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いつやよどぎみ
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1 食肉からの基質特異性拡張型 β- ラクタマーゼ (EBL) 産生大腸菌の検出下島優香子, 井田美樹, 猪股光司, 樋口容子, 髙野智香, 河村真保, 小西典子, 畠山薫, 仲真晶子, 甲斐明美 Extended-pectrum β-lactamase-(ebl) producing Escherichia coli solated from Meat Yukako HMOJMA, Miki DA, Mitsushi NOMATA, Yoko HGUCH, Chika TAKANO, Maho KAWAMUA, Noriko KONH, Kaoru HATAKEYAMA, Akiko NAKAMA and Akemi KA 東京都健康安全研究センター研究年報第 6 号別刷

2 東京健安研セ年報 Ann. ep. Tokyo Metr. nst. Pub. Health, 6, 4-, 食肉からの基質特異性拡張型 β- ラクタマーゼ (EBL) 産生大腸菌の検出下島優香子 a, 井田美樹 a, 猪股光司 a, 樋口容子 a, 髙野智香 a, 河村真保 a, 小西典子 a, 畠山薫 b, 仲真晶子 a c, 甲斐明美都内で流通する食肉から基質特異性拡張型 β-ラクタマーゼ (EBL) 産生大腸菌の検出を試みた.EBL 産生大腸菌は国産鶏肉検体中検体, 輸入鶏肉 9 検体中 7 検体, 牛内臓肉検体中検体の計検体から株検出された. 株が保有するEBL 遺伝子は, 国産食肉由来株では-M-9 及び-M- が, 輸入鶏肉由来株では-M- 及び -M- が多かった. セフォタキシム () に対する薬剤感受性は-M 型株は耐性,TEM 及びHV 型株は中間を示し, 株中 9 株はフルオロキノロン耐性であった. キーワード : 基質特異性拡張型 β- ラクタマーゼ,EBL, 薬剤耐性菌, 大腸菌, 糞便系大腸菌群, 第三世代セフェム系薬剤, 食肉, 鶏肉はじめに基質特異性拡張型 β-ラクタマーゼ (Extended-spectrum β- lactamase ; EBL) は, クラスA β-ラクタマーゼの遺伝子に変異が起こり, ペニシリン系薬剤, 第二世代セフェム系薬剤だけでなく, セフォタキシム () やセフタジジム () 等の第三世代セフェム系薬剤も分解する能力を獲得したβ-ラクタマーゼを指す. EBLを産生する菌は, 9 年にドイツで初めて肺炎桿菌とセラチア菌で報告され ), 国内では99 年に大腸菌で初めて報告された ). 第三世代セフェム系薬剤は医療現場で広く使われるため, EBL 産生菌は院内感染原因菌としても, 市中感染原因菌としても重要な問題となっている. 従来, 薬剤耐性菌の出現は畜産領域で使用される抗菌剤が一因と考えられてきた.EBL 産生菌についても国内外で肉用鶏のふん便や市販鶏肉からの分離が報告されていることから, 4),EBL 産生菌の食肉を介した人への伝播が懸念されている. 今回, 都内で流通する食肉からの本菌の検出ならびに遺伝子型別を試みたので, その結果について報告する. 材料と方法. 被検材料年月から7 月に, 都内で収去あるいは購入した食肉及び内臓肉計 9 検体を供試した. その内訳は, 牛肉検体 ( 輸入牛肉検体 ), 牛内臓肉検体 (variety meat; 国産牛内臓肉検体 ), 豚肉 9 検体 ( 国産豚肉検体及び輸入豚肉 4 検体 ), 鶏肉 47 検体 ( 国産鶏肉検体及び輸入鶏肉 9 検体 ) である. なお, 輸入鶏肉は全てブラジル産であった.. 分離と同定方法被検材料 gのペプトン食塩緩衝液による倍乳剤を本の倍濃度 EC 培地発酵管 mlに等量加えて44. Cで4 時間培養した. ) 糞便系大腸菌群の分離ガスを産生した試験管の培養液をEMB 培地に画線塗抹し Cで時間培養後, 赤色または金属様光沢を示したコロニーについて乳糖ブイヨン発酵管でのガス産生とグラム陰性桿菌であることを確認し, 糞便系大腸菌群陽性とした. ) EBL 産生菌の分離ガスを産生した試験管の培養液を µg/ml 加マッコンキー寒天培地に画線塗抹し, Cで時間培養した. 発育した乳糖を分解するコロニーについて乳糖ブイヨン発酵管でガス産生を確認した後, 下記に示す表現系確認試験により陽性となった菌株をEBL 産生菌とした (Fig. ). () Double disk synergy test Jarlerの方法 ) に準じ, 市販の薬剤感受性試験用ディスク ( 日本 BD) を使用して実施した. すなわち, ミューラーヒントン寒天培地上にアモキシシリン / クラブラン酸 (AMPC/CVA) から mm 離して,β-ラクタム系薬剤;, セフトリアキソン (CX),, アズトレオナム ( AZT ), セフポドキシム (CPDX ) を配置し, AMPC/CVA と各薬剤の間に阻止円の増強が起きたものを陽性と判定した (Fig. A). () 米国臨床検査標準化協会 (Clinical and Laboratory tandards nstitute ; CL) によるディスク拡散法 CL の推奨するディスク拡散法 6) に従って, 薬剤感受 a b c 東京都健康安全研究センター微生物部食品微生物研究科 69-7 東京都新宿区百人町 -4- 東京都健康安全研究センター微生物部病原細菌研究科 69-7 東京都新宿区百人町 -4- 東京都健康安全研究センター微生物部 69-7 東京都新宿区百人町 -4-

