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なおちかありはら
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2 適切な遺伝カウンセリングのためにこのスライドでは,2012 年 10 月 18 日に聖路加看護大学で開催された NIPT に関する勉強会での資料を基にして, 適切な情報提供ができるようにするためにシーケノム社が提供する NIPT を例にしてその原理を理解していただくための資料を提供していますクライアントに示す資料は別途準備中です適切な遺伝カウンセリングには, 担当者自身による確率の正しい理解とわかりやすい説明が不可欠です NIPT は確定検査ではなく, 確定検査が必要かどうか判断するための検査ですその理由をよく理解して遺伝カウンセリングに活用して下さいご質問は宛にお願いします

3 胎児に侵襲を伴う胎児組織絨毛羊水胎児血皮膚生検染色体分析 DNA 分析生化学的分析病理学的検査出生前検査 - 種類 - 胎児には非侵襲的母体血母体血清マーカー検査 AFP,hCG,uE3, Inhibin A 母体血中胎児由来細胞 DNA 母体血中胎児由来 DNA DNA 画像検査超音波断層法 MRI 着床前検査

児への愛着形成と出生前検査妊娠への喜びと否定的感情の共存妊娠の現実に適応し, 胎児への愛着がより強く形成される急激なホルモン環境の変化つわり気分の変動外見的な身体の変化妊娠週数 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

4 児への愛着形成と出生前検査妊娠への喜びと否定的感情の共存妊娠の現実に適応し, 胎児への愛着がより強く形成される急激なホルモン環境の変化つわり気分の変動外見的な身体の変化妊娠週数絨毛検査流産率 % NIPT 羊水検査流産率 % 胎動の自覚初期流産中期流産 ( 死産届けが必要になるなど社会的には分娩扱い ) 資料提供有森直子 NT の測定 Genetic sonogram 母体血清マーカー検査

NIPT 後の検査の流れ妊娠への喜びと否定的感情の共存妊娠の現実に適応し, 胎児への愛着がより強く形成される急激なホルモン環境の変化外見的な身体の変化妊娠週数 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 資料提供有森直子つわり

5 NIPT 後の検査の流れ妊娠への喜びと否定的感情の共存妊娠の現実に適応し, 胎児への愛着がより強く形成される急激なホルモン環境の変化外見的な身体の変化妊娠週数資料提供有森直子つわり気分の変動初期流産中期流産 ( 死産届けが必要になるなど社会的には分娩扱い ) 実施絨毛検査流産率 % NIPT 結果実施陽性 3-4 週間程度結果羊水検査流産率 % 絨毛検査が可能な施設はかなり少ないため, ほとんどは羊水検査に進むことになる胎動の自覚

6 NIPT 後の検査の流れ妊娠への喜びと否定的感情の共存妊娠の現実に適応し, 胎児への愛着がより強く形成される急激なホルモン環境の変化つわり気分の変動外見的な身体の変化妊娠週数初期流産中期流産 ( 死産届けが必要になるなど社会的には分娩扱い ) 絨毛検査流産率 % NIPT 羊水検査流産率 % 胎動の自覚実施結果陽性実施 3-4 週間程度結果資料提供有森直子検査が順調に進んでも確定診断までには時間がかかる

7 お母さんの血液中に流れている胎児成分って? 細胞?DNA?

8 母体血中の胎児成分妊娠中および分娩時には, 胎児の細胞成分が母体血中に入ることが古くから知られています

9 母体血中の胎児成分妊娠中胎児細胞胎児白血球胎児有核赤血球絨毛細胞分娩時羊水成分扁平上皮細胞毳毛胎脂ムチン胆汁様物質

10 母体血中の胎児成分妊娠中胎児細胞胎児白血球胎児有核赤血球絨毛細胞母体血中の胎児成分が引き起こす病態 Feto-maternal hemorrhage ( 母児間輸血症候群 ) 分娩時羊水成分扁平上皮細胞毳毛胎脂ムチン胆汁様物質羊水塞栓症

