N P/N カスタム時間 ( 分 ) %B %B 終了終了流量 (ml/ 分 ) ラピッドレゾリューションメソッドグラジエント 3.5 µm.6 15 mm mm.1 15 mm P/N P/N P/N 時間 ( 分 ) %B %B %B 終了終了終了流量 (ml/ 分 ) ラピッドレゾリューションハイスループットメソッドグラジエント 1. µm mm.6 mm.1 mm P/N P/N 時間 ( 分 ) %B %B 終了終了流量 1.5. (ml/ 分 ) ラピッドレゾリューションハイスループットメソッドグラジエント 1. µm 5 mm.6 5 mm 3. 5 mm.1 5 mm P/N P/N P/N 時間 ( 分 ) %B %B %B 終了終了終了流量..5. (ml/ 分 )

5 G139A オートサンプラ (ALS) 注入プログラムあり : 1. ホウ酸塩バイアル (Agilent P/N ) から.5 µl 注入します. サンプルバイアルから 1. µl 注入します 3. 空気中で 3.5 µl をデフォルトのスピードで 5 回混合します.. 分待ちます 5. OPA バイアル (Agilent P/N ) から.5 µl 注入します 6. 空気中で. µl をデフォルトのスピードで回混合します 7. FMOC バイアル (Agilent P/N ) から. µl 注入します. デフォルトのスピードで. µl を回混合します 9. 注入希釈剤バイアルから 3 µl 注入します. 空気中で µl をデフォルトのスピードで回混合します 11. 注入します 1..1 分待ちます 13. バルブをバイパスします誘導体化試薬とサンプルのロケーションはハードウェアと ALS トレイ構成によって決まります G1367C と 56 ウェルプレートトレイ (G5-5) を使用した場合ロケーションは次のとおりでしたバイアル 1: ホウ酸塩緩衝液バイアル : OPA バイアル 3: FMOC バイアル : 注入希釈剤 P1-A-1: サンプルカラムコンパートメント (TCC) 左と右の温度は ºC に設定されます温度が ±. ºC 以内のときに分析を有効にします使用するヒートシンクについては表 5 を参照してくださいダイオードアレイ検出器 (DAD) 信号 A: 33 nm nm 帯域幅およびリファレンス波長 39 nm nm 帯域幅信号 B: 6 nm 16 nm 帯域幅およびリファレンス波長 3 nm nm 帯域幅信号 C: 33 nm nm 帯域幅およびリファレンス波長 39 nm nm 帯域幅リシンの溶出後とヒドロキシプロリンの溶出前に 6 nm 16 nm 帯域幅リファレンス波長 3 nm nm 帯域幅に切り替えるようにプログラムされています信号 C はピークと 1 の間の信号 A と B のタイムフレームを調べてから波長を切り替えるのに適した時点を選択することで決定されます切替時間が設定されてメソッドにプログラムされた場合信号 A と B はオプションになりますピーク幅設定は次のとおりですラピッドレゾリューションハイスループット (RRHT) 1. µm カラムメソッドの場合は >.1 分ラピッドレゾリューション (RR) 3.5 µm カラムメソッドの場合は >.3 分従来型高分解能 5 µm カラムメソッドの場合は >.3 分表 5. 流路仕様従来型高分解能メソッド (5 µm) ラピッドレゾリューションメソッド (3.5 µm) メソッド名.6 5 mm 3. 5 mm.6 15 mm mm.1 15 mm LC モデル 1 SL SL SL ポンプ G131A G1311A quat G131B G131B G131B ダンプナあり N/A ありありバイパススタティックミキサ G N/A G G バイパスパージバルブから G13-76 G ALS ( 緑色 5 mm) ( 緑色 5 mm) ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ALS G1367A G139A G1367C G1367C G1367C ニードルシート G ( 緑色 ) G ( 緑色 ) G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) ALS から G 熱交換器 ( 緑色 1 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) 熱交換器 G1316 A 3 µl G1316 A 3 µl G µl G µl G µl 熱交換器からカラムまたはガード ( 緑色 15 mm) ( 緑色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) オプションの個個個個個ガードカートリッジ内径.6 内径.1 内径.6 内径.1 内径.1 5

