Microsoft Word _12_27_EGFR簡易マニュアル_Amoy_Dx

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ぜんぺいいそみ
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1 AmoyDx TM EGFR 29 Mutations Detection Kit(Pre-load) 使用マニュアル注 : この説明書は英文添付文書の簡易訳です製品に添付されている英文マニュアルも必ずご確認下さい製品 : コード No. 品名梱包単位保存温度輸送温度 AMADX-EG01 EGFR 29 Mutations Detection 12 テスト Kit - Pre-loaded 冷凍 (-20 度 ) 冷凍 (-20 度 ) 使用目的 : AmoyDx TM EGFR 29Mutations Detection Kit は Real-time PCR を用いて EGFR 遺伝子の全 29 種類の変異 (Exon18-21) を非常に高感度にかつ簡便検出するための研究用試薬です検出可能なEGFR 変異の種類変異名称変異 exon 塩基の変化 Cosmic ID Ex18- G719A G>C 6239 Ex18- G719S G>A 6252 Ex18- G719C G>T 6253 mutant-3 Ex19- E746_A750del (1) _2249del Ex19- E746_A750del (2) _2250del Ex19- L747_P753>S _2257del mutant-3 Ex19- E746_T751>I _2252>AAT(complex) mutant-4 Ex19- E746_T751del _2253del mutant-5 Ex19- E746_T751>A _2251del mutant-6 Ex19- E746_S752>A _2254del mutant-7 Ex19- E746_S752>V _2250>T(complex) mutant-8 Ex19- E746_S752>D _2255del mutant-9 Ex19- L747_A750>P _2248>GC(complex) Ex19- L747_T751>Q _2252>GCA(complex) Ex19- L747_E749del _2247del Ex19- L747_T751del _2253del Ex19- L747_S752del _2256del Ex19- L747_A750>P _2248TTAAGAGAAG>C(complex) Ex19- L747_P753>Q _2258>CA(complex) Ex19-7 L747_T751>S _2251del /12/26 Ver.1.0

2 Ex19-8 Ex19-9 mutant-3 mutant-4 mutant-5 Ex21- Ex21- L747_T751del _2254del L747_T751>P _2251>C(complex) T790M C>T 6240 S768I G>T 6241 H773_V774insH _2320insCAC D770_N771insG _2311insGGT V769_D770insASV _2308insgccagcgtg L858R T>G 6224 L861Q T>A /12/26 Ver.1.0

キット構成 : 内容数量 8 連ストリップ *( プライマー分注済み ) 12 本 EGFR Taq Polymerase 45 ul EGFR Mixed Standard 250 ul * ストリップ 1 本で 1 サンプルですストリップ構成 : 8 連チューブのうちチューブ 1~7 には各 EGFR 遺伝子変異 (FAM) と Internal Control(HEX/VIC)

3 キット構成 : 内容数量 8 連ストリップ *( プライマー分注済み ) 12 本 EGFR Taq Polymerase 45 ul EGFR Mixed Standard 250 ul * ストリップ 1 本で 1 サンプルですストリップ構成 : 8 連チューブのうちチューブ 1~7 には各 EGFR 遺伝子変異 (FAM) と Internal Control(HEX/VIC) が入っていますチューブ 8 は External Control(FAM) が入っていますチューブ 1-7 は蛍光色素 FAM を使用して EGFR 遺伝子の変異を検出し蛍光色素 (HEX/VIC) を使用してインターナルコントロールを検出しますインターナルコントロールは PCR の偽陰性を引き起こす可能性のある阻害物質の有無を確認しますチューブ 8 はエクスターナルコントロールで FAM のみが入っていますストリップの種類は Real-time PCR の種類によって下記の違いがあります ABI StepOne: 各チューブの上にチューブ番号 (1~8) が記載されています ABI StepOne 以外の機種 : 番号は記載されておらず 1 番チューブ 8 番チューブに穴が空いています 1 番のチューブは左上隅に 8 番のチューブは右真ん中に穴が空いていますチューブ変異名蛍光色素 1 19-Del FAM HEX/VIC 2 L858R FAM HEX/VIC 3 T790M FAM HEX/VIC 4 Insertions FAM HEX/VIC 5 G719X FAM HEX/VIC 6 S768I FAM HEX/VIC 7 L861Q FAM HEX/VIC 8 External Control FAM キット以外に必要な試薬機器 : 内容リアルタイム PCR その他備考 ABI7300/7500/7900/StepOne(Applied Biosystems) Stratagene Mx3000P,Mx3005P (Agilent Technologies ) LightCycler480 I and II (Roche) BioRad-CFX96(Bio-Rad Laboratories) 注意 :LightCycler を使用する場合は Roche480 アダプター (cat No. B79480) を使用下さい LightCycler480 I をご利用の場合蛍光補正が必要です LightCycler480 II をご利用で蛍光値のクロスオーバーが見られる場合にも同様に蛍光補正が必要です滅菌蒸留水 ( ヌクレアーゼフリー ) 無菌チューブ ( ヌクレアーゼフリー ) ピペットフィルターチップ等 /12/26 Ver.1.0