3 46 Ann. ep. Tokyo Metr. nst. Pub. Health, 6, A B CPDX CX /CVA AMPC/CVA AZT.cm /CVA /CVA /CVA Fig.. Phenotypic Tests for EBL Confirmation A. Double Disk ynergy Test B. Disk Diffusion Test by CL 性試験用ディスク及び単剤と,CVA との合剤 (/CVA 及び/CVA) を比較して,CVA との合剤による阻止円が単剤による阻止円よりも mm 以上拡張したものを陽性と判定した (Fig. B). ) EBL 産生菌の同定分離されたEBL 産生菌は, ウレア,VP, クエン酸, PA, マロン酸塩, 酢酸塩の生化学性状試験により菌種の同定を行った.. EBL 遺伝子型別 ) PC 法によるEBL 遺伝子の検出分離されたEBL 産生菌はPC 法により,TEM,HV, -M-,,, 9 のEBL 遺伝子の検出を行った 7, ). 検体から異なるEBL 遺伝子を保有する株が分離された場合は, それぞれ株を供試した. ) EBL 遺伝子 TEM 及びHV 型のバリアント型別 TEM,HVについては,-) で得られたPC 産物のダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定し,Lahey Clinicのホームページ 9) を参照してバリアント型を決定した. プロトタイプであるTEM-,TEM- 及びHV- 型はEBL 遺伝子から除外した. 4. O 血清群別及び毒素産生性試験大腸菌と同定されたEBL 産生菌は, 市販の診断用抗血清 ( デンカ生研 ) を用いてスライド凝集反応法によりO 血清群別を行った. 大腸菌の毒素産生性試験は, リアルタイムPC 法及び PC 法により, ベロ毒素 ), 毒素原性大腸菌の易熱性毒素 ) 及び耐熱性毒素遺伝子 ) の検出を行った.. 薬剤感受性試験 β-ラクタム系薬剤としてdouble disk synergy testで使用した薬剤にアンピシリン (ABPC) を加えた6 薬剤,β-ラクタム系以外の薬剤としてクロラムフェニコール (CP), テトラサイクリン (TC), ストレプトマイシン (M), カナマイシン (KM), ゲンタマイシン (GM), アミカシン (AMK),T 合剤 (T), ホスホマイシン (FOM), ナリジクス酸 (NA), ノルフロキサシン (NFLX), シプロフロキサシン (CPFX), オフロキサシン (OFLX), サルファ剤 (u), イミペネム (PM), メロペネム (MEPM) の薬剤について, 感受性試験用ディスク ( センシディスク ;BD) を用い,KB 法で行った 6). 結果. 糞便系大腸菌群及びEBL 産生菌検出状況食肉及び内臓肉 9 検体から分離した糞便系大腸菌群及び EBL 産生菌の検出状況を, 食肉の種類, 国産, 輸入別に Table に示した. 食肉 9 検体のうち66 検体 (7.7%) が糞便系大腸菌群陽性で,EBL 産生菌は検体 (.9%) から検出された. 検体から検出された株のEBL 産生菌は生化学性状により全て大腸菌と同定された. 食肉種類別のEBL 産生菌検出状況は, 国産鶏肉が検体のうち検体 (4.9%), 輸入鶏肉が9 検体のうち7 検体 (6.%), 国産牛内臓肉検体のうち検体 (6.7%) が陽性であった. 牛肉および豚肉からはEBL 産生菌は検出されず, 糞便系大腸菌群は牛肉検体中検体 (%), 豚肉

4 東京健安研セ年報,6, 47 Table. solation of Fecal Coliforms and EBL Producing amples E. coli between May and July, in Tokyo Domestic variety meat (beef) mported beef Domestic pork mported pork Domestic chicken meat mported chicken meat No. of samples exami ned mported chicken meats are all from. Fecal Coliforms 6 66 () () (4.) (4.) () (4.) (7.7) No. of isolates (%) EBL producing E. coli 7 (6.7) () () () (4.9) (6.) (.9) 9 検体中 4 検体 (.