アスナプレビル 緒言 Page 2 1 諸言アスナプレビル (BMS ) は C 型肝炎ウイルス (HCV) の非構造蛋白 3(NS3) プロテアーゼを阻害することにより HCV RNA の複製を阻害する低分子阻害薬 ( 直接作用型抗ウイルス薬 ) である HCV NS3 プ

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1 アスナプレビル 緒言 Page 1 CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 緒言 ブリストル マイヤーズ株式会社

2 アスナプレビル 緒言 Page 2 1 諸言アスナプレビル (BMS ) は C 型肝炎ウイルス (HCV) の非構造蛋白 3(NS3) プロテアーゼを阻害することにより HCV RNA の複製を阻害する低分子阻害薬 ( 直接作用型抗ウイルス薬 ) である HCV NS3 プロテアーゼは NS3 の N 末端ドメインにコードされる 181 のアミノ酸から成るセリンプロテアーゼであり また 酵素反応に必要な補因子である NS4A 蛋白とヘテロ二量体酵素を形成し ウイルス複製に必要な成熟したウイルス蛋白産生のための HCV ポリ蛋白プロセシングに関与する 本薬の化学構造式を図 1-1 に示す 図 1-1 アスナプレビルの化学構造式 O O S H 2 C H 3 C H 3 C O H CH 3 O O NH O N H O H N CH 3 N CH 3 H H CH 3 H O N Cl O CH 3 アスナプレビルはジェノタイプ 1a, 1b, 2a の NS3 及びジェノタイプ 2b, 3a, 4a の NS3 プロテアーゼ配列をコードしたハイブリッドレプリコンを nm 濃度で阻害した 本薬は HCV に高い選択性を有し HCV と近縁の GB ウイルス B の NS3 プロテアーゼ及びヒトの各種セリン又はシステインプロテアーゼに対しては ほとんどあるいは全く活性を示さなかった また アスナプレビルは HCV 非構造蛋白 5A(NS5A) 複製複合体阻害薬であるダクラタスビル塩酸塩 (BMS ) 等の他の直接作用型抗ウイルス薬との併用により 相加又は相乗的な相互作用を示した アスナプレビルの非臨床プロファイルを in vitro 薬理試験 in vitro 及び in vivo 安全性薬理試験 非臨床薬物動態試験 毒性試験並びにトキシコキネティクス試験等により検討した アスナプレビルは C 型慢性肝炎患者に対する新規治療法としてダクラタスビルとの併用により開発が進められ 予定されているアスナプレビルの効能 効果 ( 案 ) 及び用法 用量 ( 案 ) は以下のとおりである 効能 効果 セログループ 1( ジェノタイプ 1) の C 型慢性肝炎又は C 型代償性肝硬変における次のいずれかのウイルス血症の改善 インターフェロン療法が不適格の未治療あるいは不耐容の患者 インターフェロン療法で無効となった患者

3 アスナプレビル 緒言 Page 3 用法 用量 通常 成人にはアスナプレビルとして 1 回 100 mg を 1 日 2 回経口投与する 本剤はダクラタスビル塩酸塩と併用し 投与期間は 24 週間とする

4 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 1 CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬理試験の概要文 ブリストル マイヤーズ株式会社

5 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 2 用語及び略語一覧 略号 用語 定 義 A alanine アラニン ASV asunaprevir, BMS アスナプレビル AUC area under the plasma concentration-time 血漿中濃度曲線下面積 curve BMS Bristol-Myers Squibb ブリストル マイヤーズスクイブ社 BVDV bovine viral diarrhea virus ウシウイルス性下痢ウイルス C cystein システイン Cardif Caspase recruitment domain adaptor inducing IFNβ IFNβ プロモーター活性化蛋白 CC 50 50% cytotoxic concentration 50% 細胞毒性濃度 Cmax highest observed plasma concentration 最高血漿中濃度 D aspartic acid アスパラギン酸 DCV daclatasvir, BMS ダクラタスビル DMSO dimethyl sulfoxide ジメチルスルホキシド E glutamate グルタミン酸 EC 50 50% effective concentration 50% 有効濃度 FRET fluorescent resonance energy transfer 蛍光共鳴エネルギー移動 G glycine グリシン GBV-B GB virus B GB ウイルス B H histidine ヒスチジン HCV hepatitis C virus C 型肝炎ウイルス HEK-293 embryonic kidney cell line 胎児腎細胞株 HeLa cervical cancer cell line ヒト子宮頸癌細胞株 herg human ether-a-go-go-related gene ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子 HIV human immunodeficiency virus ヒト免疫不全ウイルス HCoV human coronavirus ヒトコロナウイルス HRV human rhinovirus ヒトライノウイルス HuH-7 human hepatoma cell line ヒト肝細胞癌細胞株 I isoleucine イソロイシン IC 50 concentration of drug required to inhibit by 50% 50% 阻害濃度 IFNα interferon-alfa インターフェロン α IFNβ interferon-beta インターフェロン β IRF-3 interferon regulatory factor 3 インターフェロン調節因子 3 JFH-1 Japanese fulminant hepatitis 1 - K lysine リジン K i inhibition constant 阻害定数 L leucine ロイシン M methionine メチオニン MRC5 lung fibroblast cell line 肺線維芽細胞株 MT2 human T cell line ヒト T 細胞株 nm nanomolar ナノモル N asparagine アスパラギン NS3 non-structural protein 3 of HCV HCV 非構造蛋白 3

6 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 3 略号 用語 定 義 NS4A nonstructural protein 4A of HCV HCV 非構造蛋白 4A NS5A nonstructural protein 5A of HCV HCV 非構造蛋白 5A NS5B nonstructural protein 5B of HCV HCV 非構造蛋白 5B P proline プロリン pm picomolar ピコモル PPE porcine pancreas elastase ブタ膵エラスターゼ Q glutamine グルタミン R arginine アルギニン RNA ribonucleic acid リボ核酸 RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 reaction S serine セリン T threonine スレオニン μm micromolar マイクロモル V valine バリン Y tyrosine チロシン

7 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 4 目次 1 まとめ 薬効を裏付ける試験 酵素活性及び特異性 抗 HCV 活性 細胞毒性 作用機序 耐性 併用試験 副次的薬理試験 安全性薬理試験 受容体 / イオンチャネル結合及び酵素アッセイ 心血管系 中枢神経系 呼吸系 薬力学的薬物相互作用試験 考察及び結論 参考文献... 26

8 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 5 表一覧 表 In vitro におけるアスナプレビルの主要 6 種の HCV ジェノタイプを有する組換え HCV NS3/4A プロテアーゼに対する効力 表 In vitro におけるアスナプレビルのセリン及びシステインプロテアーゼに対する効 力 表 HCV レプリコンアッセイにおけるアスナプレビルのジェノタイプ網羅性 表 多様な起源のヒト細胞株に対するアスナプレビルの細胞毒性 表 アスナプレビル耐性レプリコンの遺伝子型及び表現型解析 表 遺伝子工学的 HCV 変異レプリコンのアスナプレビル感受性及び複製能 表 HCV レプリコンにおけるアスナプレビル併用試験 表 アスナプレビルとダクラタスビルとの併用効果 表 アスナプレビル投与後のアスナプレビルの平均血漿中濃度... 21

9 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 6 図一覧 図 3-1 アスナプレビル (BMS ) による HCV NS3/4A を介した IFN 反応抑制の阻害... 18

10 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 7 1 まとめアスナプレビル (BMS ) は C 型肝炎ウイルス (HCV) の非構造蛋白 3(NS3) プロテアーゼに対する低分子阻害薬 ( 直接作用型抗ウイルス薬 ) である 組換え酵素を用いた in vitro 試験において アスナプレビルは主要な 6 種の HCV ジェノタイプを有する 9 種の分離株由来の NS3 プロテアーゼ活性を 50% 阻害濃度 (IC 50 )0.3~320 nm で阻害した 最も強力な阻害作用はジェノタイプ 1 において認められ IC 50 の平均値は約 0.9 nm であり 一方 ジェノタイプ 2a, 2b 及び 3a のプロテアーゼの感受性は低く IC 50 値はそれぞれ 15, 78 及び 320 nm であった アスナプレビルは近縁関係にある GB ウイルス B(GBV-B) の NS3 プロテアーゼ及び一連のヒトのセリン又はシステインプロテアーゼに対してはほとんどあるいは全く活性を示さなかった アスナプレビルはジェノタイプ 1a 及び 1b のサブゲノム HCV レプリコンの複製を 50% 有効濃度 (EC 50 )1.2~4 nm で阻害した ジェノタイプ 4a の NS3 プロテアーゼドメインをコードしたハイブリッドレプリコンに対する EC 50 値は 1.8~7.6 nm の範囲であった ジェノタイプ 2b 及び 3a の NS3 配列をコードしたハイブリッドレプリコンに対する活性は低下し その EC 50 値はそれぞれ 0.48 μm 及び 1.16 μm であった また アスナプレビルはジェノタイプ 2a の感染性 HCV の複製を EC 50 値 39 nm で阻害した この値はジェノタイプ 2a のサブゲノムレプリコンアッセイで観察された EC 50 値 230 nm に比べて 1/6 であったことから 感染性 HCV に対する活性はサブゲノムレプリコンアッセイに比べて 6 倍強力であることが示唆された アスナプレビルのジェノタイプ 1b レプリコンに対する EC 50 値が 40% ヒト血清存在下では 6.5 倍に増大し その活性は軽度に低下した アスナプレビルは HCV の複製を選択的に阻害し 同属のペスチウイルス属であるウシウイルス性下痢ウイルス (BVDV) に対する EC 50 値は 12 μm また HCV とは関連のない RNA ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス (HIV)-1 ヒトライノウイルス (HRV) 及びヒトコロナウイルス (HCoV) に対する EC 50 値はそれぞれ 14 μm, 100 μm 超及び 100 μm 超であった アスナプレビルの種々のヒト細胞株に対する細胞毒性を検討した結果 50% 細胞毒性濃度 (CC 50 ) 値は 11~38 μm の範囲であり ジェノタイプ 1 の HCV レプリコンで観察された EC 50 値に比して 2750 倍以上高く その治療係数は著明に大きいものであった 組換え酵素を用いた作用機序解明試験において アスナプレビルは NS3/4A プロテアーゼ複合体の活性を競合的な様式で阻害した 即ち アスナプレビルは酵素の活性部位において基質と競合する阻害薬の特徴を有していた ジェノタイプ 1 の 3 種の HCV 分離株の NS3/4A プロテアーゼについて算出された阻害定数 (K i ) は 0.24~1.0 nm の範囲であった アスナプレビル存在下で HCV サブゲノムレプリコン細胞を培養した結果生じた耐性を同定し その特徴について検討した 耐性化したジェノタイプ 1a レプリコンの NS3 プロテアーゼドメインの遺伝子解析の結果 活性部位アミノ酸残基の 3 ヵ所に置換が認められた これらは R155K( アルギニンがリジンに置換 ) D168G( アスパラギン酸がグリシンに置換 ) 及び I170T( イソロイシンがスレオニンに置換 ) であった ジェノタイプ 1a の組換えレプリコンにおける R155K 及び D168G は中等度の耐性を示したが (EC 50 値が野生型のそれぞれ 21 倍及び 14 倍 ) I170T は軽度の耐性を示したのみであった (EC 50 値が野生型の 5 倍 ) これら 3 ヵ所のアミノ酸残基に置換を有するレプリコンでは複製障害が認められた ジェノタイプ 1b レプリコンでは NS3 プロテアー