6 表 5. 流路仕様従来型高分解能メソッド (5 µm) ラピッドレゾリューションメソッド (3.5 µm) メソッド名.6 5 mm 3. 5 mm.6 15 mm mm.1 15 mm カラムカスタムポストカラムから N/A N/A N/A ユニオン ( mm 緑色 ) ( mm 緑色 ) ZDV ユニオンから N/A N/A N/A フローセル検出器 G1315B G1315D G1315C G1315C G1315C フローセル µl G µl G µl G µl G µl G ラピッドレゾリューションハイスループットメソッドラピッドレゾリューションハイスループットメソッド (1. μm mm) (1. μm 5 mm) メソッド名.6 mm, 1. µm.1 mm, 1. µm.6 5 mm, 1. µm 3. 5 mm, 1. µm.1 5 mm, 1. µm LC モデル SL SL SL SL SL ポンプ G131 B G131 B G131 B G131 B G131 B ダンプナありバイパスありバイパスバイパススタティックミキサ G バイパス G バイパスバイパスパージバルブから ALS ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ( 赤色 mm) ALS G1367C G1367C G1367C G1367C G1367C ニードルシート G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) G ( 赤色 ) ALS から熱交換器 ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) ( 赤色 5 mm) 熱交換器 G µl G µl G µl G µl G µl オプションのなしなしなしなしなしガードカートリッジカラム PN カラムから直接接続直接接続直接接続直接接続直接接続フローセル検出器 G1315C G1315C G1315C G1315C G1315C フローセル µl G µl G µl G µl G µl G カラムとガードカートリッジ Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 カラムと推奨されるガードカートリッジについては表 5 を参照してくださいガードカートリッジを収容するにはカートリッジハードウェアキット (P/N -91) が必要ですカートリッジは平衡化のためにカラムに接続する前に数ミリリットルの移動相 B で洗浄する必要があります 3. 5 mm 5 µm は本資料の印刷時点でのカスタムカラム構成ですが LC カスタムカラムショップ ( agilent.com/cag/lccustom_1page.asp?&rc at=lccolumns) で注文できます結果と考察 3 種類の粒子径 ( µm) 間での Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 固定相カラムのスケーラビリティにより多くの微調整されたメソッドに対応できます表 1 にまとめたように分析者は分析時間分離係数溶媒の使用状況または機器モデルに基づいてカラムまたはメソッドを選択できます 3 つの各カテゴリには固有のメソッドパラメータがあります特に重要なのは小容量カラムの移動相流路構成です異なるカラム内径と長さ間でのグラジエントメソッドのスケーリングは若干複雑ですこれは特に異なる流量によってグラジエントのディレイタイムが変化することが原因ですディレイタイムはグラジエントが組成ポイントからカラムヘッドまで移動するのにかかる時間です流量の他にディレイタイムはグラジエント組成ポイントとカラムヘッドの間の流路容積によって決まりますディレイボリュームは機器によって異なる場合がありますこのアプリケーションノートのすべてのクロマトグラムを得るのに使用した際の流路を表 5 に示しています 6

7 従来型 5 µm 高分解能メソッド最初のグループは従来型 5 µm 高分解能オプションですこのつのオプションは大量のサンプルまたは高分解能分析に理想的ですすべてのアミノ酸の分離係数は. より大きく圧力は bar 未満です 3. mm id ソルベントセーバオプションでは.6 mm id メソッドより 57% 少ない溶媒を使用します ( 図 1 を参照 ) 5 mm のカラム長さはラピッドレゾリューション 3.5 µm およびラピッドレゾリューションハイスループット 1. µm オプションに比べて分析時間が最長になることを意味します図 1 の最初の個のアミノ酸は OPA で誘導体化されます最後の 3 つのヒドロキシプロリンサルコシンおよびプロリンは FMOC で誘導体化されますリシン ( ピーク ) の溶出後ヒドロキシプロリン ( ピーク 1) の溶出前に OPA 誘導体を検出する33nm から FMOC 誘導体を検出する65 nm へ測定波長を変更しますラピッドレゾリューションメソッド番目のグループであるラピッドレゾリューションメソッドも分離係数はを超えますが分析時間は分から 5 分に短縮され溶媒使用量も削減されます 3.5 µm カラムは 5 µm カラムよりも効率が高いため同様により短いカラムと分析時間で高分解能も実現できます図で 3 つのカラムサイズを比較します mm 5 µm P/N Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 5 mm 5 µm 従来型高分解能オプション Rs= mm 5 µm P/N Rs= 図 1. 5 mm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 5 µm カラムを使用したアミノ酸分析.6 15 mm 3.5 µm P/N Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 15 mm 3.5 µm ラピッドレゾリューション (RR) オプション Rs= mm 3.5 µm P/N Rs= mm 3.5 µm P/N Rs= 図. 15 mm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 3.5 μm カラムを使用したアミノ酸分析 7