%) で検出され, 鶏肉 47 検体中 44 検体 (9.6%), 牛内臓肉検体中検体 (%) と比べて低かった.. EBL 遺伝子型別株の EBL 産生大腸菌の遺伝子型を Table に示した. 国産鶏肉由来の 9 株は多いものから,-M-9 株, EBL type TEM (TEM-) HV (HV-a, HV-) -M- -M- -M- -M-9 ND Table. EBL Genotype Domestic chicken meat 9 ND: not decided mported chicken meats are all from. No. of isolates mported chicken meat 9 Domestic variety meat (beef) -M- 株,TEM 型 ( バリアント型 :TEM- 型 ) 株,HV 型 ( バリアント型 :HV- 型 ) 株, 型別不能株の順であった. 輸入鶏肉由来の9 株は,-M- 株,-M- 株,HV 型 ( バリアント型 :HV-a 型 ) 株の順であった. 国産牛内臓肉由来の株は全て -M- であった.. EBL 産生大腸菌のO 血清群及び毒素産生性株のEBL 産生大腸菌の遺伝子型とO 血清群の関係を Table に示した.-M- の株はO,O, 型別不能,-M- の株はO,O6a, 型別不能,- M- の株はO,O, 型別不能,-M-9 の株はO,O74,O4,O6, 型別不能,TEM 及びHV 型の株は型別不能であった. また, ベロ毒素, 毒素原性大腸菌の易熱性毒素及び耐熱性毒素産生性は全ての株で陰性であった. 4. EBL 産生大腸菌の薬剤感受性試験 EBL 遺伝子型とβ-ラクタム系薬剤感受性パターンを Table 4に示した.,CXに対して-M 型の株は耐性,TEM 及びHV 型の株は中間を示す傾向にあった. に対しては遺伝子型にかかわらず感受性を示す株が多く,CPDX 及びABPCに対しては全ての株が耐性であった.AZTに対しては様々な薬剤感受性を示し, 遺伝子型との相関は認められなかった. EBL 産生大腸菌株のβ-ラクタム系薬剤以外の薬剤に対しての薬剤別耐性菌株数は,CP 7 株 (.6%),TC 株 (7.%),M 株 (64.%),KM 9 株 (9.%),GM 株 (.%),AMK 株 (%), T 株 (.7%),FOM 株 (.%),NA 株 (7.%),NFLX 株 (.%), CPFX 株 (.% ), OFLX 9 株 (9.% ), u 株 (67.7%),PM 株 (%),MEPM 株 (%) であった (Table. ). また, 薬剤全てに感受性の株は株, 単剤耐性株, 剤耐性株, 剤耐性 7 株,4 剤耐性株, 剤耐性株,7 剤耐性株, 剤耐性株,9 剤耐性株, 剤耐性株, 剤耐性株であった. Table. EBL Genotype and O-ero EBL type No. of isolates O-sero ource -M- O, O, OUT Chicken meats, variety meats () -M- O, O6a, OUT Chicken meats () -M- O, O, OUT Chicken meats () -M-9 O, O74, O4, O6, OUT Chicken meats () TEM OUT Chicken meats () HV OUT Chicken meats (, ) ND O Chicken meats () UT: untypable ND: not decided

5 4 Ann. ep. Tokyo Metr. nst. Pub. Health, 6, -M- -M-9 TEM HV ND Table 4. EBL Genotype and Antimicrobial esistance to β-lactam Antibiotics EBL type -M- -M- ource No. of isolates 6 CX ND: not decided : esistant, : ntermediate, : usceptibile AZT CPDX Table. Antimicrobial esistance of EBL producing E. coli Drug CP TC M KM GM AMK T FOM NA NFLX CPFX OFLX u PM MEPM No. of resistants (%) (n=) ABPC 考察都内に流通する食肉 9 検体のEBL 産生菌検出状況を調査した. その結果,EBL 産生菌は牛肉, 豚肉からは検出されなかったが, 鶏肉からは47 検体中 9 検体 (4.4%), 牛内臓肉からは検体中検体 (6.7%) と高率に検出された. 国産鶏肉と輸入鶏肉 ( 全てブラジル産 ) を比較すると, 国産鶏肉が検体中検体 (4.9%), 輸入鶏肉が9 検体中 7 検体 (6.%) で陽性であり, 国産肉がやや高い陽性率であったが, 輸入鶏肉の糞便系大腸菌群が検出された検体での陽性率は,4.%(6 検体中 7 検体 ) と, 国産鶏肉と同等であった. 