HPLCによるUSP関連物質分析条件のUPLC分析への移管と開発

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なごみいのら
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1 HPL による USP 関連物質分析条件の UPL 分析への移管と開発 No J はじめに本アプリケーションでは HPL によるミルタザピンの純度分析 (USP) の Waters QUITY UPL システムへの移管についてご紹介しますこのシステムは小さな粒子径 (1.7μm) の QUITY UPL H カラムを用い伝統的な HPL のパフォーマンスを凌駕するものですこのアプリケーションノートでは分析法移管に加えてバリデーション結果の一部及び二つの方法によるアプローチの比較についてもご紹介します分析法の移管は移動相組成カラム温度及び検出パラメータは変更せずその他のパラメータ流量注入量分析時間グラジエント勾配 ( グラジエント使用時 ) について数学的に新しいカラムの内径及び長さとスケールに合わせて行われましたこのアプローチはシンプルでしばしばシステム適合性の要求事項を維持しながら重要な成分同士の分離度を維持または改善するものですそして感度の向上及び分析時間の短縮が達成されていますこのような分析法の移管において再バリデーションを実施する際 QUITY UPL によって得られるベネフィットを最大限に活かすため分析法の調整を要する場合があります様々な背景要求によって分離分析法が完全に再開発される場合においても全てのクロマトグラフィパラメータが利用可能であり既存の方法が達成できなかった頑健性向上分析時間短縮重要な分析対象物の分離度向上溶媒消費量削減といった様々な項目に対応しながら分析法を改善することが可能です新しく開発された方法ではバリデーションを行うことが必要ですしかしながらより早くより頑健性の向上した分析法と共に操作の簡単な mpower TM 2 分析法バリデーションマネージャを利用することによって全体のバリデーションプロセスは一元化され短時間で終了することが可能ですミルタザピン (1,2,3,4,10,14b-hexahydro-2- methylpyrazino[2,1-a]-pyrido[2,3-c][2]benzazepine( 図 1)) は抗うつ薬として利用されています実験と結果試料シグマ - アルドリッチ社 (St. Louis, MO) 製テトラメチルアンモニウム水酸化物ペンタ水和物 Fisher Scientific 社 (Fair Lawn, NJ) 製アセトニトリルメタノール及びテトラヒドロフラン Fluka 社 (St. Louis, MO) 製炭酸水素アンモニウム J.T. aker 社 (Phillipsburg, NJ) 製リン酸水は MilliQ Gradient 10 システム (Millipore, illerica, M) で精製ミルタザピン及び 5 つの類縁物質 (~ で表示 ) は製造販売会社より購入図 1. ミルタザピン

2 HPL 装置及び実験条件 HPLは 2487UV 検出器を装備したlliance 2695セパレーションモジュールカラムはUSPによるL1カテゴリー対応カラムとして 5μm, 4.6x250 mm Xridge TM 18 カラムを使用 USPによる初期条件はカラム温度 40 注入量 10μL 移動相はテトラメチルアンモニウム水酸化物緩衝液 ( ph7.4): アセトニトリル : メタノール : テトラヒドロフラン =65:15:12.5:7.5 流量 1.5mL/minのアイソクラティック検出波長は240nm 試料は全てアセトニトリル: 水 =1:1で希釈 HPL 分析法 (USP) HPL を用いた分析法を確認するための合否判定基準は 1) 全ての化合物の分離度が 2.0 以上 2) シンメトリー係数 USP テーリングファクターとして 2.0 以下 3)3 回注入した場合の相対標準偏差 (%RS) が 2.0% 以下合否判定基準を満たすよう USP の分析法から移動相の有機溶媒含量を若干変更し (35 から 33% へ ) HPL によるミルタザピン及び 5 つの類縁物質を含む標準溶液の分析を行いました ( 図 2) 及びのピーク間で得られた分離度が 3.7 と最小で全ての化合物が良く分離されましたピークシンメトリーも合否判定基準 (<2.0) を満たしました 3 回の繰り返し注入における面積値の %RS も合否判定基準 (2.0%) を満たしました ( 表 1) UPL 装置及び実験条件 QUITYT UPL はバイナリーソルベントマネージャ ( SM) サンプルマネージャ ( SM) QUITY UPL Tunable UV(TUV) 検出器で構成 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを使用装置は全てmpower 2ソフトウェアによって制御されデータ解析も同ソフトウェアを用いて実施 min mg/ml 3.09 min mg/ml 5.69 min mg/ml 6.53 min mg/ml min mg/ml Mirt.* min mg/ml U Mirt 分 *Mirt. = ミルタザピン図 2. USP 条件を用いた HPL による分析例 (10μL 注入 )