11 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 8 ゼの 168 番目のアスパラギン酸の アラニン (A) グリシン(G) ヒスチジン(H) バリン(V) 又はチロシン (Y) への置換が耐性の原因であることが確認された ジェノタイプ 1b の組換えレプリコンにおける D168 のこれらアミノ酸への置換は 中等度 ~ 高度な耐性を示したが (EC 50 値が野生型の 16 倍 ~280 倍 ) 本置換を有するレプリコンでは複製障害が認められた ジェノタイプ 1a 及び 1b の HCV 感染患者において検出された 他の NS3 プロテアーゼ阻害薬による耐性変異に対するアスナプレビルの活性を検討した交差耐性試験の結果 本薬のジェノタイプ 1a の変異に対する活性は 1/713~1/0.4 に また ジェノタイプ 1b の変異に対しては 1/280 ~1/0.4 に低下した 自然免疫反応を評価する細胞培養試験において HCV NS3/4Aによるインターフェロンβ(IFNβ) プロモーター活性化蛋白 (Cardif) の切断は レチノイン酸誘導遺伝子 I と相互作用する Cardif の作用を阻害し その結果 下流のインターフェロン調節因子 3(IRF-3) 経路の不活化及びそれに続く IFN 産生の阻害を引き起こす アスナプレビルは HCV NS3/4A による Cardif の切断を阻害し IFN 誘導遺伝子の転写を復活させる これらのデータは アスナプレビルによる NS3/4A プロテアーゼ活性の阻害作用が HCV ウイルスの複製を減少させるのみでなく 自然免疫反応を回復させる可能性があることを示唆している ジェノタイプ 1b の HCV サブゲノムレプリコンシステムを用いた薬剤併用試験において アスナプレビルはインターフェロン α(ifnα) 又はリバビリン あるいは他の抗 HCV 薬との併用により相加又は相乗の相互作用を示した ジェノタイプ 1a のサブゲノムレプリコンシステムを用いた試験でも アスナプレビルと IFNα 併用により同様な相互作用が認められた いずれの併用においても 抗ウイルス活性の拮抗や細胞毒性の増強はみられなかった アスナプレビル IFNα 及び NS5A 複製複合体阻害薬であるダクラタスビル塩酸塩 ( 以下 ダクラタスビル ) の 3 剤長期併用試験では ジェノタイプ 1a の野生型レプリコンも NS3 プロテアーゼ耐性置換である R155K を有するレプリコンも同様に HCV RNA の複製が抑制された 以上の結果は アスナプレビルが選択的な HCV NS3 プロテアーゼ阻害薬であり 他の抗 HCV 薬との併用投与が可能であることを示している アスナプレビルの臨床第 2/3 相用量は 軟カプセル 100 mg 1 日 2 回投与又は錠剤 200 mg 錠剤の 1 日 2 回投与である 第 3 相試験では軟カプセルが用いられたが 初期の臨床試験 ( 第 2 相試験を含む ) で用いた錠剤と同様の曝露量であることが確認されている ( ) 第 2/3 相用量における定常状態でのアスナプレビルの曝露量 ( 以下 ヒト曝露量 ) は 最高血漿中濃度 (Cmax) μg/ml 血漿中濃度曲線下面積(AUC)3.69 μg h/ml であった (CTD ) In vitro 及び in vivo での心血管系安全性薬理評価を安全性薬理試験で実施し また in vivo での心血管系 中枢神経系及び呼吸系の安全性薬理評価を主要な毒性試験の一部として実施した アスナプレビル単剤又はダクラタスビルとの併用投与で実施した結果 アスナプレビルはヒト曝露量の in vitro 試験で 1500~22680 倍 また in vivo 試験で 36~430 倍でも影響を及ぼさなかったことから 本薬がヒトの心血管系 中枢神経系及び呼吸系に対して有害事象を引き起こす可能性は低いことが示唆された 以上 アスナプレビルの薬理学的プロファイルは 本薬が HCV の強力かつ選択的な阻害薬で

12 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 9 あり NS5A 阻害薬であるダクラタスビルを含む他の抗 HCV 薬との併用投与により C 型慢性肝 炎患者に対する新規治療法となることが示唆された

13 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 10 2 薬効を裏付ける試験 2.1 酵素活性及び特異性 HCV NS3 プロテアーゼは NS3 の N 末端ドメインにコードされるセリンプロテアーゼである 本蛋白は補因子である NS4A 蛋白とともにヘテロ二量体酵素を形成している 1) NS3/4A プロテアーゼ複合体に対するペプチド類似阻害薬のデザインは その酵素が基質ペプチドから放出される C 末端側産物ではなく N 末端側産物によるフィードバック阻害を受けやすいという知見によって決定された アスナプレビルに代表される BMS の阻害薬は 効力と選択性のいずれをも最大化するように 最適化したトリペプチド阻害薬の中心部を利用している アスナプレビルの HCV ジェノタイプに対する網羅性を評価するため 主要な 6 種のジェノタイプの HCV NS3 プロテアーゼに対する IC 50 値を調べた その結果 IC 50 値は 0.3~320 nm の範囲であった ( 表 2.1-1) アスナプレビルの in vitro 効力を既承認の NS3/4A プロテアーゼ阻害薬であるテラプレビルを対照に評価した 2) アスナプレビルの in vitro 効力は ジェノタイプ 2b 以外の試験したすべてのジェノタイプに対し 全般的にテラプレビルよりも優れていた 表 In vitroにおけるアスナプレビルの主要 6 種のHCVジェノタイプを有する組換え HCV NS3/4Aプロテアーゼに対する効力 ジェノタイプ ( 株 ) アスナプレビル IC 50 (nm) テラプレビル IC 50 (nm) 1a(BMS) 1.8 ± ± 2 1a(H77) 0.7 ± ± 7 1b(J4L6S) 0.3 ± ± 6 2a(HC-J6) 15 ± ± 17 2b(HC-J8) 78 ± ± 1 3a(S52) 320 ± ± 4 4a(ED43) 1.6 ± ± 1 5a(SA13) 1.7 ± ± 3 6a(HK-6A) 0.9 ± ± 2 出典 :CTD プロテアーゼの基質特異性決定基は 一般的に切断部位に隣接する側鎖と定義される 3) 自然状態の HCV NS3/4 プロテアーゼ複合体のトランス切断基質は 易切断結合の P1 位にシステイン残基が存在するという厳密な必要条件を示す この特殊な必要条件により 高い選択性を有する HCV プロテアーゼ阻害薬を開発することが可能となる 体内には多くのプロテアーゼが存在するため 治療薬としてデザインされたプロテアーゼ阻害薬については選択性が重要なものとなる アスナプレビルの HCV NS3/4 プロテアーゼ複合体に対する選択性を 構造的及び機序的に関連する複数のプロテアーゼに対する阻害作用を評価して検討した ( 表 2.1-2) アスナプレビルは HCV と近縁関係にある GBV-B の NS3 プロテアーゼ及びヒトのセリン又はシステインプロテアーゼに対し ほとんどあるいは全く活性を示さなかったことから [ アスナプレビルのジェノタイプ 1a (BMS 株 ) の HCV NS3 プロテアーゼに対する効果と比較した場合 その選択指数は 倍以上 ] 本薬が HCV NS3 セリンプロテアーゼに対して選択的であることが示された In vitro におけるアスナプレビルの選択性は BMS ( テラプレビルの P1 プロピル官能基位光学異性体の