8 オリジナルの AminoQuant メソッドから Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 AA メソッドへのアップグレードラピッドレゾリューションメソッドには AminoQuant カラム (.1 mm 5 µm) と同じ内径および同様の効率の.1 15 mm 3.5 µm カラムが含まれますその結果 AminoQuant カラムと同程度の分析時間およびピーク幅のクロマトグラムがラピッドレゾリューションメソッドでも得られます Eclipse Plus C1 アミノ酸メソッドにアップグレードし AminoQuant の結果に匹敵するクロマトグラムを希望している AminoQuant ユーザーは.1 15 mm 3.5 µm メソッドを表 5 に示した Agilent SL シリーズ HPLC と共に使用する必要があります補足アミノ酸 (Gln ASsn Trp nva Hyp Sar) を含む標準アミノ酸混合物質のピーク溶出順序はアルギニンを除いてつのメソッドで同じです AminoQuant メソッドではアルギニンはアラニンの直後に溶出します Eclipse Plus C1 メソッド ( およびすべての旧 ZORBAX アミノ酸メソッド ) ではアルギニンはアラニンの直前に溶出します Eclipse Plus アミノ酸メソッドにアップグレードする AminoQuant ユーザーはオリジナルの AminoQuant クロマトグラムと分析時間が同様のクロマトグラムに制約されない場合には他の 9 個のメソッドのいずれかを選択できますこのようなユーザーは分析時間分解能溶媒消費量または機器に関するニーズに最適なメソッドを選択する必要がありますラピッドレゾリューションハイスループットメソッドこれらのメソッドはまたは 5 mm のカラム内径と 1. µm の粒子を使用します図 3 に示す mm RRHT カラムの分離係数は図の 3.5 µm オプションよりも大きく図 1 の従来型高分解能カラムとほぼ同じ値ですこれは mm 1. µm カラムの効率が 5 mm 5 µm カラムとほぼ同じであることを示していますこれらの高速高分解能メソッドでは分析のシステム圧力が約 bar であるため Agilent SL システムが必要ですカラム長さが半分になると分析時間 ( および圧力 ) が半減しますが分解能は低下します短い RRHT カラムを使用する利点は mm 1. µm P/N Agilent ZORBAX ラピッドレゾリューションハイスループット Eclipse Plus C1 mm 1. µm オプション.1 mm 1. µm P/N Rs= Rs= 図 3. mm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 1. µm カラムを使用したアミノ酸分析

9 近接したつのピークの未満の Rs 係数での再平衡化を含む分析時間が 9 分であることです ( 図 ) この場合も狭いピークを正確に検出および定量する DAD 検出器のより高速なサンプリングスピードとグラジエントディレイボリュームを最小化する柔軟なポンプ流路構成を実現するためにこれらの 1. µm メソッドには SL が必要ですバッチ間の再現性バッチ間またはロット間の再現性は異なるロットの充てん剤から作られた 3 種類のカラムで分析を実行することにより測定されましたさらに分離係数 (α) または選択性が近接するピークに対して測定されました選択性は固定相と移動相の間の分析対象成分の平衡分布に直接影響するためバッチ間の再現性に関して適切な測定基準になります平衡分布は移動相組成固定相の性質および温度の影響を受けます移動相組成と温度は一定であるため分離係数の差異は固定相の違いによるものです図の近接ピークの選択性係数は同じであることに注意してください Agilent ZORBAX ラピッドレゾリューションハイスループット Eclipse Plus C1 5 mm 1. µm オプション.6 5 mm 1. µm P/N Rs= 1.9 Rs= mm 1. µm Rs= 1.6 Rs= 1.6 P/N mm 1. µm P/N Rs= 1.5 Rs= 1.5 Rs= 1.5 Rs= 図. 5 mm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 1. µm カラムを使用したアミノ酸分析同様の選択性で 5 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 固定相のバッチ間再現性を強調 α,3 = mm 5 µm α B7 5, =1. α 6,5 =1. α 1,13 = B1 B α,3 = α 5, =1. α 6,5 =1. α 1,13 = α,3 = α 5, =1. α 6,5 =1. α 1,13 = 図 5. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 5 µm のバッチ間再現性 9