3 HPL による分析法 (USP) を QUITY UPL システムへ移管 HPLを利用した分析法をQUITY UPL システムへと移管いたしました USP L1カテゴリーに対応するため 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを選択しました HPLでの分析スケールからUPL カラムへの分析法移管では分析時間流速注入量を変更いたしました HPLでの分析時間はミルタザピンの溶出時間の約 2 倍の60 分に設定されていました計算の結果 QUITY UPL システムを用いた分析時間は 10 分と算出されました USP の HPL による分析では流量は 1.5 ml/min でしたが UPL では 0.30 ml/min に注入量は HPL による分析での 10μL から 0.40μL へと変更されました試し打ちを行って検討した結果非常に極性の高い化合物ではピークに影響がでたため 0.10μL から試験を開始することと致しました HPL から UPL への移管に際し利用された計算式を表 2 にまとめましたパラメータミルタザピン平均保持時間分 2.18 ± 0.18% 3.09 ± 0.23% 5.67 ± 0.50% 6.50 ± 0.46% 26.5 ± 0.54% 34.7 ± 0.40% 相対保持時間 USP Resolution N 4.74 ± 1.29% 14.3 ± 1.13% 3.70 ± 1.62% 37.3 ± 0.54% 8.16 ± 0.64% USP Tailing 0.67 ± 6.0% 1.36 ± 1.32% 1.20 ± 0.58% 1.21 ± 0.25% 1.23 ± 0.98% 1.49 ± 0.34% %RS( 面積 ) 表 1 USP 条件を用いた HPL による分析結果 [n=3] パラメータ分析時間計算式 UPL Run Time = HPL Run Time x UPL olumn Length HPL olumn Length 流量 UPL Flow Rate = HPL Flow Rate x (UPL olumn iameter) 2 (HPL olumn iameter) 2 注入量 UPL Injection Volume = HPL Injection Volume x UPL olumn Volume (π r 2 L) HPL olumn Volume (π r 2 L) 表 2 アイソクラティック分離における分析法移管のための基本的な計算式

4 図 3 UPL への分析法移管によって得られたクロマトグラム [0.1μL 注入 ] QUITY UPL による分析ミルタザピンの HPL による分析からの移管によって溶出順序または全体的なクロマトグラフィックプロファイルには影響を与えることはありませんでした ( 図 3) 分離度テーリングファクター及び再現性については 3 回の注入で得られた面積値の %RS を見た場合 HPL 分析で設定された基準値を全て満足する結果が得られました ( 表 3) 及び及びピークの間の分離度は 2.0 以上でした各ピークに対するテーリングファクターは 1.6 以下で 3 回注入に対する面積値の %RS は全て 1% 以下でした以上より HPL による分析法から UPL への分析法の直接移管が完了し全体的なパフォーマンスについても HPL で得られたものと同等の結果が得られましたパラメータミルタザピン平均保持時間分相対保持時間 USP Resolution N 2.45 ±0.57% 7.90 ±0.84% 2.62 ±0.23% 28.2 ±0.48% 3.05 ±0.10% USP Tailing 1.36 ±0.05% 1.60 ±0.63% 1.24 ±0.16% 1.22 ±0.16% 1.03 ± 0.033% 1.07 ±0.28% %RS ( 面積 ) 表 3 UPL への分析法移管によって得られた結果 [n=3]

5 USP の HPL による分析法は最小限の労力で QUITY UPL システムへと移管されました HPL による分析法と UPL による分析法の各パラメータの比較を表 4 に示しますこのシンプルな分析法移管によって生み出された分析法は設定された基準値を満たすものでした ( 表 3) UPL による分析法によって USP のシステム適合性における要求を満たしつつ 1 分析あたり 50 分短縮することができました更に注入量は 100 分の 1 の量でまた移動相消費量も 97% 削減されたことから廃棄費用を含めコスト削減を達成することができました分析法の改良 HPL から UPL への分析法移管は USP のシステム適合性の要求を満たしている一方複雑な移動相次善策である流量弱い保持 ( 早い溶出時間 ) 化合物及びの分離度等の要因を考慮すると分析法を改良できる余地がありましたそこで移管された分析法についてバリデートする前に分析法の改良を開始いたしましたこの検討の主要な目的は USP の HPL による分析法で求められるシステム適合性を満たしながら分析時間を短縮しよりシンプルで頑健性の高い分析法を開発することでした分析法検討のアプローチではミルタザピンやその類縁物質といった塩基物質が高い ph の移動相で効果的に分離することを利用いたしましたパラメータカラムカラム温度移動相分析時間ミルタザピン保持時間流量注入量 USP HPL Method 4.6 x 250 mm, 5 μm Xridge : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic, 67% :33% 60 min 26.7 min 1.5 ml/min 10 μl Transferred QUITY UPL Method 2.1 x 50 mm, 1.7 μm QUITY UPL H : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic, 67% :33% 10 min 4.8 min 0.30 ml/min 0.1 μl 表 4 USP の HPL 分析法と移管された UPL による分析パラメータの比較