輸入肉における糞便系大腸菌群検出率の低下は凍結状態であったことが一因となったものと考えられた. 検体から分離されたEBL 産生菌株のEBL 遺伝子型は,-M 型が7 株 (7.%) で大半を占めた. 国産鶏肉 (.6) (7.) (64.) (9.) (.) () (.7) (.) (7.) (.) (.) (9.) (67.7) () () では-M-9 及び-M- が, 輸入鶏肉 ( 全てブラジル産 ) では-M- 及び-M- が多く, 異なる傾向を示した. 臨床由来のEBL 産生菌は, 当初欧米では院内感染原因菌としてTEM 型及びHV 型のEBL 遺伝子を保有する肺炎桿菌が多く分離され ), 国内では-M 型の大腸菌が問題となっていた,). 年を境として世界中で-M 型菌の検出頻度が高くなってきており, 特に近年は-M- 型産生大腸菌 O:H4,T 株のパンデミックが報告されている 4).-M- 型は-M- に属するが, 今回都内に流通する食肉からは検出されず, 臨床と食肉の関連性は認められなかった. また,EBL 産生大腸菌のO 抗原も多種にわたっており, 血清群に偏りは見られなかった. EBL 産生菌の薬剤感受性は, 今回分離された株全てがペニシリン系薬剤のABPC, 第二世代セフェム系薬剤の CPDXに耐性であった. 第三世代セフェム系薬剤については,-M 型はに対して高度耐性が特徴とされるが 4), 今回分離されたEBL 産生菌についても,,CXに対しては-M 型株は耐性,TEM,HV 型株は中間を示す傾向にあった. また, パンデミック株にもなっている -M- 型株は及びともに耐性を示すとされるが, 今回分離された株には耐性株はなかった. EBL 産生菌の治療薬は第一選択薬としてカルバペネム系, 以下アミノグリコシド系, フルオロキノロン系が推奨されている. 今回分離されたEBL 産生菌は, カルバペネム系であるPM,MEPMに対しては全ての株が感受性を示した. アミノグリコシド系については,Mは64.%,KM は9.%,GMは.% が耐性を示したが,AMKに対しては全ての株が感受性であった. フルオロキノロン系についてはNFLX,CPFX,OFLX 剤に耐性の株が株 (.%), OFLXのみに耐性の株が株 (.%) であったが, フルオロキノロン耐性とEBL 遺伝子型,O 血清群, 分離された食肉の産地とは関連性が認められなかった. 以上の結果から, 食肉を原因としたEBL 産生菌感染症が発生した場合, 第二選択薬以降の薬剤の選択には注意を払う必要がある. 今回の調査で, 都内で流通する鶏肉や牛内臓肉から EBL 産生大腸菌が検出されることが明らかとなった. 今後も継続した調査が必要であると考えられる. まとめ医療現場で広く使われる第三世代セフェム系薬剤に耐性を示すEBL 産生菌は臨床上問題となっている. 都内で流通する牛肉, 牛内臓肉, 豚肉, 鶏肉からEBL 産生大腸菌の検出を試みたところ, 国産鶏肉検体中検体, 輸入鶏肉 9 検体中 7 検体, 牛内臓肉検体中検体から, 計株分離された. 株の保有するEBL 遺伝子は, 国産食肉由来株では -M-9 及び-M- が, 輸入鶏肉由来株では -M- 及び-M- が多く, 国産肉と輸入肉で傾

6 東京健安研セ年報,6, 49 向は異なっていた. 株の薬剤感受性試験の結果,9 株がフルオロキノロン耐性であり, 食肉を原因としたEBL 感染症が発生した場合は選択薬に注意が必要であると考えられた. 謝辞本調査を実施するにあたりご協力頂いた当センター広域監視部, 都区保健所の関係者の皆様に深謝します. 文献 ) Knothe, H., hah, P., Krcmery, V., et al.: nfection,, - 7, 9. ) shii, Y., Ohno, A., Taguchi H., et al.: Antimicrob. Agents Chemother., 9, 69-7, 99. ) Warren,. E., Ensor, V. M., O Neill, P., et al.: J. Antimicrob. Chemother., 6, 4-,. 4) Kojima, A., shii, Y., shihara, K., et al.: Antimicrob. Agents Chemother., 49, -7,. ) Jarlier, V., Nicolas, M. H., Foumier, G., et al.: ev. nfect. Dis.,, 67-7, 9. 6) Performance tandards for Antimicrobial usceptibility Testing; Nineteenth nformational upplement (M-9), 9, Clinical and Laboratory tandards nstitute, Wayne, PA, UA. 7) Yagi, T., Kurokawa, H., hibata, N., et al.: FEM Microb. Lett., 4, -6,. ) hibata, N., Kurokawa, H., Doi, Y., et al.: Antimicrob. Agents Chemother.,, 79-79, 6. 