4 サンプルの種類 : 組織もしくは血液から抽出したヒト DNA を使用してくださいなお Thermo Fisher NanoDrop 1000 /2000 等を使用してサンプルが以下の値の範囲にあることを確認してください A260/A A260/A280: 推奨 DNA 抽出キットパラフィン切片の場合 :Qiagen DNA extraction kit(qiagen 社カタログ番号 :56404) 組織血液サンプルの場合 :DNeasy Blood & Tissue kit(qiagen 社カタログ番号 :69504 または 69506) 操作上の注意点 : EGFR mixed standard は 29 種類の変異を含むリコンビナント EGFR とヒトゲノム DNA が入っています保管する際はサンプル DNA と別の場所に保管しコンタミネーションしないよう注意して下さいテンプレートなし ( ネガティブコントロール以下 NC) EGFR mixed standard( ポジティブコントロール以下 PC) は各テストの際には毎回測定してください操作方法 : 1. ストリップサンプル DNA 及び EGFR mixed standard を室温で溶かして下さい軽く遠心しフタの裏についた溶液を落とします 2. サンプル用チューブ (N 本 )+2 本 (NC 用 PC 用 ) の計 (N+2) 本のチューブ ( ヌクレアーゼフリーの無菌チューブ ) を用意し下記の通りサンプルを分注しますサンプル用チューブ (N 本 ): 各サンプルDNA( 各 42.3ul) サンプルDNAの必要量はサンプルの種類によって変わります DNAの希釈は TE(pH8.0) を使用してくださいパラフィン切片由来 DNA 保存期間が3 年未満 :90 ng パラフィン切片由来 DNAで保存期間が3 年以上 :135 ng パラフィン切片以外 ( 新鮮組織凍結病片全血 ) 由来 DNA:18~45 ng ( 希釈例 ) パラフィン切片由来 ( 保存 3 年未満 ) の45ng/ulのDNAの場合 DNA 原液 2 ulを TE 40.3 ulで希釈調整して下さい PC 用チューブ (1 本 ):EGFR mixed standard(42.3ul) NC 用チューブ (1 本 ): 滅菌蒸留水 (42.3ul) 3. EGFR Taq Polymerase を冷凍庫から取り出し軽く遠心しフタの裏の溶液を落としますで用意した各チューブに EGFR Taq Polymerase をそれぞれ 2.7ul ずつ分注しますこの時余分な液がチップの先につかないように注意して下さい EGFR Taq Polymerase は使用後速やかに冷凍庫に保管して下さい 5. 各混合溶液がしっかり混ざるようにピペッティングしますフタを閉め各チューブを軽く遠心します 6. 各チューブの混合溶液を 5ul ずつ各ストリップの 1 番 ~8 番のウェルに分注しますコンタミネーションの影響を最小限にする為 NC 各サンプル PC の順番で分注してくださいサンプル数 10 検体の場合 NC ストリップ 1 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul サンプル 1 ストリップ 2 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul サンプル 2 ストリップ 3 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul /12/26 Ver.1.0

チューブをリアルタイム PCR にセットして下記のプログラムで測定を行ってください測定機器の設定では必ず Calibration Fluorescence のチェックを外して下さいまた PC NC サンプルのウェルを同時に設定して下さいリアルタイム PCR 条件結果の解析検出限界 ( 閾値 Threshold) と増幅曲線の交点を Ct(Threshold Cycle) といいます