11 母体血中の胎児成分妊娠中胎児細胞胎児白血球胎児有核赤血球絨毛細胞 Cell-free fetal DNA 今回のNIPTの対象細胞内にないDNA 絨毛細胞のアポトーシスなどによって入り込む分娩時羊水成分扁平上皮細胞ムチン胆汁様物質

12 母体血液胎児由来の断片化した DNA 母体細胞母体の断片化した DNA 胎児由来細胞

13 母体血中の胎児成分胎児細胞 [ 胎児白血球, 胎児有核赤血球, 絨毛細胞 ] 妊娠 4 週から母体血中に出現数年にわたって存在妊娠週数の進行とともに胎児細胞数は増える妊娠の第 1 三半期には 100,000 個の有核細胞に 1 個, 妊娠末期には 10,000 個の有核細胞に 1 個の胎児細胞母体血 1ml に 1 個の細胞 Cell-free fetal DNA 妊娠 5 週から, 遅くても 9 週までには母体血中に出現 DNA 断片の存在期間は短く, 半減期は数分間と短い母体血漿中 DNA 断片の 3-10% を占める Fetal RNA

14 母体血中の胎児成分胎児細胞 [ 胎児白血球, 胎児有核赤血球以前の妊娠の, 絨毛細胞 ] 妊娠 4 週から母体血中に出現数年にわたって存在妊娠週数の進行とともに胎児細胞数は増える妊娠の第 1 三半期には 100,000 個の有核細胞に 1 個, 妊娠末期には 10,000 個の有核細胞に 1 個の胎児細胞母体血 1ml に 1 個の細胞 Cell-free fetal DNA 妊娠 5 週から, 遅くても9 週までには母体血中に出現 DNA 断片の存在期間は短く, 半減期は数分間と短い検体量が豊富分離しなくても母体血漿中 DNA 断片の3-10% を占める Fetal RNA 影響が残る検体量が少ない分離が困難今回の妊娠に特異的細胞に比べると解析可能

15 すなわち母体血中の胎児成分胎児細胞を母体血中から分離して検査をするよりも胎児由来の DNA を解析する方が, 胎児情報を得るには容易妊娠初期より母体血中に出現する今回の妊娠に特異的 ( 過去の妊娠の影響を受けない ) 検体量が比較的豊富で分析しやすい

16 NIPT の原理シーケノム社の方法

17 母体血漿中 DNA 断片 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing

18 母体血漿中 DNA 断片 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 母体由来か胎児由来かの区別はできないそれぞれのDNA 断片の塩基配列を36 塩基ずそれぞれのつ決める DNA 断片の塩基配列 36 個を読む AAGTCTAG...TTAGTCT Chr.1 TTAGGCTT...CCGCATT Chr.4 CAGGCCT AGAGGC Chr 注 : 図の中の塩基配列は単なる例です実際の配列とは異なります

..TTAGTCT Chr.1 TTAGGCTT...CCGCATT Chr.4 CAGGCCT AGAGGC Chr.10.

19 Multiplexed massively parallel sequencing 母体由来か胎児由来かの区別はできない母体血漿中 DNA 断片 DNA 断片がどの染色体由来かを分析 NIPT の原理それぞれのDNA 断片の塩基配列を36 塩基ずつ決める AAGTCTAG...TTAGTCT Chr.1 TTAGGCTT...CCGCATT Chr.4 CAGGCCT AGAGGC Chr 注 : 図の中の塩基配列は単なる例です実際の配列とは異なります染色体

NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 母体由来か胎児由来かの区別はできない母体血漿中 DNA 断片それぞれのDNA 断片の塩基配列を36 塩基ずつ決める AAGTCTAG...TTAGTCT Chr.1 TTAGGCTT...CCGCATT Chr.