9) Lahey Clinic: ß-Lactamase Classification and Amino Acid equences for TEM, HV and OXA Extended-pectrum and nhibitor esistant Enzymes, ( 年月日現在, なお本 UL は変更または抹消の可能性がある ) ) Nielsen, E. M. and Andersen, M. T.: J. Clin. Microbiol., 4, 4-9,. ) 伊藤文明, 萩野武雄, 伊藤健一郎, 他 : 日本臨牀,, 4-47, 99. ) Abe, A., Obata, H., Matsushita,., et al.: Zentralbl. Bakteriol., 77, 7-7, 99. ) Perilli, M., Dell Amico, E., egatore, B., et al.: J. Clin. Microbiol., 4, 6-64,. 4) Canton,. and Coque, T. M.: Curr. Opin. Microbiol., 9, , 6.

7 Ann. ep. Tokyo Metr. nst. Pub. Health, 6, Extended-pectrum β-lactamase-(ebl) producing Escherichia coli solated from Meat Yukako HMOJMA a, Miki DA a, Mitsushi NOMATA a, Yoko HGUCH a, Chika TAKANO a, Maho KAWAMUA a, Noriko KONH a, Kaoru HATAKEYAMA a, Akiko NAKAMA a and Akemi KA a Extended-spectrum β-lactamase-(ebl) producing Escherichia coli (E. coli) was examined in 9 meats sold in Tokyo between May and July in. EBL producing E. coli were isolated from of the domestic chicken meats, 7 of the 9 imported chicken meats, and of the domestic variety meats. EBL genotypes of the strains from meat samples were examined by PC method. - M-9 was the most common of strains, followed by -M- of strains in the strains from domestic meats. - M- was the most frequent of strains, followed by -M- of strains in the 9 strains from imported meats. The strains of -M- showed resistant to cefotaxime () and ceftriaxone (CX), and the strains of TEM and HV showed intermediate to those antibiotics. All of the strains were susceptible to imipenem, meropenem (Carbapenem), and amikacin (an aminoglycoside antibiotic), and 9 of the strains were resistant to fluoroquinolones. Keywords: extended-spectrum β-lactamase, EBL, antimicrobial resistance, Escherichia coli, fecal coliforms, second-generation cephalosporins, meat, chicken meat a Tokyo Metropolitan nstitute of Public Health, -4-, Hyakunin-cho, hinjuku-ku, Tokyo 69-7,

東京都健康安全研究センター　研究年報59号

東京都健康安全研究センター　研究年報59号東京都において分離された赤痢菌の菌種および血清型と薬剤感受性について (2000 年 -2007 年 ) 河村真保, 柴田幹良, 高橋正樹, 横山敬子, 松下秀, 甲斐明美, 矢野一好東京都健康安全研究センター研究年報第 59 号別刷 2008 東京健安研セ年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. Pub. Health, 59, 41-46, 2008 東京都において分離された赤痢菌の菌種および血清型と