10 3 つのバッチ間の同様の選択性で 3.5 µm 固定相とアミノ酸メソッドの再現性を強調.1 15 mm 3.5 µm B7 α,3 =1.1 α 5, =1.6 α 6,5 = α 1,13 =1. B α,3 =1. α 5, =1.6 α 6,5 =1. α 1,13 =1. B α,3 =1. α 5, =1.6 α 6,5 =1. α 1,13 = 図 6. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 3.5 µm のバッチ間再現性 6 3 つのバッチ間の同様の選択性で 1. µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 固定相とアミノ酸メソッドの再現性を強調.6 5 mm 1. µm B756 3 α,3 =1.1 α 5, =1.5 α 6,5 = α 1,13 =1. 6 B α,3 =1.1 α 5, =1.5 α 6,5 =1. α 1,13 =1. 6 B α,3 =1.1 α 5, =1. α 6,5 =1. α 1,13 = 図 7. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 1. µm のバッチ間再現性

11 1 つの例でのみ選択性係数が 1% 異なっていますバッチ間再現性は 3 種類の粒子径について一貫性と信頼性がありますバッチ間の比較には異なるカラムサイズを使用しました 1. µm 粒子の比較には.6 5 mm 3.5 μm 粒子の比較には.1 15 mm 5 μm 粒子の比較には.6 15 mm 選択性はカラムサイズに依存しないため異なるサイズが適合しますまたこれらはメソッドの堅牢性をさらに実証します実際にはバッチ間再現性を示している.6 15 mm サイズ ( 図 5 を参照 ) はこのアプリケーションノートでは推奨されていない構成ですその理由は 5 µm カラムは 3.5 µm カラムと同様の選択性でアミノ酸を分離しますが.6 15 mm 3.5 µm カラムは効率がより高いためより優れた分解能を達成するからですこのため 5 µm カラムよりも優れたオプションになります寿命 / 長時間テスト図に 5 回の注入を行うために日間連続してアミノ酸メソッドを繰り返した ChemStation シーケンスを示します追加の長時間テスト ( 図 9 を参照 ) は G1311A クォータナリポンプおよび 3. 5 mm カラムを使用して行いました長いほうのカラムは日余分にかかり合計 1 日の無停止運転で 5 回の分析が完了しました分解能はどちらの場合にも週間の期間に徐々に低下しましたが依然として 1.5 を上回る R s 係数が得られました # Pmax = 16 bar クロマトグラフィ性能は 5 回の注入後も許容範囲内です Rs= #3 Pmax = 19 bar Rs= 1.6 (h) #5 Pmax = 19 bar Rs= 1., all other pairs > 図. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm 3.5 µm の長時間テスト #1 Pmax = 13 bar クロマトグラフィ性能は 5 回の注入後も許容範囲内です Rs= 1.5 Rs= Rs= 1.5 #75 Pmax =13 bar Rs= (336h) Rs= 1.61 #53 Pmax 135 bar Rs= 図 9. クォータナリシステムでの Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm 5 µm の長時間分析 11

12 注入間の再現性長時間分析データから注入の再現性も認められました図は 9 回の反復注入の重ね書きですこれによりリテンションタイムの再現性とピーク面積も簡単に比較できます溶出の早い中程度および遅いアミノ酸のピーク面積の相対標準偏差率 (%RSD) がクロマトグラムの下に計算されています異なるカラムサイズを使用した同様の結果が報告されています [5 7] 直線性.1 15 mm 3.5 µm と.6 mm 1. µm のつのカラムを選択して直線性を示します以前のアミノ酸プロトコルからの 3 ポイントの標準感度検量線を 5 および pmol/μl の標準感度アミノ酸混合物質標準試料と追加のおよび 5 pmol/μl の高感度標準試料 ( 蛍光検出用 ) を使用した 5 ポイントの検量線に拡張しました一貫性のあるピーク面積とリテンションタイムはオンライン誘導体化とカラムの再平衡化を含むメソッドの堅牢性を示します 6 REPRO.D) REPRO9.D) REPRO.D) REPRO7.D) REPRO6.D) REPRO5.D) REPRO.D) REPRO3.D) REPRO.D) StDEV %RSD Glu Ala Cys Lys Pro 図. 連続注入の重ね書き Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm 3.5 µm 1 nmol/μl サンプル 1