20 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 母体由来か胎児由来かの区別はできない母体血漿中 DNA 断片それぞれのDNA 断片の塩基配列を36 塩基ずつ決める AAGTCTAG...TTAGTCT Chr.1 TTAGGCTT...CCGCATT Chr.4 CAGGCCT AGAGGC Chr 多数のDNA 断片の, それぞれの塩基配列の一部を読むことにより, 母体血中の DNA 断片の由来染色体を判読していく注 : 図の中の塩基配列は単なる例です実際の配列とは異なります染色体

21 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing すべての DNA 断片の由来染色体を決める染色体

22 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 胎児由来これらの DNA 断片には 3-10% の胎児由来断片が含まれている染色体

23 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 胎児由来これらの DNA 断片には 3-10% の胎児由来断片が含まれている胎児が 21 トリソミーの場合は胎児由来分が増加染色体

24 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 母体血漿中の DNA 断片の解析により, ある特定染色体の多寡を比較することにより染色体異数性を診断する胎児由来断片母体由来断片胎児が正常核型胎児が 21 トリソミー

25 NIPT の原理 Multiplexed massively parallel sequencing 母体血漿中の DNA 断片の解析により, ある特定染色体の多寡を比較することにより染色体異数性を診断する胎児由来断片母体由来断片胎児が正常核型この違いを比較胎児が 21 トリソミー

26 では Sensitivity( 感度 ) Specificity( 特異度 ) 偽陽性率 false-positive 偽陰性率 false-negative とは???

Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) 罹患あり

患者でないひとが患者でないと診断される確率偽陽性率 false-positive:

27 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) 罹患あり罹患なし小計検査陽性 a b a+b 検査陰性 c d c+d a+c b+d a+b+c+d 感度 sensitivity: a/(a+c) 患者が正しく患者と診断される確率特異度 specificity: d/(b+d) 患者でないひとが患者でないと診断される確率偽陽性率 false-positive: b/(b+d) 患者でないひとが患者であると診断される確率偽陰性率 false-negative: c/(a+c) 患者であるひとが患者でないと診断される確率

28 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) 正常核型と 21 トリソミーで 21 番染色体の量を測定した結果 Cutt-off 値正常核型ダウン症候群検査結果 Palomaki et al. :DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genetics IN Medicine 13(11), , 2011

29 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) ダウン症候群ではないのに cutoff 値以上だった重複した値が生じている値の重複がなければ完全に区別できることになる Cutt-off 値検査結果正常核型ダウン症候群ダウン症候群だが cut-off 値以下だった Palomaki et al. :DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genetics IN Medicine 13(11), , 2011

30 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) Cut-off 値を高く設定すれば, 正常核型の人を陽性と診断することが減るが, ダウン症候群の人を陰性と診断することが増える偽陽性が減って, 偽陰性が増える = 感度がさがる特異度はあがる Cutt-off 値検査結果 Palomaki et al. :DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genetics IN Medicine 13(11), , 2011

Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) 偽陰性が減って,

:DNA sequencing of maternal plasma to detect Down

31 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) 偽陰性が減って, 偽陽性が増える = 感度があがる特異度がさがる Cutt-off 値検査結果 Cut-off 値を低く設定すれば, ダウン症候群の人を陰性と診断することがなくなるが, 正常核型の人を陽性と診断することが増える Palomaki et al. :DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genetics IN Medicine 13(11), , 2011

32 Sensitivity( 感度 ) と Specificity( 特異度 ) Cut-off 値の設定の仕方により, 偽陽性偽陰性が変わり, 感度特異度が変わる Cutt-off 値正常核型ダウン症候群検査結果 Palomaki et al. :DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study. Genetics IN Medicine 13(11), , 2011

33 検査の感度は 99.1%(210/212) 特異度は 99.9%(1687/1688) と報告されています Palomaki GE, et al. DN A sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome:an international collaborative study. Genet Med 2012:14: Sensitivity( 感度 )=210/212=99.1% 患者が正しく患者と診断される確率患者非患者合計検査の正確性を検証するために染色体検査の結果が判明している人を選んで検査を行ってみた結果陽性陰性 2 1,687 1,689 合計 212 1,688 1,900 Specificity( 特異度 )=1,687/1,688=99.9% 患者でないひとが患者でないと診断される確率