6 QUITY UPL Hカラムはこれらの高いpH 環境下で使用することが可能です改良された分析法が必要に応じて MS( 質量分析計 ) での分析を行えるように炭酸水素アンモニウム緩衝液を選択しましたミルタザピン及びその類縁物質 ( 水 : アセトニトリル =1:1 で約 1mg/mL に希釈 ) をグラジエント条件として 10mM の炭酸水素アンモニウム緩衝液 (ph10.5) とアセトニトリルを用い 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを選択して分析いたしました注入量は 1.0μL で流量は 0.65μL/min ですグラジエント条件として 5% から 85% までアセトニトリル含量を直線的に変化させ 5 回から 10 回の予備分析を行いました検討の結果ミルタザピン及びその類縁物質に対して流量を 1.2mL/min とし分析時間 5 分という分析法を設定することができました ( 表 5) またグラジエントの初期条件及びスロープを微調整することにより特にミルタザピンと化合物の分離度を更に改善することができましたクロマトグラムを図 4 に示します再設定された QUITY UPL の分析法は USP の HPL 分析法及びシンプルに移管しただけの UPL 分析法と比較し同等かそれ以上のパフォーマンスを示しています ( 表 6) 再設定された分析法については直線性精度定量限界 (LOQ) の各項目に対して分析法バリデーションを実施いたしました化合物については 0.05% から 0.5% までの範囲で直線性が得られミルタザピンを含むそれ以外の化合物については 0.01% から 0.5% までの範囲で直線性が得られました相関係数 r 2 については全ての化合物について 0.99 以上の値が得られています USP の不純物限度値 (0.10%) に対して 80,100,120% 濃度で全ての化合物がブランク試料に添加され評価されましたその結果全ての化合物に対して添加回収率は 99±7% 繰り返しの分析における面積値の %RS は 2.0% 以下と良好な結果が得られました全ての化合物対して LOQ は USP の不純物限度値 0.1% よりも低い値を示しました mpower 2 分析法バリデーションマネージャといったソフトウェアを用いることによってこれらのプロセスは効率的に短時間で終了することが可能ですパラメータカラムカラム温度移動相分析時間ミルタザピン保持時間流量検出注入量 Original USP HPL Method 4.6 x 250 mm, 5 μm Xridge : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic 67% :33% 60 min 26.7 min 1.5 ml/min 240 nm at 5 pps 10 μl Newly eveloped QUITY UPL Method 2.1 x 50 mm, 1.7 μm QUITY H : 10 mm mmonium bicarbonate, ph 10.5 : cetonitrile Gradient 5 37% over 4.5 min 4.6 min min 1.2 ml/min 240 nm at 20 pps 1 μl 表 5 シンプルに移管された UPL 分析法及び改良された UPL 分析法のパラメータ比較

7 min mg/ml 1.36 min mg/ml 2.34 min mg/ml 2.59 min mg/ml 3.99 min mg/ml Mirt 4.15min mg/ml Mirt U 分図 4 改良された UPL 分析法によるクロマトグラムパラメータミルタザピン平均保持時間 0.81 ±0.12% 1.36 ±0.18% 2.34 ±0.11% 2.59 ±0.11% 3.99 ±0.06% 4.15 ±0.07% 相対保持時間 USP Resolution N 17.1 ±0.47% 29.9 ±0.05% 7.45 ±0.01% 36.3 ±0.12% 3.78 ±0.64% USP Tailing 1.60 ±0.01% 1.37 ±0.80% 1.01 ±0.02% 1.06 ±0.00% 1.02 ±0.09% 1.19 ±0.20% %RS ( 面積 ) 表 6 改良された UPL 分析法による結果 [n=3]

8 まとめ本アプリケーションノートではミルタザピン及びその類縁物質に関する USP の HPL 分析法をまず UPL 分析法へと移管いたしましたこのプロセスによって得られた UPL 分析法においても十分なデータを得ることができましたが更に検討を重ね改良された UPL 分析法を開発することに成功いたしました表 6 に示すように改良された UPL 分析法はより短時間で分析を終了することが出来ミルタザピンとその類縁物質についてまた類縁物質同士について更に良い分離度を得ることができました幾つかの項目について実施された分析法バリデーションの結果も良好でした 4.5 分という分析時間は HPL による分析法 (60 分 ) と比較しまた単純に移管された UPL 分析法 (10 分 ) と比較しても 2 倍早いものでした新しい分析法をバリデートする時間及び労力のために多くの研究者は分析法を再検討することをためらいがちですしかし UPL 及び mpower 2 分析法バリデーションマネージャがもたらす大幅な分析時間の短縮化によって分析法バリデーションはかつてないほど簡単で時間を必要としないものとなりましたまず第一に既存の分析法を UltraPerformance L へと分析法の移管を検討することが重要ですがこの新しい技術を最大限に活かすために分析法を更に検討することも重要です分離能の向上分析時間の短縮そしてより頑健性の増した分析法は上市に至る時間の短縮全体の開発コスト削減に対して有効です

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5989_5672.qxd USP で規定された範囲内で高速化された HPLC 分析 Agilent 1200 シリーズ Rapid Resolution LC システムを用いたプラバスタチンナトリウムの USP 純度試験の事例研究アプリケーション製造 QA/QC 著者 Syed Lateef Agilent Technologies Bangalore, India 概要最近改訂された米国薬局方 (USP) の General