13 図 11 と 1 は FMOC 誘導体化アミノ酸を含むつのカラム構成での溶出の早い中程度および遅いアミノ酸の検量線をプロットしていますこの検量線は標準試料の他のアミノ酸を代表するものです表 6 にこれまでのアミノ酸メソッドで説明した 5 ポイントの検量線およびより高濃度での 3 ポイントの検量線を使用した両方のカラムのすべての R 値をまとめます ~ pmol/μl の直線性は ~ pmol/μl の場合と同様に堅牢です 6 直線性の範囲はすべてのアミノ酸で ~ pmol/μl です Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm 3.5 µm y =.79x -.16 R² = pmol/µl Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm, 3.5 µm y =.9x R² = pmol/µl Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm, 3.5 µm y =.1193x R² = Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm, 3.5 µm y =.69x +.1 R² = pmol/µl 6 pmol/µl 図 11. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm 3.5 µm カラムでの溶出の早い中程度および遅いアミノ酸の 5 ポイントの検量線直線性の範囲はすべてのアミノ酸で ~ pmol/μl です 6 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1.6 mm, 1. µm y =.67x +.67 R² = Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1.6 mm, 1. µm y =.773x +.35 R² = pmol/µl 6 pmol/µl Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1.6 mm, 1. µm y =.19x -.1 R² = Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1.6 mm, 1. µm y =.61x R² = pmol/µl 6 pmol/µl 図 1. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1.6 mm 1. µm カラムでの溶出の早い中程度および遅いアミノ酸の 5 ポイントの検量線 13

14 表 6. 5 ポイントおよび 3 ポイント検量線の R 値 5 ポイント検量線の R 値 ( pmol/μl) 3 ポイント検量線の R 値 ( pmol/μl) アミノ酸アミノ酸.1 mm 15 mm, 3.5 µm 検量線 R.6 mm mm, 1. µm 検量線 R.1 mm 15 mm, 3.5 µm 検量線 R.6 mm mm, 1. µm 検量線 R ASP y=.95x y=.73x ASP y=.95x y=.7x GLU y=.79x y=.67x GLU y=.x y=.66x SER y=.93x y=.76x SER y=.995x y=.75x+. 1. HIS y=.716x y=.555x HIS y=.73x y=.55x GLY y=.956x y=.75x GLY y=.971x y=.76x THR y=.99x y=.7x THR y=.996x y=.7x ARG y=.11x y=.76x ARG y=.1x y=.769x ALA y=.9x y=.773x ALA y=.37x y=.771x TYR y=.93x y=.716x TYR y=.91x y=.71x CYS y=.17x y=.x CYS y=.19x y=.1x VAL y=.9x y=.79x VAL y=.3x y=.79x MET y=.x y=.7x MET y=.16x y=.779x PHE y=.95x y=.73x PHE y=.95x y=.7x ILE y=.9x y=.739x ILE y=.99x y=.737x LEU y=.1x y=.767x LEU y=.9x y=.765x LYS y=.1193x y=.19x LYS y=.133x y=.161x PRO y=.69x y=.61x PRO y=.66x y=.635x カスタマイズ各メソッドの流路構成を表 5 に示します移動相グラジエント余地がありますたとえばより長いフローセルに置き換えては多くのアミノ酸の分離に不可欠です既知の流路によって感度を向上させることができます (図 13 を参照) グラジエントディレイボリュームがこのアプリケーションメソッドをカスタマイズする別の方法は二級アミノ酸が重要ノートで使用した LC システムとお客様のラボの LC システムとではない場合にインジェクタプログラムの FMOC 誘導体化手順の間で同様であることが保証されますただしカラム移動を排除しグラジエントを変更することです相および LC システムの堅牢性は変更またはカスタマイズの 3 より長いフローセルパスを使用した場合に感度が向上 3 mm フローセル G mm 1. µm 分 6 1 分 6 mm フローセル G mm 1. µm 図 13. mm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 カラムと異なるフローセルを使用した RRHT アミノ酸分析 1