34 感度真の陽性率 : 罹患者が検査で陽性になる率検査の感度は99.1%(210/212), 特異度は99.9%(1687/1688) の検査を実際のスクリーニングとして行う場合について考えてみましょう特異度真の陰性率 : 非罹患者が検査で陰性になる率

35 Sequenom 社のデータは胎児が21トリソミーだということが感度分かっている人を集めて解真の陽性率 : 罹患者が検査で陽性になる率析したデータです検査の感度は 99.1%(210/212), 特異度は 99.9%(1687/1688) の検査を実際のスクリーニングとして行う場合について考えてみましょう特異度真の陰性率 : 非罹患者が検査で陰性になる率

36 罹患者頻度が 1,000 人に一人の集団に属する人にこの検査をしてみましょう

37 スクリーニング検査罹患頻度 1,000 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 10 9,990 10,000

38 スクリーニング検査罹患頻度 1,000 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 10 9,990 10,000 検査陽性 9.91 検査陰性 0.09 感度は 99.1%

39 スクリーニング検査罹患頻度 1,000 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 10 9,990 10,000 検査陽性検査陰性 0.09 罹患者ではなくてもそのうちの 0.1% の人は検査が陽性と出る

40 スクリーニング検査罹患頻度 1,000 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 10 9,990 10,000 検査陽性検査陰性

41 スクリーニング検査罹患頻度 1,000 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 10 9,990 10,000 検査陽性検査陰性検査が陽性で罹患しているのは 9.91/19.9=49.8% 検査が陰性で罹患していないのは /9980.1=99.99%

42 では罹患者頻度が 100 人に一人の場合はどうなるでしょう

43 スクリーニング検査罹患頻度 100 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 100 9,900 10,000

44 スクリーニング検査罹患頻度 100 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 100 9,900 10,000 検査陽性 99.1 検査陰性 0.9

45 スクリーニング検査罹患頻度 100 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 100 9,900 10,000 検査陽性検査陰性 0.9 罹患者ではなくてもそのうちの 0.1% の人は検査が陽性と出る

46 スクリーニング検査罹患頻度 100 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 100 9,900 10,000 検査陽性検査陰性

47 スクリーニング検査罹患頻度 100 人に一人罹患あり罹患なし小計人数 100 9,900 10,000 検査陽性検査陰性検査が陽性で罹患しているのは 99.1/109=90.9% 検査が陰性で罹患していないのは /9891=99.9%

48 すなわち感度は99.1%, 特異度は99.9% の検査を罹患者頻度 1/1,000( ダウン症候群の一般頻度 ) の集団に用いた場合, 結果が陽性と出ても実際に胎児がダウン症候群である確率は約 50% 罹患者頻度 1/100( 母体年齢 40 歳 ) の集団に用いた場合でも, 結果が陽性の中で胎児がダウン症候群ではない確率が約 10% あることになるいずれの場合も検査が陰性の場合に胎児がダウン症候群でない可能性は 99% 以上と高い

49 患者非患者陽性 (Wp) 有病率が高い集団陽性 (Xp) 陰性陰性陽性 (Wp) 有病率が低い集団陽性 (Xp) 陰性陰性患者非患者 Positive predictive value( 真陽性の予測値 )=Xp/(Xp+Wp) 検査が陽性であった場合に患者と診断できる確率

50 他の検査法

51 様々のスクリーニング方法による予測される感度 ( 検出率 ) 妊娠週数マーカー感度 (%) Free β-hcg,afp Free β-hcg,afp,ue Free β-hcg,afp,ue3, inhibin A Free β-hcg,afp,ue3,papp-a NT Free β-hcg,afp,ue3,papp-a,nt NT+NB Free β-hcg,afp,ue3,papp- A,NT,NB 97.5 感度 ( 検出率 ):5% に侵襲的出生前検査が行われる ( 偽陽性が出る ) と仮定した場合 NT=nuchal translucency; NB=nasal bone. Cuckle H: Time for total shift to first-trimester screening for Down s syndrome. Lanset, 2001;358:

52 Nuchal Translucency inner to inner 妊娠週 By KS Nicolaides KH (Editor), The11-14week scan より引用 Nuchal Translucency とは妊娠初期胎児の後頸部にみられる Sonolucent な ( 透過性のある ) 皮下の液体貯留像である By KS NicolaidesKH,et al.br Med J 304:867,1992

妊娠 12 週における母体年齢とトリソミー 21の先験的確率と NTの影響 Nicolaides,KH:The 11 13+6 weeks scan.

53 妊娠 12 週における母体年齢とトリソミー 21の先験的確率と NTの影響 Nicolaides,KH:The weeks scan. Fetal Medicine Foundation, London, ( /english/FMF-English.pdf)

54 陽性と出た妊婦さんの不安は確定検査の結果が出るまで次第に強まります NIPT を誰を対象に行うかは慎重に検討すべきですたとえば 35 歳の妊婦さんで NT が 3.5mm あった場合胎児がトリソミー 21 の可能性は約 10% ありますこの方に NIPT を行いそれからさらに羊水検査を行うのは耐えられるストレスの範囲内でしょうか?

55 NIPT で子どものことはすっかりわかる?

56 先天的形態異常新生児期 3.5~5% 原因不明 = 複合奇形 50% 環境因子 5% 染色体不均衡 25% 単一遺伝子異常 20% グラフ :Thompson & Thmpson: Genetics in Medicie 7 th.ed

57 薬剤性母体糖尿病ウイルス感染先天的形態異常新生児期 3.5~5% 環境因子 5% 染色体不均衡 25% ダウン症候群 13 トリソミー 18 トリソミー不均衡転座片親ダイソミー微細欠失原因不明 = 心血管奇形口唇口蓋裂神経管閉鎖不全症複合奇形 50% グラフ :Thompson & Thmpson: Genetics in Medicie 7 th.ed 単一遺伝子異常 20% 先天代謝異常症骨系統疾患多指症筋ジストロフィー

58 出生前検査何のために実施するのか? 妊婦が希望するから? 妊婦の不安解消のため? 障害のある子どものマススクリーニング? 障害のある子どもを産むことは不幸だから? 妊婦に情報を与え選択肢を示すため????

59 母体血清マーカー検査でスクリーン陽性の結果が得られた婦人のほとんどすべてが不安を感じそのうち 13% は羊水検査でそれが否定されても不安感は持続した Weinans MJ, et al. : Prenat Diagn 2000;20:705 この不安感は健康な子どもが生まれても持続し親子の結びつきに問題を投げかける Guedeney A: Psychosom Obstet Gynecol 1999;20:53 母体血清マーカー検査を受けなかったカップルと比較して偽陰性であったカップルでは親としてのストレスが大きく子どもに対して否定的になりやすい Hall S, et al.: BMJ 2000;12:407

60 なぜ不安なの? 妊婦の不安解消には stress を減少させる誰が不安おめでた情報提供 ( 早い段階で正確に具体的に判りやすなの? なのにく起こりうる可能性の説明を含んで? )/ 障害や先天異常についての正しい理解 / 出生前検査 /support network 何が不安なの? 不安の閾値を上昇させるカップルの協力と理解 / 子どもの多様性の理解 / 周囲 ( 医療者を含む ) からのサポート /relaxation stress を糧とするカウンセリング (identity の確保 self control)

61 妊婦の不安解消には stress を減少させる情報提供 ( 早い段階で正確に具体的に判りやすく起こりうる可能性の説明を含んで )/ 障害や先天異常についての正しい理解 / 出生前検査 /support network 不安の閾値を上昇させるカップルの協力と理解 / 子どもの多様性の理解 / 周囲 ( 医療者を含む ) からのサポート /relaxation stress を糧とするカウンセリング (identity の確保 self control)