14 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 11 混合物 ) よりも優れていた 表 In vitro におけるアスナプレビルのセリン及びシステインプロテアーゼに対する 効力 プロテアーゼ アスナプレビル IC 50 (μm) BMS IC 50 (μm) HCV 1a NS3/4A(BMS 株 ) ± ± GBV-B NS3/4A 21.2 ± ± 0.01 Human Sputum Elastase > ± 0.11 PPE > ± 0.3 Human Chymotrypsin > ± 8.2 Human Cathepsin B > ± 0.18 PPE:Porcine pancreas elastase( ブタ膵エラスターゼ ) 出典 :CTD 抗 HCV 活性アスナプレビルの HCV RNA の複製に及ぼす影響を評価するため HCV レプリコンシステム 4) を用いた 本薬のジェノタイプ 1a, 1b, 2a の HCV レプリコン及びジェノタイプ 2b, 3a, 4a の NS3 プロテアーゼ配列をコードしたハイブリッドレプリコンに対する活性を検討した結果を表 に示した レプリコンにおける抗 HCV 活性及び算出された治療係数について アスナプレビルはジェノタイプ 1a, 1b 及び 4a のレプリコンに対し テラプレビルよりも強力な作用を示した 一方 ジェノタイプ 2b, 3a のハイブリッドレプリコンに対するアスナプレビルの効果は テラプレビルと同等であった 表 HCV レプリコンアッセイにおけるアスナプレビルのジェノタイプ網羅性 HCV レプリコンジェノタイプ ( 株 ) Stable Cell Line or Transient Assay 検出法 アスナプレビル EC 50 (nm) テラプレビル EC 50 (nm) 1a(H77) Stable Cell Line Luciferase 4.0 ± ± 11 1b(Con 1) Stable Cell Line Luciferase 1.2 ± ± 3 1b(Con 1) Stable Cell Line FRET 2.9 ± ± 21 2a(JFH-1) Stable Cell Line FRET 230 ± ± 32 3a(S52) Stable Cell Line Luciferase 1162 ± ± 188 2a(JFH-1) Transient Luciferase 67 ± ± 12 2b(HC-J8) Transient Luciferase 480 ± ± 96 1b(Con 1) Transient Luciferase 1.3 ± ± 77 4a(ED43) Transient Luciferase 1.8 ± ± 223 1b(Con 1) Stable Cell Line CC 50 (nm) Fluorescence ± 2000 > 治療係数 > 175 治療係数 = ジェノタイプ 1b(Con 1) レプリコン細胞における CC 50 / EC 50 (FRET) 出典 :CTD 及び CTD

15 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 12 アスナプレビルの感染性 HCV ジェノタイプ 2a(JFH-1) ウイルス 5) に対する抗ウイルス活性を検討した アスナプレビルは EC 50 値 39 nm でウイルス産生を阻害し テラプレビルの EC 50 値である 116 nm よりも強い活性を示した (CTD ) アスナプレビルのウイルス特異性を評価するため 様々なウイルスに対する検討を行った 細胞培養試験において アスナプレビルは BVDV(EC 50 = 12 μm) HIV-1(EC 50 = 14 μm) HRV(EC 50 > 100 μm) 及び HCoV(EC 50 > 100 μm) に対してほとんどあるいは全く活性を示さなかった (CTD ) 抗ウイルス薬の臨床効果は血清蛋白との結合によりしばしば減弱する そこで アスナプレビルの抗ウイルス活性に及ぼす血清蛋白結合の影響を調べるため 40% ヒト血清を含む培養液中においてレプリコンアッセイを実施した その結果 アスナプレビルのジェノタイプ 1b(Con 1) レプリコンに対する EC 50 値が 40% ヒト血清を含まない標準的なアッセイの場合と比較して 6.5 倍に増大したことから 本薬の抗ウイルス活性はヒト血清により軽度にしか変化しないことが示唆された BMS の抗ウイルス活性も アスナプレビルの場合と類似した変化であった (EC 50 値が 6.8 倍に増大 ) 2.3 細胞毒性アスナプレビルの細胞毒性を解剖学的に異なる起源のヒト細胞株を用いて検討した 4~6 日間培養後に CC 50 値を測定した 結果の概略を表 に示した アスナプレビルの細胞毒性は BMS と同程度であったが HCV ジェノタイプ 1a(H77) レプリコンに対する EC 50 値との比から算出した治療係数は 本薬の方が著明に高かった (2750 以上 ) 表 多様な起源のヒト細胞株に対するアスナプレビルの細胞毒性 細胞株解析由来組織 アスナプレビル (μm) BMS (μm) HCV ジェノタイプ 1a レプリコン (H77) EC 50 肝 ± ± HuH-7 CC 50 肝 25 ± ± 14 HepG2 CC 50 肝 38 ± ± 1.1 MT2 CC 50 T リンパ球 34 ± ± 0.6 MRC5 CC 50 肺 32 ± HeLa CC 50 子宮頸部 19 ± ± 17 HEK-293 CC 50 胎児腎 11 ± 出典 :CTD 作用機序アスナプレビルの作用機序について 組換え酵素アッセイを用いて複数の HCV ジェノタイプ 1 分離株の NS3/4A プロテアーゼ複合体で検討した 純粋な組換え NS3/4A プロテアーゼ複合体に対し アスナプレビルは競合的阻害薬の速度論的パラメータの特徴を示した (CTD ) これは 最大酵素代謝回転率が一定の間 基質に対するみかけの Michaelis-Menten 定数が増加した Lineweaver-Burke プロットにより確定された 試験したウイルス株により K i 値は 0.24~1.0 nm

16 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 13 の範囲を示した この競合的阻害様式は その後に実施した X 線結晶構造解析によって裏付けられた (CTD ) アスナプレビルは NS3 プロテアーゼドメインの活性部位である S4 から S1 結合部位 6) を占拠していた これらのサブサイトは 通常 HCV の基質によって占有されると考えられる 2.5 耐性アスナプレビルの耐性機序を把握するため HCV サブゲノムレプリコンシステムを用いて臨床で発現する耐性置換の特定及びその特徴を明らかにした また テラプレビル及び boceprevir(ns3 プロテアーゼ阻害剤 国内未承認 ) といった NS3 プロテアーゼ阻害薬の臨床での耐性変異をジェノタイプ 1a 及び 1b のレプリコンに発現させ アスナプレビルの阻害作用に対する感受性を評価した 表現型解析の結果 ウイルス学的ブレイクスルーを起こしたジェノタイプ 1a レプリコンの感受性は ジメチルスルホキシド (DMSO) を対照とした野生型細胞の場合の約 1/49~1/11 であった 耐性レプリコン群の NS3 及び NS4A 蛋白の遺伝子型解析の結果 NS3 プロテアーゼドメイン内に多数の非保存的変化がみられた これらの置換は T40A, Q41E, V51A, R62K, D79E, T95A, I114V, R123G, R155K, D168G, I170T, N174Y, L175P 及び G176E であった ( 表 2.5-1)(CTD ) 表現型解析の結果 ウイルス学的ブレイクスルーを起こしたジェノタイプ 1b レプリコンの感受性は DMSO を対照とした野生型細胞の場合に比べて約 1/400~1/170 に低下した (CTD ) 耐性レプリコン群の NS3 及び NS4A 蛋白の遺伝子型解析の結果 NS3 プロテアーゼドメイン内に非保存的変化がみられた これらの置換は Q41R, Q80R, Q86R, P89L, Y105C, D168A/G/H/V/Y, E173G 及び E176G であった ( 表 2.5-1)(CTD ) 発現した置換の多くは 本薬の結合部位周辺に存在することが X 線結晶構造解析試験によって確認された (CTD )

17 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 14 表 アスナプレビル耐性レプリコンの遺伝子型及び表現型解析 HCV レプリコン株 EC 50, nm 主要な NS3 (EC 50 値の変化倍率 ) プロテアーゼ置換 a 頻度 1a(H77) 6.5 ± 2.2(1) - - アスナプレビルの EC 50 値の 10 倍の濃度で発現 した 1a 変異 (Colony 1) アスナプレビルの EC 50 値の 10 倍の濃度で発現した 1a 変異 (Colony 2) アスナプレビルの EC 50 値の 30 倍の濃度で発現した 1a 変異 b 阻害薬周辺残基 91 ± 39(13) V51A 1/9 D79E 1/9 T95A 1/9 R155K 8/9 R155K I170T 1/9 I170T 77 ± 26(11) Q41E 1/9 R62K 1/9 I114V 1/9 D168G 3/9 D168G I170T 4/9 I170T N174Y 1/9 315 ± 72(49) T40A 1/10 R123G 1/10 R155K 4/10 R155K I170T 5/10 I170T L175P 1/10 G176E 1/10 1b(Con 1) 3(1) Q41R - Q86R - アスナプレビルの EC 50 値の 10 倍の濃度で発現した 1b 変異 a b アスナプレビルの EC 50 値の 30 倍の濃度で発現した 1b 変異 ( ) Q41R 6/10 Q86R 10/10 D168G/A/H 5/10;1/10;1/10 D168G/A/H E173G 1/10 E176G 1/ ( ) Q41R 7/12 Q80R 1/12 Q80R Q86R 10/12 P89L 1/12 Y105C 1/12 D168V/G/A/Y 7/12; 3/12; 1/12; 1/12 D168V/G/A/Y 比は配列を決定したクローン総数に対する観察されたアミノ酸置換の 2 つの別々の RT-PCR 反応から得られた プラスミドクローン数を示す 結合したアスナプレビルの最も近くで同定されたアミノ酸残基の位置は 別々のクローンで観察された 出典 :CTD 及び CTD アスナプレビル耐性レプリコンは NS5A 阻害薬のような HCV の複製サイクルにおける他のウイルス蛋白を標的とする HCV 阻害薬に対する感受性を維持している (CTD ) このことは 複数のウイルス蛋白を標的とする薬剤と組み合わせることにより アスナプレビルによる治療中に発現し得る耐性ウイルスに対しても治療が期待できることを示唆している HCV NS3 プロテアーゼに結合したアスナプレビルのコンピューターモデルを用いた解析の結果 Q80, R155, D168 及び I170 のアミノ酸における置換が酵素活性部位の近傍において優先的に認められた これらの置換は いずれも種々の NS3 プロテアーゼ阻害薬の耐性に関連することが以前に報告されている 7)8)9) D168 は切り出された NS3/4A プロテアーゼ複合体とアスナプレビルの X 線結晶構造において 酵素活性部位の S2 及び S4 ポケットの間に存在している D168 のア