15 結論アミノ酸の自動オンライン誘導体化メソッドは長さカラム内径および 3 種類の粒子経を含む種類のカラムサイズの Agilent ZORBAX Eclipse Plus C1 カラムを使用して改良されました多様なカラム選択肢により高分解能高速性溶媒消費量の削減またはニーズに最適な組み合わせが提供されます.1 15 mm 3.5 µm カラムでは AminoQuant メソッドに最も似たクロマトグラムが得られます以前のプロトコルよりこのプロトコルが優れているもう 1 つの点はクォータナリポンプ LC からバイナリポンプ LC または -bar LC (Agilent 1) から 6-bar LC (Agilent SL) などあるタイプの LC システムから別のタイプへのメソッドの変換に柔軟性があることですこのプロトコルでは最初に溶出するつのアミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸のリテンションも向上しますメソッドの正確性は長時間テストバッチ間テスト直線性テストおよびカスタマイズ機能によって示されました信頼性の高い Agilent LC 機器および実証済みの自動オンライン誘導体化と組み合わされた ZORBAX Eclipse Plus C1 カラムで遊離アミノ酸の分析を向上させることができます参考文献 1. Rainer Schuster and Alex Apfel, Hewlett-Packard App. Note, Pub.# (196). Rainer Schuster, J. Chromatogr., 31, 71- (19) 3. Herbert Godel, Petra Seitz, and Martin Verhoef, LC-GC International, 5(), -9 (199). John W. Henderson Jr, Robert D. Ricker, Brian A. Bidlingmeyer, and Cliff Woodward, "Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids" Agilent Pub.# E () 5. Cliff Woodward, John W Henderson Jr. and Todd Wielgos, "High-Speed Amino Acid Analysis (AAA) on Sub-Two Micron Reversed-phase (RP) Columns" Agilent Pub.# EN (7) 6. Angelika Gratzfeld-Huesgen, "Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein Hydrolysates using the Agilent 1 Series HPLC" Agilent Pub.# EN (1999) 7. Jason Greene, John W. Henderson Jr., John P. Wikswo, "Rapid and Precise Determination of Cellular Amino Acid Flux Rates Using HPLC with Automated Derivatization with Absorbance Detection" Agilent Pub.# EN (9) 15

16 表 7. 注文情報誘導体化試薬説明アジレント部品番号ホウ酸塩緩衝液 : 水中に. M ph. ml FMOC 試薬 ACN 中に.5 mg/ml 1 ml アンプル OPA 試薬.M ホウ酸塩緩衝液中に mg/ml および 3-メルカプトプロピオン酸 6 1 ml アンプルシステイン分析用の DTDPA 試薬 5 g 移動相および注入希釈剤成分製造元説明製造元部品番号 Na HPO リン酸ナトリウム二塩基性 Sigma S 797 Na B O 7 H O 四ホウ酸ナトリウム十水和物 Sigma S 96 NaN 3 アジ化ナトリウム Sigma S H 3 PO オルトリン酸 Sigma バイアル説明アジレント部品番号ガラスバイアルインサート µl 樹脂足付茶色広口ライトオンスクリューキャップバイアル ml 個青ポリプロピレンキャップ PTFE/ シリコンセプタム個透明ガラススクリューキャップバイアル 6 ml 6 mm キャップサイズ個スクリューキャップ 16 mm 個 PTFE/ シリコンセプタム 16 mm 個標準試料説明アジレント部品番号.1 M HCl 中のアミノ酸標準試料 1 ml アンプル 1 nmol / ml pmol / ml pmol / ml pmol / ml pmol / ml アミノ酸補助キット : Nva Sar Asn Gln Trp Hyp 各 1 g アジレントは本文書に誤りが発見された場合また本文書の使用により付随的または間接的に生じる損害について一切免責とさせていただきます本文書に記載の情報説明製品仕様等は予告なしに変更されることがありますアジレントテクノロジー株式会社 Agilent Technologies, Inc., Printed in Japan January 1, JAJP

細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中のアサリニンの測定 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C µm カラムアプリケーションノート製薬著者 Rongjie Fu Agilent Technologies Shanghai

細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中のアサリニンの測定 Agilent InfinityLab Poroshell 2 EC-C8.9 µm カラムアプリケーションノート製薬著者 Rongjie Fu Agilent Technologies Shanghai 概要細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中の活性化合物アサリニンをサブ 2 µm の Agilent