62 Noninvasive Prenatal Diagnosis: Can Ethics and Science Meet? Elizabeth H. Dorfman; Mildred Cho, PhD Posted: 09/25/2012 Ms. Dorfman: ワシントン州立大学のチームが最近 noninvasive cell-free fetal DNA (cf DNA) で胎児の全ゲノムの解析をしたと報告していますがこの変化が NIPD の展開をどのように変えるのかもう少し詳しく話していただけますか Dr. Cho: 近年胎児検査はある条件でスクリーニングするか遺伝学的スクリーニングや胎児超音波のような先行スクリーニングのフォローアップとして行われてきましたこれらの場合先行スクリーニングで陽性となった状態や異常に焦点を当ててもしくは家族歴から考えられる特別な状態を検出するために診断的検査が行われてきましたしたがって診断的検査は観察されたもしくは疑わしい異常について診断しようとするものでした Prof. Mildred Cho( Professor at the Stanford Center for Biomedical Ethics, Stanford, California)

63 Noninvasive Prenatal Diagnosis: Can Ethics and Science Meet? Elizabeth H. Dorfman; Mildred Cho, PhD Posted: 09/25/2012 Dr. Cho: ( 続き ) もし一般臨床で全ゲノム解析が可能になればもしくは可能になったときにはトリソミーのようなある程度身近にわかっていることを遙かに超えた胎児の情報が人々にもたらされることになります人々は不確実性に満ちたあまにりも膨大な情報とその情報に対してどのようにすべきかきわめて限られた時間しかない状況に直面することになりますさらにその先を考えると問題の一つはどんな子どもが欲しいのかたくさんの種類の中から選ぶことができると思って妊娠についての考え方を変えてしまうかもしれないことです ( 出生前検査が : 訳者註 ) ある限られた特質だけではなく遺伝的影響の強い特質殆ど全てに対して可能となれば妊娠とか出産に対する人々の考えをすっかり変えてしまうかもしれません Prof. Mildred Cho( Professor at the Stanford Center for Biomedical Ethics, Stanford, California)

64 Noninvasive Prenatal Diagnosis: Can Ethics and Science Meet? Elizabeth H. Dorfman; Mildred Cho, PhD Posted: 09/25/2012 Ms. Dorfman: その UW の研究の編集者のサマリーには理想的な出生前遺伝検査はすべてのメンデル遺伝病について妊娠初期に非侵襲的にスクリーニングするものだと述べられていますあなたはこの考えに何かコメントがりますか Dr. Cho: 我々は異なる人々にとってなにが理想的かを考える必要があります最近たくさんのメンデル遺伝病の検査ができるようになりましたがたくさんの人々はこうした検査を受けようとはしません多くのひとたちにとってそうした情報は望むものではないのですそれらのあるものは人々が妊娠にどう対処するかに役立つものでないかもしれないし生まれた後も不要なものかもしれませんなにが理想的かが論議されなければならないことだと考えます Prof. Mildred Cho( Professor at the Stanford Center for Biomedical Ethics, Stanford, California)

65 まとめ NIPT は胎児染色体について確定検査ではなく, 確定検査 ( 羊水検査や絨毛検査 ) が必要かどうか判断するための検査である検査で陽性と出ても, 実際に胎児が 21 トリソミーである可能性は母体背景によって異なる一律に 99% ではあり得ない検査で陰性と出た場合は, 胎児が 21 トリソミーではない可能性は 99% 以上である

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PowerPoint プレゼンテーション NIPT の概要この検査は臨床研究の一環として行われ研究参加には一定の条件があります妊婦さんから 20mL の血液を採取し血液中を浮遊している DNA 断片を分析することで赤ちゃんが 3 つの染色体疾患かどうかを検査します赤ちゃんの染色体疾患を確定診断する検査ではありません ( 非確定的検査という位置づけの検査です ) 妊娠 10 週以降の妊婦さんが対象です検査結果はおよそ 2~3