18 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 15 ラニン グリシン バリン又はチロシンのようなアミノ酸残基への置換は アスナプレビルの P2 イソキノリン部分との相互作用に重要な R155 との塩橋の形成を妨害することが予測された (CTD ) 構造解析の結果 I170 のアミノ酸がアスナプレビル結合時の R155 と D168 の塩橋関係周辺のポケット形成部分である R155 の頭部基と相互作用を有することが示された 10) I170 がより極性の高いスレオニンへ置換されることにより R155 の周辺環境を変化させると考えられ その結果 アスナプレビルの P2 イソキノリン部分との相互作用が軽度に減少した 変異を有するレプリコンの作製により アスナプレビル耐性におけるこれらの置換の役割が裏付けられた ( 表 2.5-2)(CTD 及び CTD ) 表 遺伝子工学的 HCV 変異レプリコンのアスナプレビル感受性及び複製能 NS3 変異レプリコン 複製能 アスナプレビル EC 50 (nm) 野生型の EC 50 に対する変化倍率 テラプレビル EC 50 (nm) NS5A 阻害薬 EC 50 (pm) 1a(H77) ± ± ± 0.6 1a-V36A ± ± 241 1a-V36L ± ± 427 1a-V36M ± ± a-T54A ± ± 209 1a-T54S ± ± 150 1a-Q80K ± ± 75 1a-R155K 7 16 ± ± ± 0.4 1a-V36M + R155K 5 42 ± > ± 1.3 1a-D168G 2 11 ± ± ± 1.2 1a-D168V ± ± 10 1a-Q80K + D168V ± ± 37 1a-I170T ± ± ± 0.3 1b(Con 1) ± ± 41 1b-V36A ± ± 281 1b-V36L ± ± 19 1b-T54A ± ± 31 1b-T54S ± > b-Q80K ± ND 1b-Q80L ± ± 14 1b-Q80R ± ± 19 1b-A156S ± ± 624 1b-A156T ± 1 6 > b-A156V 3 17 ± 2 20 > b-D168A ± ± 4 1b-D168G ± ± 12 1b-D168V ± ± 7 1b-D168Y ± ± 43 1b-V170A ± ± 237 出典 :CTD 及び CTD アスナプレビルに対するレプリコンの耐性プロファイルは テラプレビルや boceprevir について報告されているものとわずかに異なる (CTD ) 7)8) テラプレビルや boceprevir の耐性レプリコンでは V36 及び A156 のアミノ酸残基に変化がみられた 臨床試験において報告された 1 ヵ所又は 2 ヵ所の重要なアミノ酸置換 2) を含むように遺伝子操作した薬剤耐性レプリコンに対する交差耐性データを表 にまとめた (CTD ) 概して アスナプレビルはテラプ

19 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 16 レビルに比べて良好な耐性プロファイルを示した 一方 A156 のアミノ酸残基に変異を有するレ プリコンに対するテラプレビルの効力は アスナプレビルに比べて著明に低下した 2.6 併用試験テラプレビルの臨床試験において C 型慢性肝炎患者にテラプレビルを単剤投与した場合には 高い頻度で耐性が発現した 8) HIV 治療と同様に C 型慢性肝炎治療においても併用療法により耐性発現を効果的に防御できると考えられる アスナプレビルが他の抗 HCV 薬と併用投与が可能か否か HCV レプリコンシステムを用いて検討した HCV ジェノタイプ 1b のレプリコン細胞をアスナプレビルと IFNα 又はリバビリン あるいはダクラタスビルやと併用した場合 相加又は相乗効果が認められた ( 表 2.6-1)(CTD 及び CTD ) アスナプレビルとダクラタスビルとの併用による代表的な実験結果を表 に示した (CTD ) 表 HCV レプリコンにおけるアスナプレビル併用試験 IFNα IFNα + (IFNα-2b) リバビリンダクラタスビルダクラタスビル相加又は相乗相加相加又は相乗相加又は相乗 ダクラタスビル + 併用効果の判定 : アスナプレビルの単独及び他剤との併用時の EC 50, EC 75 及び EC 90 を求め イソボログラム法にて併用係数 (Combination index) を算出するとともに各併用係数の信頼区間を求めた 信頼区間の下限が 1 を超えた場合を阻害効果 上限が 1 以下の場合を相乗効果 区間に 1 を含む場合を相加効果と判定した 出典 :CTD 及び CTD 表 アスナプレビルとダクラタスビルとの併用効果 ASV EC 50 (nm) DCV EC 50 (nm) Molar Ratio a, DCV to ASV Combination Indicies (confidential interval) EC 50 EC 75 EC 90 結果 : : (0.57, 0.73) 0.77 (0.69, 0.86) 0.72 (0.60, 0.84) 0.77 (0.65, 0.89) 0.82 (0.60, 1.04) 0.80 (0.60, 0.99) 相乗 / 相加効果 相乗効果 a 1 : (0.51, 0.63) 0.61 (0.52, 0.70) 併用試験におけるアスナプレビルに対するダクラタスビルのモル比 0.68 (0.52, 0.84) 相乗効果 ASV: アスナプレビル DCV: ダクラタスビル EC 50 及び EC 75 で相乗効果 EC 90 で相加効果が認められた 出典 :CTD HCV ジェノタイプ 1a のレプリコン細胞にアスナプレビルと IFNα を併用した場合 HCV ジェノタイプ 1b レプリコンの場合と同様に 相乗効果又は相加効果を示す結果が得られた (CTD

20 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page ) 検討したすべての併用試験において相加又は相乗効果が認められ 抗ウイルス活性の拮抗は認められなかった これらの結果から アスナプレビルは他の抗 HCV 薬との併用により C 型慢性肝炎に対する有効な治療薬となる可能性が示唆された ジェノタイプ 1a-NS3 の野生型レプリコン及びジェノタイプ 1a-NS3-R155K の NS3 プロテアーゼ阻害薬耐性レプリコンに アスナプレビルとダクラタスビル及び IFNα を長期間 (25 日間 ) 併用すると いずれのレプリコンの複製も同等に抑制された (CTD ) これらの結果は アスナプレビルとダクラタスビル及び IFNα の投与レジメンが テラプレビルや boceprevir を含む治療法が無効であった C 型慢性肝炎患者において HCV RNA の複製を抑制できる可能性を示唆している

21 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 18 3 副次的薬理試験 HCV の持続感染は HCV が宿主免疫を回避し IFNα/β のウイルス防御に拮抗する能力を反映している HCV NS3 プロテアーゼは IRF-3 の活性化及び正常な核内転位を阻害し その結果 IFN 誘導遺伝子の転写を著明に減少させる アスナプレビルは HCV NS3 プロテアーゼによる Cardif の切断を阻害することにより IRF-3 活性化の抑制を阻害し HCV NS3 プロテアーゼを介した IFN 誘導遺伝子の転写抑制を用量依存的に回復させた ( 図 3-1)(CTD ) 図 3-1 アスナプレビル (BMS ) による HCV NS3/4A を介した IFN 反応抑制の阻 害 出典 :CTD

22 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 19 4 安全性薬理試験 ICH S7A ガイドラインで推奨される心血管系 中枢神経系及び呼吸系の各指標に及ぼすアスナプレビルの影響について 一連の in vitro 及び in vivo 安全性薬理試験を実施し また 単回投与毒性及び反復投与毒性試験の一部として評価した In vitro 試験では受容体及びイオンチャネルのリガンド結合並びに酵素活性の相対的阻害を評価した 心血管系については herg/ikr 電流及び心筋イオンチャネル ウサギプルキンエ線維の活動電位 摘出ウサギ心臓に及ぼす影響を in vitro 試験で評価し 麻酔下ウサギを用いた単回投与試験及びイヌを用いたテレメトリー試験により心血管系パラメータに及ぼす影響を in vivo で評価した アスナプレビルの曝露量がサルに比べてイヌの方が高かったため 安全性薬理試験にはイヌを用いた アスナプレビルの代謝プロファイルが毒性試験に用いた動物種及びヒトにおいて質的に類似しており また ヒトに特有の代謝物も検出されなかったことから 代謝物の安全性薬理試験は実施しなかった 4.1 受容体 / イオンチャネル結合及び酵素アッセイアスナプレビルの多様な受容体 酵素及びイオンチャネルへのリガンド結合阻害作用を in vitro 試験において評価した (CTD ) アスナプレビル 10 μm(7.5 μg/ml) の 37 種類の薬理学的標的 ( 受容体 酵素 イオンチャネル セカンドメッセンジャー及び取込み部位 ) に対する作用をアッセイパネル (MDS Pharma Screen) を用いて評価した これらの試験において アスナプレビルは評価した広範な薬理学的受容体 イオンチャネル トランスポーター又は酵素に対して相互作用を示さなかった 本質的に蛋白を含まないこれら試験におけるアスナプレビル 10 μm(7.5 μg/ml) の濃度は 第 2/3 相用量投与時のヒトでのアスナプレビル遊離体 ( 以下 ヒト遊離体 ) の Cmax(0.005 μg/ml)(ctd ) の 1500 倍であることから 本薬がヒトにおいて有害事象を引き起こす可能性は低いことが示唆された 4.2 心血管系アスナプレビルの心筋カリウムチャネル (herg/ikr) ナトリウムチャネル(SCN5A) 及び L 型カルシウムチャネル電流並びにウサギプルキンエ線維活動電位に及ぼす影響を in vitro 試験で検討した (CTD ) イオン電流の測定は ホールセルパッチクランプ法を用いて実施し プルキンエ線維活動電位は標準的微小電極法を用いて記録した 組換えイオンチャネル [herg ナトリウム (SCN5A) 及び L 型カルシウム (Ca v 1.2)] は胎児腎細胞株 (HEK-293) に安定発現させた herg アッセイでは アスナプレビルの 10 及び 30 μm(7.5 及び 22.5 μg/ml) を試験に用いた 本薬の効果は最大末尾電流の阻害測定により算出した ナトリウムチャネルアッセイでも同様に 10 及び 30 μm を用い その効力を最大内向き電流の阻害測定により算出した ナトリウムチャネルに及ぼすアスナプレビルの頻度依存性効果を 1 及び 4 ヘルツ (Hz) の 2 つの刺激頻度を用いて評価した L 型カルシウムチャネルアッセイでは アスナプレビルの 30 μm を試験した カルシウムチャネルに及ぼす影響は 最大内向き電流の阻害測定により算出した アスナプレビルの