5 サンプル 10 ストリップ 11 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul PC ストリップ 12 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 分注する際にはチップの先がチューブの溶液に付かないように壁面上部から流します 7. チューブにシールを張り軽く遠心して分注した溶液を確実にチューブ下に落としてくださいこの作業を行わないとしっかりと溶液が混ざりませんので必ず遠心を行ってください 8. チューブをリアルタイム PCR にセットして下記のプログラムで測定を行ってください測定機器の設定では必ず Calibration Fluorescence のチェックを外して下さいまた PC NC サンプルのウェルを同時に設定して下さいリアルタイム PCR 条件結果の解析検出限界 ( 閾値 Threshold) と増幅曲線の交点を Ct(Threshold Cycle) といいますサンプルの陰性陽性を決定する Ct 値は数多くのバリデーションに基づいていますまずチューブ 1~7 の HEX/VIC シグナルでインターナルコントロールの増幅の状態を確認してください HEX/VIC FAM シグナルのどちらかが検出されていれば問題ありません HEX/VIC FAM シグナルがどちらも検出されなかった場合そのデータは無効となりますので再検査を行って下さい次にチューブ 8 の FAM シグナルでエクスターナルコントロールの増幅の状態を確認してください 1. パラフィン切片の場合 Ct 値は 15~21 ですがパラフィン切片以外のサンプルは 13~ 19 となりますの条件よりも Ct 値が小さい場合 DNA を入れすぎの可能性がありますので DNA 量を減らして再検査を行って下さいの条件よりも Ct 値が大きい場合は DNA に PCR 阻害物質が含まれている可能性がありますので再度 DNA を抽出し直して再検査を行って下さいインターナル / エクスターナルコントロールの値が問題ないことを確認した後各サンプルの /12/26 Ver.1.0

6 FAM の Ct 値を確認します Ct 値に応じて強陽性弱陽性陰性に分けられます詳細は次ページの判定表をご覧下さい弱陽性の場合はさらに Ct 値を算出して陰性もしくは陽性を決定します Ct は下記の式で求められます Ct = FAM ( 各 1~7 番チューブ )Ct 値 - external control FAM(8 番チューブ )Ct 値判定表 Tube# 変異 19-Del L858R T790M Insertion G719X S768I L861Q 強陽性 Ct 値 <26 <26 <26 <26 <26 <26 <26 変異 % >5% >5% >5% >5% >5% >5% >5% Ct 値 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 弱陽性 Ct 値 <11 <11 <7 <9 <7 <8 <8 変異 % 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 陰性 Ct 値参考文献 1. Herbst RS, Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59 (2 Suppl): Zhang H, Berezov A, Wang Q, Zhang G, Drebin J, Murali R, Greene MI, ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies. J. Clin. Invest. 117 (8): Oda K, Matsuoka Y, Funahashi A, Kitano H, A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling. Mol. Syst. Biol. 1: Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al., Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 350 (21): Seth D, Shaw K, Jazayeri J and Leedman PJ, Complex post-transcriptional regulation of EGFreceptor expression by EGF and TGF-α in human prostate cancer cells. Br J Cancer 80(5-6): PaoW, Miller VA, Politi KA, Riely GJ, Somwar R, Zakowski MF, Kris MG and Varmus H, Acquired resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib is associates with a second mutation in the EGFR kinase domain. Plos Medicine 2(3):1-11. 株式会社ベリタス東京都港区浜松町 1 丁目住友東新橋ビル3 号館 5 階 TEL FAX 技術的なお問い合わせは :TEL techservice@veritastk.co.jp /12/26 Ver.1.0

遺伝子検査の基礎知識

遺伝子検査の基礎知識リアルタイム PCR( インターカレーター法 ) 実験ガイドこの文書ではインターカレーター法 (TB Green 検出 ) によるリアルタイム PCR について蛍光検出の原理や実験操作の流れなどを解説します実際の実験操作の詳細については各製品の取扱説明書をご参照ください - 目次 - 1 蛍光検出の原理 2 実験に必要なもの 3 実験操作法 4 結果の解析 1 1 蛍光検出の原理インターカレーターによる蛍光検出の原理