23 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 20 再分極に及ぼす影響を検討するため 摘出ウサギプルキンエ線維の活動電位を記録した ウサギプルキンエ線維アッセイでは アスナプレビルの 3, 10 及び 30 μm(2.2, 7.5 及び 22.5 μg/ml) を試験した 活動電位パラメータとして 静止膜電位 オーバーシュート 最大立ち上がり速度 50% 及び 90% 再分極までの時間 ( それぞれ APD 50 及び APD 90 ) 測定した アスナプレビルは心筋イオンチャネルに対して軽度な阻害作用を示した 本薬は 10 及び 30 μm で herg カリウム電流をそれぞれ 8.2% 及び 20.6% 阻害し IC 50 値は 30 μm 超であった アスナプレビルは 10 及び 30 μm で 心筋ナトリウム電流を 1 Hz 刺激頻度で 26.6% 及び 65.9% また 4 Hz 刺激頻度の場合では 29.8% 及び 71.6% 阻害した さらに アスナプレビルは L 型カルシウム電流を 30 μm で 18.3% 阻害した ウサギプルキンエ線維アッセイにおいて アスナプレビルは 30 μm 以下の濃度では活動電位持続時間及び他の活動電位パラメータに影響を及ぼさなかった 以上より アスナプレビルは 10 μm で herg/ikr ナトリウム及び L 型カルシウム電流を軽度に阻害し また 30 μm でプルキンエ線維活動電位パラメータには影響を及ぼさなかった ヒト遊離体 Cmax が μg/ml(ctd ) であることから 上記の軽度なイオンチャネル阻害 (herg) はヒト遊離体 Cmax の 1500 倍という高濃度で認められたものであり また ヒト遊離体 Cmax の 4500 倍という高濃度でも活動電位持続時間に影響を及ぼさなかったことから 本薬がヒトの心電図に影響を及ぼす可能性は低いことが示唆された 摘出ウサギ心臓における電気生理学的試験では アスナプレビルを大動脈の逆行性灌流により注入し 右心房を 3.5, 4, 4.5 及び 5 Hz でそれぞれ 30 秒間刺激した (CTD ) 500 Hz における心房電位図 心電図及び冠灌流量を継続的に記録した 洞房結節機能を洞結節回復時間及び心拍数測定により評価した アスナプレビル 10 μm(7.5 μg/ml) の処置時間を短時間 (20 分 ) 及び長時間 (60 分 ) とし いずれもアスナプレビル処置前及び灌流中 10 分間隔で解析を行った 試験終了時に心房内及び心室内のアスナプレビル濃度を測定した 摘出ウサギ心臓において アスナプレビル 10 μm(7.5 μg/ml) を 60 分以下で灌流した場合の心房及び心室のアスナプレビル濃度はそれぞれ 93.4 μm(69.9 μg/ml) 及び μm(113.4 μg/ml) であったが 洞房結節機能や冠動脈灌流量に本薬に関連した変化は認められなかった これら心房内及び心臓内のアスナプレビル濃度は ヒト遊離体 Cmax のそれぞれ 倍及び 倍という高濃度であったことから 上記の結果は 本薬がヒトに心血管系の作用を引き起こす可能性が低いことを示唆するものである 麻酔下ウサギを用いた in vivo の心臓電気生理学的試験において アスナプレビルを漸増法により静脈内投与した (CTD ) 成熟雄性ウサギをプロポフォールとフェンタニルで麻酔した 溶媒 [ ポリエチレングリコール 400(PEG 400): エタノール = 9:1] 又はアスナプレビル 3, 10 及び 30 mg/kg の 5 分間持続投与中 継続的に心内電位図 体表面心電図及び血圧を記録した 加えて 心拍数 動脈血圧 洞結節回復時間及び心電図パラメータを各用量の持続投与前後に測定した 各用量の持続投与終了後に血液を採取してアスナプレビルの血漿中濃度を測定し 30 mg/kg の投与終了 60 分後に心臓及び肝臓を採取した アスナプレビル 3, 10 及び 30 mg/kg の静脈内持続投与後 アスナプレビルの曝露量は用量依存的に増加した 30 mg/kg 投与終了直後及び投与終了 60 分後の平均血漿中濃度は それぞれ 180

24 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 21 μg/ml 及び 27.4 μg/ml であった アスナプレビルの血漿に対する心臓の平均濃度比が 1.2 であったことから 本薬の心組織への蓄積は少ないことが示された アスナプレビル 30 mg/kg 以下の用量 ( 血漿中濃度は 180 μg/ml 以下 ) では 心電図パラメータに影響はみられなかったが 軽微で一過性の用量依存的な血圧上昇が認められた ( 各用量でそれぞれ投与前値に比して 10% 21% 及び 24% の上昇 ) アスナプレビル持続投与後の平均血漿中濃度は 15~180 μg/ml であり ヒト曝露量 Cmax μg/ml(ctd ) の 36~430 倍であった イヌにおける単回経口投与心血管系テレメトリー試験 (CTD ) では テレメトリー装置を装着した雌雄各 3 匹のイヌに溶媒 [60% PEG % d-α トコフェロールポリエチレングリコール 1000 コハク酸 ] を投与して対照とし 1 日後にアスナプレビルの 100 mg/kg を投与した 心拍数 全身動脈血圧 ( 収縮期 拡張期及び平均血圧 ) 左心室圧( 収縮期及び拡張末期圧 ) 左心室圧導出パラメータ (+dp/dt, dp/dt) 心電図パラメータ (P 波持続時間 PR, RR, QRS 及び QT 間隔 ) 身体活動及び深部体温を溶媒又はアスナプレビルの投与前及び投与およそ 21 時間後にそれぞれ 1 時間継続的に観察した 心電図上の QT 間隔を 試験前の基準値から得られた個々の QT-RR 相関を基に算出した心拍数の 80 拍 / 分 (QTc) で補正した 追加のパラメータとして アスナプレビルの投与 4 時間後及び 8 時間後の臨床症状及び血漿中濃度を評価した アスナプレビルの投与 4 時間後における血漿中アスナプレビル濃度は雌に比べて雄で低かった アスナプレビルの平均血漿中濃度を表 に示した 表 アスナプレビル投与後のアスナプレビルの平均血漿中濃度 用量 (mg/kg) 投与後の時間 アスナプレビルの濃度 μg/ml(μm) 雄雌平均 時間 43.7 (58.4) 70.4 (94.0) 57.0 (76.2) 時間 16.8 (22.4) 30.8 (41.2) 23.8 (31.8) 出典 :CTD アスナプレビル投与に関連した臨床所見は 糞の変化 ( 無形便 液状便 血性便及び粘液便 ) のみであり 3 日間の観察では 各日最高で雌雄各 2 例に認められた 心拍数 全身血圧及び左心室圧 心電図の各種波形間隔 (QTc 間隔を含む ) 身体活動及び深部体温にアスナプレビルの投与に関連した変化はみられなかった 以上 アスナプレビルは 100 mg/kg( 投与 4 時間後の平均血漿中濃度は 57 μg/ml 各個体では 35.2~73.4 μg/ml) では イヌの心血管系に影響を及ぼさなかった 本試験における投与 4 時間後のアスナプレビルの血漿中濃度 (57 μg/ml) は イヌの 9 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (CTD ) の 100 mg/kg/day における Cmax(50.3 μg/ml) と同等であった テレメトリー試験における投与 4 時間後の血漿中濃度はほぼ定常状態の Cmax であることから イヌの心血管系テレメトリー試験における無作用量での Cmax は ヒト曝露量 Cmax の 120 倍であった イヌの反復投与毒性試験においてもアスナプレビルの心血管系に及ぼす影響を検討した その結果 イヌの 1 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (CTD ) で 300 mg/kg/day まで 9 ヵ月間反

25 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 22 復経口投与毒性試験 (CTD ) で 100 mg/kg/day までの用量を投与しても心拍数及び心電図に本薬投与に関連した変化は認められなかった イヌの 1 ヵ月間反復投与毒性試験における 300 mg/kg/day 及び 9 ヵ月間反復投与毒性試験における 100 mg/kg/day 投与時の AUC は それぞれヒト曝露量 (AUC:3.69 μg h/ml)(ctd ) の 375 倍及び 82 倍 Cmax はヒト濃度 (Cmax: μg/ml)(ctd ) の 263 倍及び 120 倍であった 健康被験者への単回投与 (1200 mg 以下 AI 試験 ) 及び反復投与 (600 mg 以下 1 日 2 回を 14 日間 AI 試験 ) 並びに C 型慢性肝炎被験者に単回投与 (600 mg 以下 AI 試験 ) 及び反復投与 (600 mg 以下を 3 日間 AI 試験 ) した臨床試験において バイタルサインや心電図に一貫した変化あるいは臨床的に関連した傾向は認められなかった また 健康被験者を対象とした thorough QT 試験 ( AI 試験 ) において アスナプレビル軟カプセル 300 mg 1 日 2 回の 10 日間反復投与では QTc 間隔に臨床上懸念される変化はみられなかった また アスナプレビルをダクラタスビルとラット (CTD ) 又はサル (CTD 及び CTD ) に反復併用投与した場合でも 本薬投与に関連した心血管系への影響は認められなかった 以上 アスナプレビルが心血管系に影響を及ぼす可能性は低いことが示された 唯一認められた心血管系の作用は ヒト遊離体 Cmax の 1500 倍の濃度で認められた軽度な herg 阻害作用及びヒト曝露量 Cmax の 36 倍以上の濃度で認められた麻酔下ウサギの血圧上昇であった また 本薬は高曝露量でも プルキンエ線維活動電位持続時間 ( ヒト遊離体 Cmax の 4500 倍 ) ウサギ摘出心臓試験での心電図 ( ヒト遊離体 Cmax の最大 倍 ) イヌの単回経口投与毒性試験( ヒト曝露量 Cmax の 120 倍 ) 最長 9 ヵ月間の反復経口投与毒性試験 ( ヒト曝露量 AUC の最大 82 倍 ) 及びサルにアスナプレビルとダクラタスビルを最長 3 ヵ月間投与した併用投与毒性試験における心血管系パラメータ ( ヒト曝露量 AUC の最大 18 倍 ) のいずれに対しても影響を及ぼさなかった 4.3 中枢神経系アスナプレビルの中枢神経系に及ぼす影響を評価するための独立した安全性薬理試験は実施しなかった 有色 Long-Evans ラット及び白色 Sprague Dawley ラットに [ 14 C] アスナプレビルを投与した試験において 本薬の脳組織内濃度は定量下限未満であった (CTD ) 本結果と一致し マウス (CTD ) 及びラットの単回経口投与毒性試験 (CTD ) ラットの 1 ヵ月間 (CTD ) 及び 6 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (CTD ) イヌの 1 ヵ月間 (CTD ) 及び 9 ヵ月間反復口投与毒性試験 (CTD ) において 中枢神経系の臨床症状や神経組織の組織学的所見にアスナプレビル投与に関連した変化は認められなかった また アスナプレビルは イヌの 1 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (300 mg/kg/day 以下 ) 及び 9 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (100 mg/kg/day 以下 ) において 行動及び運動 末梢及び中枢神経機能に影響を及ぼさなかった さらに アスナプレビルの反復併用投与毒性試験において 本薬とダクラタスビルをラット (CTD ) 又はサル (CTD 及び CTD ) に投与した場合でも アスナプレビル投与に関連した中枢神経系の影響は認められなかった

26 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 23 上記の安全性薬理評価の結果 ヒト曝露量 AUC 及び Cmax(CTD ) のそれぞれ最大 375 倍及び最大 263 倍の高い曝露量でも薬剤投与に関連した影響は認められなかったことから 本薬 がヒトの中枢神経系に対して有害事象を惹き起こす可能性は低いと考えられた 4.4 呼吸系アスナプレビルの呼吸系に及ぼす影響を評価するための独立した安全性薬理試験は実施しなかった マウス及びラットの単回経口投与毒性試験 (CTD 及び CTD ) ラットの 1 ヵ月間及び 6 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (CTD 及び CTD ) 又はイヌの 1 ヵ月間及び 9 ヵ月間反復経口投与毒性試験 (CTD 及び CTD ) において 呼吸系の臨床症状にアスナプレビル投与に関連した変化は認められなかった イヌの 9 ヵ月間までの反復経口投与試験 (CTD ) において 100 mg/kg/day 以下の用量では 呼吸数及び肺音 ( 胸部聴診による判断 ) あるいは動脈血酸素飽和度 ( パルス酸素濃度計により測定 ) に本薬投与に関連した影響はみられなかった また アスナプレビルとダクラタスビルをラット (CTD ) 又はサル (CTD 及び CTD ) に反復併用投与した場合でも薬剤投与に関連した呼吸系の影響は認められなかった 上記の呼吸器系に対する評価の結果 ヒト曝露量 AUC 及び Cmax(CTD ) のそれぞれ最大 375 倍及び最大 263 倍の高曝露量でもアスナプレビル投与に関連した影響は認められなかったことから 本薬がヒトの呼吸系に対して有害事象を惹き起こす可能性は低いと考えられた

27 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 24 5 薬力学的薬物相互作用試験 HCV 感染患者の治療には 異なる HCV 蛋白を選択的に標的とする抗ウイルス薬の併用療法が必要と考えられる ウイルスゲノムが宿主細胞に組み込まれて宿主の免疫反応を回避しながら共存する HIV とは異なり HCV 感染患者ではウイルスを完全に排除できる可能性がある しかし HCV ではウイルス増殖の回転率が速く また RNA ポリメラーゼの校正機構が欠如しているため 遺伝子配列の不均一性は増大している よって HCV 感染患者には極めて類似はしているが異なる HCV が存在しており それにより HCV が免疫監視を逃れ また HCV 感染患者の大多数における持続感染を構築する 1 つの機序と推測される このことを考え合わせると HCV 治療においては 複数の抗 HCV 薬との併用投与を考慮すべきである 2.6 に記載したように アスナプレビルをダクラタスビル等の異なる作用機序を有する抗 HCV 薬と併用投与した場合 相加又は相乗効果が認められた

28 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 25 6 考察及び結論アスナプレビルは 6 種の主要な HCV ジェノタイプを有する細胞系の HCV NS3/4A プロテアーゼ複合体に対して強力な阻害作用を示した (IC 50 値 0.3~320 nm) 最も強力な作用はジェノタイプ 1 の NS3 プロテアーゼに対するものであった (K i 値 0.24~1.0 nm) アスナプレビルは複数のセリンプロテアーゼに対してほとんどあるいは全く活性を示さなかった このような選択性は HCV 感染患者における非特異的な副作用の軽減に重要と考えられる ジェノタイプ 1 及び 4 の NS3 プロテアーゼを有する HCV レプリコンに対し アスナプレビルはテラプレビルに比べて著明な阻害作用を示した (EC 50 値 1.2~7.6 nm) アスナプレビルの細胞培養試験における治療係数は大きく また 本薬の抗ウイルス活性は蛋白結合により軽度な影響を受けたのみであった アスナプレビルは NS3/4A プロテアーゼ複合体を競合的に阻害した これは本薬が NS3 プロテアーゼの活性部位を占有していた X 線結晶構造解析の結果によって裏付けられた 耐性株の分離と遺伝子解析の結果 アスナプレビルに対する NS3 の耐性はジェノタイプ及びそのサブタイプに依存することが示された ジェノタイプ 1a のレプリコンでは 主に R155K が認められ 一方 ジェノタイプ 1b のレプリコンでは D168 のアミノ酸置換が発現した テラプレビルの第 3 相試験 2) で特定された NS3 プロテアーゼの一連のアミノ酸置換に対し アスナプレビルは様々な程度の交差耐性を示した (EC 50 値が野生型の 1 倍未満 ~55 倍 )(CTD ) アスナプレビルは HCV NS3 プロテアーゼによる IRF-3 シグナル伝達経路における構成成分である Cardif の切断を阻害し 下流の IFN 誘導遺伝子の転写を用量依存的に回復させた これらの結果は アスナプレビルの NS3 プロテアーゼ活性阻害が HCV の複製を低下させるとともに宿主の自然免疫反応を回復させる可能性を示唆している アスナプレビルを IFNα 又は異なる HCV 蛋白の選択的阻害薬と併用した場合 相加又は相乗的な効果を示した また C 型慢性肝炎患者において アスナプレビルとダクラタスビルの併用投与が可能であることが示されている 11) HCV ジェノタイプ 1a の野生型レプリコン及びテラプレビル耐性アミノ酸配列を有するレプリコンに対し アスナプレビルはダクラタスビル及び IFNα との 3 剤併用で いずれのレプリコンの複製も同等に抑制した In vitro 及び in vivo における心血管系安全性薬理評価を安全性薬理試験で実施し また in vivo における心血管系 中枢神経系及び呼吸系の安全性薬理評価を主要な毒性試験の一部として実施した アスナプレビルの単剤投与又はダクラタスビルとの併用投与によるこれら非臨床試験の結果は ヒト曝露量の 1500~22680 倍 (in vitro 試験 ) 又は 36~430 倍 (in vivo 試験 ) に相当すると考えられることから 本薬がヒトの心血管系 中枢神経系及び呼吸系に対して有害事象を引き起こす可能性は低いことが示唆された 以上 アスナプレビルは HCV NS3 プロテアーゼに対する強力かつ選択的な低分子阻害薬であり HCV RNA の複製を阻害する 前述の非臨床薬理試験の結果から 本薬は NS5A 複製複合体阻害薬であるダクラタスビルを含む他の抗 HCV 薬との併用投与により C 型慢性肝炎患者に対する新規治療法となる可能性が示唆された

29 アスナプレビル 薬理試験の概要文 Page 26 7 参考文献 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) Failla C, Tomei L, De Francesco RJ. An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A. J Virol 1995; 69: Incivek (telaprevir) Prescribing label.food and Drug Administration. May Accessed online at Neurath H. The diversity of proteolytic enzymes. In: Beynon RJ, Bond JS, editors. Proteolytic enzymes: A practical approach. IRL Press at Oxford University Press, 1989:1-13. Lohmann V, Korner F, Koch J, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: Wakita T, Pietschmann T, Kato T, et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nature Medicine 2005; 11: Schechter I, Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun 1967; 27: Lin C, Lin K, Luong YP, et al. In vitro resistance studies of hepatitis C virus serine protease inhibitors, VX-950 and BILN 2061: structural analysis indicates different resistance mechanisms. J Biol Chem 2004; 279: Tong X, Chase R, Skelton A, et al. Identification and analysis of fitness of resistance mutations against the HCV protease inhibitor SCH Antiviral Res 2006; 70: Sarrazin C, Kieffer TL, Bartels D, et al. Dynamic Hepatitis C Virus Genotypic and Phenotypic Changes in Patients Treated With the Protease Inhibitor Telaprevir. Gastroenterology 2007; 132: Koev G, Kati W. The emerging field of HCV drug resistance. Expert Opinion on Investigational Drugs 2008; 17: Lok AS, Gardiner DF, Lawitz E, et al. Preliminary Study of Two Antiviral Agents for Hepatitis C Genotype 1. New Engl J Med 2012; 366:

30 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 1 CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬理試験概要表 ブリストル マイヤーズ株式会社

31 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 2 目次 1 薬理試験 : 一覧表 効力を裏付ける試験 副次的薬理試験 安全性薬理試験 薬力学的薬物相互作用試験... 12

32 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 3 1 薬理試験 : 一覧表 Table : Type of Study Primary Pharmacodynamics Pharmacology Overview Test Article: Asunaprevir (BMS ) Test System Study No./ Method of Testing Document Administration Facility Number Control Location in Dossier Recombinant HCV genotype NS3/4A protease In vitro BMS CTD FRET-based assays monitoring proteolytic cleavage Recombinant serine and cysteine protease assays In vitro BMS CTD monitoring proteolytic cleavage Luciferase reporter or FRET signaling assays measuring In vitro BMS CTD HCV RNA replication in HuH-7 cells constitutively or CTD transiently expressing HCV (hybrid) replicons representing HCV genotypes 1 through 4 FRET signaling assay measuring HCV RNA replication in In vitro BMS CTD the presence of human serum Proliferation assays against a panel of cell lines In vitro BMS CTD Luciferase reporter assay measuring HCV RNA replication In vitro BMS CTD of infectious virus in HuH-7 cells Luciferase reporter and survival assays monitoring In vitro BMS CTD replication of non-hcv RNA viruses Recombinant HCV NS3/4A protease FRET-based assays In vitro BMS CTD monitoring proteolytic cleavage in the presence of different substrate concentrations Cell culture passage of HCV replicons in the presence of ASV; luciferase activity monitored in HuH-7 cells either constitutively or transiently expressing emergent HCV replicon resistance variants HCV replicon stable cell line and transient cell-based assays to monitor activity against NS3 protease clinical resistance variants HCV replicon cell-based assays to monitor effects of combining HCV inhibitors of different mechanisms In vitro BMS In vitro BMS In vitro BMS CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD Secondary Western immunoblotting measuring Cardif proteolytic In vitro BMS CTD Pharmacodynamics cleavage Safety Pharmacology NA In vitro DT07078/ CTD Receptors, enzymes, ion channels, and transporters

33 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 4 Table : Type of Study Cardiovascular, Electrophysiology Respiratory and Neurologic Cardiovascular, Neurologic, and Respiratory Pharmacology Overview Test Article: Asunaprevir (BMS ) Test System Study No./ Method of Testing Document Administration Facility Number Control Location in Dossier Human/HEK 293 cells and herg channel In vitro BMS DT07089/ CTD Human/HEK 293 cells and sodium channel (SCN5A) In vitro BMS DT07089/ CTD Human/HEK 293 cells and L-type calcium channel In vitro BMS DT07089/ CTD Rabbit/cardiac Purkinje fiber In vitro BMS DT07089/ CTD Dog/Beagle Oral (capsule) BMS DS07001/ CTD Rabbit/isolated heart In vitro BMS DT07013/ CTD Rabbit/NZW Intravenous BMS DT06116/ CTD Mouse/Crl:CD1 (ICR) Oral (gavage) BMS DM07027/ CTD Rat/Crl:CD (SD) Oral gavage BMS DM07024/ CTD Rat/Crl:CD (SD) Oral gavage DM08025/ CTD Rat /Crl: CD (SD) Oral gavage BMS DS08126/ CTD Dog/Beagle Oral (capsule) BMS DM07020/ CTD Dog/Beagle Oral (capsule) DM08026/ CTD Rat /Crl: CD (SD) Oral gavage BMS DS08126/ CTD Monkey/Cynomolgus Oral (gavage) BMS DS08143 CTD Monkey/Cynomolgus Oral (gavage) BMS DM09008 CTD Abbreviations: ASV = asunaprevir (BMS ), BMS = Bristol-Myers Squibb, CD = caesarean derived, FRET = Fluorescence resonance energy transfer, HCV = hepatitis C virus, HEK-293 = Human embryonic kidney cells, herg = Human ether a-go-go, L = long-lasting, NA = Not applicable, NZW = New Zealand White, NS3 = nonstructural protein 3, NS3/4A = nonstructural protein 3/nonstructural protein 4A, RNA = ribonucleic acid, SCN = sodium channel, SD = Sprague Dawley

34 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 5 2 効力を裏付ける試験 Table : Primary Pharmacodynamics Test Article: In Vitro Type of Study Test System Noteworthy Findings Testing Facility Anti-HCV NS3 protease activity Selectivity for HCV NS3 protease Anti-HCV activity in cell culture Human serum effect on anti-hcv potency Cytotoxicity Anti-HCV viral activity in cell culture Measured activity against purified recombinant HCV NS3/4A protease by monitoring the cleavage of a FRET-labeled peptide substrate loosely based on a cleavage site of authentic polyprotein Measured activity of respective purified recombinant proteases by monitoring the cleavage of their respective substrates Measured luciferase or FRET signals in HuH-7 cells either constitutively or transiently expressing HCV (hybrid) replicons Measured HCV RNA replication in HuH-7 cells constitutively expressing subgenomic HCV replicons Proliferation assays against a panel of cell lines Measured HCV RNA replication in HuH-7 cells infected with a full length infectious virus construct ASV exhibited IC 50 values of 0.3 to 320 nm against purified NS3/4A protease enzyme complexes generated from 9 strains representative of each of the 6 major genotypes. In a survey of 3 strains representative of GT-1, the compound exhibited IC 50 values ranging from 0.3 to 1.8 nm. GT-2 and GT-3 representatives were least susceptible (IC 50 values ranging from 15 to 320 nm). GT-4, GT-5, and GT-6 representatives exhibited IC 50 values ranging from 0.9 to 1.7 nm. ASV exerted minimal to no activity against the closely related viral serine protease, GBV-B NS3 protease, and a panel of 10 human serine and cysteine proteases. ASV exhibited EC 50 values ranging from 1 to 230 nm against HCV replicons representing GT-1a, GT-1b, and GT-2a. Against GT-2b and GT-3a NS3 protease replicon hybrids, ASV exhibited EC 50 values of 0.48 μm and 1.2 μm, respectively. Against genotype 4 NS3 protease replicon hybrids, ASV exhibited EC 50 values ranging from 1.8 to 7.6 nm. ASV activity was moderately attenuated in the presence of 40% human serum (6.5-fold increase in EC 50 value against a replicon representing genotype subtype 1b). CC 50 values ranging from 11 to 38 μm were obtained against 6 human cell lines derived from T-cells, liver, lung, cervix, and kidney cells. ASV exhibited an EC 50 value of 39 nm against HCV infectious virus representing a genotype 2a strain. Asunaprevir (BMS ) Report No. Location in Dossier BMS CTD BMS CTD BMS CTD CTD BMS CTD BMS CTD BMS CTD

35 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 6 Table : Primary Pharmacodynamics Test Article: In Vitro Type of Study Test System Noteworthy Findings Testing Facility Selectivity for HCV in cell culture Mode of action against the HCV NS3 protease Antiviral assays performed using 4 different RNA viruses Characterized activity using purified recombinant HCV NS3/4A protease complex and monitoring the cleavage of a FRET-labeled peptide substrate Resistance Cell culture passage of HCV replicons in the presence of ASV; luciferase activity monitored in HuH-7 cells either constitutively or transiently expressing HCV replicon variants ASV is a selective inhibitor of HCV genotype 1 RNA replication (EC to 4 nm); showed no significant activity against BVDV (EC 50 = 12 μm), HIV (EC 50 = 14 μm), HRV (EC 50 > 100 μm) or HCoV (EC 50 > 100 μm). ASV competitively inhibited the binding of substrate to NS3/4A protease complex in a continuous FRET assay. ASV bound directly and reversibly to the protease, K i 0.24 to 1.0 nm, depending on the genotype strain employed. HCV GT-1a and GT-1b replicons with reduced susceptibility to ASV were selected. In genotype 1a replicons, the following substitutions were observed in the NS3 protease domain: T40A, Q41E, V51A, R62K, D79E, T95A, I114V, R123G, R155K, D168G, I170T, N174Y, L175P, G176E. NS3 protease substitution R155K, when introduced into recombinant HCV replicons, conferred resistance to ASV in a cell-based assay. The level of resistance was moderate for this substitution (21-fold loss in EC 50 value compared with parent GT-1a replicon). In GT-1b replicons, the following substitutions were observed in the NS3 protease domain: Q41R, Q80R, Q86R, P89L, Y105C, D168A/G/H/V/Y, E173G, and E176G. NS3 protease substitution D168V, when introduced into recombinant HCV replicons, conferred resistance to ASV in a cell-based assay. The level of resistance was high for this substitution (280-fold loss in EC 50 value compared with parent GT-1b replicon). Asunaprevir (BMS ) Report No. Location in Dossier BMS CTD BMS CTD BMS CTD CTD

36 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 7 Table : Primary Pharmacodynamics Test Article: In Vitro Type of Study Test System Noteworthy Findings Testing Facility Cross-resistance HCV replicon transient luciferase cell-based assays to monitor activity against NS3 protease clinical resistance variants HCV replicons conferring resistance to inhibitors such as boceprevir and telaprevir were examined for their susceptibility to ASV inhibition. Against GT-1a replicons carrying NS3 protease substitutions at amino acid positions V36 (V36A/L/M), T54 (T54A/S), R155 (R155K), and V36-R155 (V36M-R155K), ASV exhibited no/minimal to moderate cross-resistance with EC 50 values ranging from 0.33 to 42 nm (parent GT-1a replicon EC 50 = 0.76 nm). Against GT-1b replicons carrying NS3 protease substitutions at amino acid positions A156 (A156S/T/V), demonstrated low to moderate resistance with EC 50 values of 5.4 to 17 nm (parent GT-1b replicon EC 50 = 0.86 nm). Asunaprevir (BMS ) Report No. Location in Dossier BMS CTD Combination studies HCV replicon cell-based assay in HuH-7 cells to monitor effects of combining HCV inhibitors of different mechanisms Combinations of ASV with other classes of HCV inhibitors including interferons alfa and lambda, ribavirin, NS5A, showed additive to synergistic antiviral activity in vitro, with no antagonistic antiviral activity. No apparent enhancement of cytotoxicity was seen. Treatment of HCV GT-1a replicons and HCV GT-1a replicons carrying the NS3 substitution R155K with a combination of ASV, daclatasvir, and interferon-alfa similarly suppressed HCV RNA replication. BMS CTD CTD CTD CTD Abbreviations: ASV = asunaprevir or BMS , BVDV = bovine viral diarrhea virus, CC 50 = concentration of drug to kill 50% of cells, EC 50 = 50% effective concentration in reducing viral replication, FRET = fluorescence resonance energy transfer, GBV-B = GB virus B, GT = genotype, HIV = human immunodeficiency virus, HRV = human rhinovirus, HCoV = human coronavirus, HCV = hepatitis C virus, IC 50 = 50% inhibitory concentration, K i = inhibition constant, μm = micromolar, nm = nanomolar, NS3 = nonstructural protein 3, NS3/4A = nonstructural protein 3/nonstructural protein 4A, RNA = ribonucleic acid

37 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 8 3 副次的薬理試験 Table : Secondary Pharmacodynamics Test Article: Asunaprevir (BMS ) In Vitro Test System Noteworthy Findings Testing Type of Study Facility Report No. Location in Dossier Mode of action on the IFNβ response Cardif proteolytic cleavage assay and IFNβ luciferase reporter assay in 293T cells. ASV inhibited proteolytic cleavage of Cardif by HCV NS3/4A protease, as visualized by Western immunoblotting. Cleavage of Cardif by the presence of NS3/4A protease subsequently leads to suppression of transcription of IFN genes; addition of ASV restores transcription of IFN genes in a dose-dependent manner. BMS CTD Abbreviations: ASV = asunaprevir or BMS , Cardif = caspase recruitment domain adaptor inducing IFNβ, HCV = hepatitis C virus, IFN = interferon, IFNβ = interferon-beta, NS3/4A = nonstructural protein 3/nonstructural protein 4A.

38 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 9 4 安全性薬理試験 Table : Safety Pharmacology Test Article: Asunaprevir (BMS ) Organ Systems Evaluated Receptors, enzymes, ion channels, and transporters Cardiovascular, Electrophysiology Species/ Strain Human, rat, guinea pig Human/HEK 293 cells and herg channel Method of Administration In vitro In vitro Doses (mg/kg) 10 μm (7.5 μg/ml) 10, 30 μm (7.5, 22.5 μg/ml) Gender and No. Noteworthy Findings per Group NA BMS did not exhibit clear selectivity for any of the 37 targets tested (biochemical, enzyme activity, and ligand binding assays). NA 10 μm: Mild-moderate inhibition of herg potassium currents ( % vs pretest); IC 50 > 30 μm GLP Compliance nonglp nonglp Study No./ Document Control No. DT07078/ DT07089/ Human/HEK 293 cells and sodium channel (SCN5A) In vitro 10, 30 μm (7.5, 22.5 μg/ml) NA 10 μm: Mild-moderate inhibition of sodium currents ( % vs pretest at 1 Hz stimulation frequency and % vs pretest at 4 Hz) nonglp DT07089/ Human/HEK 293 cells and L-type calcium channel In vitro 30 μm (22.5 μg/ml) NA 30 μm: Mild-moderate inhibition of L-type calcium (Ca v 1.2) (18.3% vs pretest). nonglp DT07089/ Rabbit/cardiac Purkinje fiber In vitro 3, 10, 30 μm (2.2, 7.5, 22.5 μg/ml) NA 30 μm: No BMS related findings. nonglp DT07089/ Dog/Beagle (telemetered) Oral (capsule) 0, 100 (single dose) 3 M, 3 F 100 mg/kg: Unformed and/or liquid stool in 2 M and 2 F 1 day post dose, bloody stool on Day 6 and unformed/mucoid stool on Days 6-9 in 1 M. Maximum BMS plasma concentration (4 h post dose): μg/ml (M); μg/ml (F). nonglp DS07001/

39 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 10 Table : Organ Systems Evaluated Cardiovascular, Electrophysiology Safety Pharmacology Species/ Strain Rabbit/ isolated heart Method of Administration In vitro Doses (mg/kg) 0, 10 μm (0, 7.5 μg/ml) Gender and No. per Group Test Article: Noteworthy Findings Asunaprevir (BMS ) GLP Compliance Study No./ Document Control No. 2 or 3 F 10 μm: No BMS related findings. nonglp DT07013/ Respiratory and Neurologic Rabbit/NZW IV infusion 0, 3, 10, 30 3 M 3 mg/kg: Minimal dose-dependent increases (10-24% vs pretreatment) in blood pressure. Plasma BMS concentrations μg/ml. Mouse/ Crl:CD1 (ICR) Oral (gavage) 0, 200, 600, 2000 (single dose) 5 M, 5 F 2000 mg/kg: No respiratory or CNS effects. nonglp GLP DT06116/ DM07027/ Rat/Crl:CD (SD) Oral (gavage) 0, 200, 600, 2000 (single dose) 5 M, 5 F 2000 mg/kg: No respiratory or CNS effects. GLP DM07028/ Rat/Crl:CD (SD) Oral (gavage) 0, 30, 100, 600 (1 month) 15 M, 15 F 600 mg/kg: No noteworthy findings. Cmax values at 30, 100, and 600 mg/kg were up to 0.306, 13.7, and 43.4 μg/ml. GLP DM07024/ Rat/Crl:CD (SD) Oral (gavage) 0, 40, 80, 200 (6 months) 25 M, 25 F 200 mg/kg: No noteworthy findings. Cmax values at 40, 80, and 200 mg/kg were up to 2,650; 22,700; and 124,000 μg/ml. GLP DM08025/ Rat/Crl: CD (SD) Oral (gavage) BMS : 0, 30, 60 BMS : 0, 10, 60 (1 month) 10 M, 10 F BMS /BMS at 60/60 mg/kg: No drug-related CNS, or respiratory effects BMS : Cmax 15.2 μg/ml BMS : Cmax 5.7 μg/ml GLP DS08126/ Cardiovascular, Neurologic, and Respiratory Dog/Beagle Oral (capsule) 0, 20, 60, 300 (1 month) 3 M, 3 F 300 mg/kg: No noteworthy findings. Cmax values at 20, 60, and 300 mg/kg were up to 6.12, 28.9, and 114 μg/ml. GLP DM07020/

40 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 11 Table : Organ Systems Evaluated Cardiovascular, Neurologic, and Respiratory Safety Pharmacology Species/ Strain Method of Administration Doses (mg/kg) Dog/Beagle Oral (capsule) 0, 15, 50, 100 (9 months) Test Article: Gender and No. Noteworthy Findings per Group 4 M, 4 F 100 mg/kg: No noteworthy findings. Cmax values at 15, 50, and 100 mg/kg were up to 6.29, 26.8, and 59.7 μg/ml. Asunaprevir (BMS ) GLP Compliance GLP Study No./ Document Control No. DM08026/ Rat/Crl: CD (SD) Oral (gavage) BMS : 0, 30, 60 BMS : 0, 10, 60 (1 month) 10 M, 10 F BMS /BMS at 60/60 mg/kg: No drug-related CNS, or respiratory effects BMS : Cmax 15.2 μg/ml BMS : Cmax 5.7 μg/ml GLP DS08126/ Monkey/ Cynomolgus Oral (gavage) BMS : 0, 72, BMS : 0, 15, 50 (1 month) 4 M, 4 F BMS /BMS at 129.5/50 mg/kg: No drug-related CV, CNS, or respiratory effects. BMS : Cmax 18.1 μg/ml BMS : Cmax 4.65 μg/ml GLP DS08143/ Monkey/ Cynomolgus Oral (gavage) BMS : 0, 45, 80 BMS : 0, 15, 50 (3 months) 4 M, 4 F BMS /BMS at 80/50 mg/kg: No drug-related CV, CNS, or respiratory effects. BMS : Cmax 9.00 μg/ml BMS : Cmax 3.75 μg/ml GLP DM09008/ Abbreviations: Cmax = Mean maximum plasma drug concentration; CNS = Central nervous system; CV = Cardiovascular; HEK = Human embryonic kidney cells; herg = Human ether-a-go-go-related gene; Hz = Hertz; IV = Intravenous; L-type = Long acting-type; NZW = New Zealand white; PEG = Polyethylene glycol; Peg IFN = Pegylated interferon α-2b; qod = Every other day; RBV = Ribavirin; SD = Sprague Dawley; TPGS = d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate.

41 アスナプレビル 薬理試験概要表 Page 12 5 薬力学的薬物相互作用試験 2 薬効を裏付ける試験に含む