2.6.4 薬物動態試験の概要文 2 目次 略号一覧 薬物動態試験の概要文 まとめ 分析法 吸収 分布 代謝 ( 動物間の比較 )

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1 2.6.4 薬物動態試験の概要文 薬物動態試験の概要文

2 2.6.4 薬物動態試験の概要文 2 目次 略号一覧 薬物動態試験の概要文 まとめ 分析法 吸収 分布 代謝 ( 動物間の比較 ) 排泄 薬物動態学的薬物相互作用 その他の薬物動態試験 考察及び結論 図表 参考文献一覧 表表 Summary of validation data for FVIII activity by chromogenic method in E17 FVIII ko mouse, rat and cynomplgus plasma samples in study RD_VB_ 表 Summary of validation data for rfviii-bound PEG by ELISA method in E17 FVIII ko mouse, rat and cynomplgus plasma samples in studies RD_PPD_070902, RD_PPD_ and RD_PPD_070901, respectively... 8 表 Summary of validation data for FVIII antigen by ELISA method in rat plasma sample in study RD_VB_ 表 The FVIII activity dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the mouse study PV 表 The FVIII antigen dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the rat study PV 表 The rfviii-bound PEG dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the rat study PV 表 Dose levels and schedule of the escalating dose / PK phase of the cynomolgus monkey study 表 The FVIII activity AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the cynomolgus monkey study 表 AUC 0-tlast and dose proportionality for the PK phase of the cynomolgus monkey study 表 Design of the rat ADME study

3 2.6.4 薬物動態試験の概要文 3 表 Average concentrations of radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) 表 PK parameters for radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) 表 Average blood:plasma concentration ratios of radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) 表 Average concentrations of radioactivity in blood, plasma and tissues from rats (Study , Group 2) 表 Average percent and average concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in plasma samples from rats (Study , Group 2) 表 Mean percent of sample radioactivity and mean percent of radioactive dose for metabolites in 0- to 576-hour pooled urine from rats (Study , Group 1) 表 Mean percent of sample radioactivity and mean percent of radioactive dose for metabolites in 0- to 504 (male)/408 (female)-hour pooled feces from rats (Study , Group 1) 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in kidney from rats (Study , Group 2) 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in liver from rats (Study , Group 2) 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in lung from rats (Study , Group 2) 表 Mean percent of radioactive dose in urine, feces, cage rinse, cage wash and cage wipe from rats (Study , Group 1) 図 図 Whole-body autoradiograph for female animal at 168 hours (Study , Group 3) 図 Excretion data of male and female rats (Study , Group 1)... 30

4 2.6.4 薬物動態試験の概要文 4 略号一覧 略号 英語 日本語 ADME absorption, distribution, metabolism and 吸収, 分布, 代謝及び排泄 excretion AUC area under the curve 曲線下面積 AUC 0- area under the curve from 0 to infinity 時間 0 から無限大時間までの曲線下面積 AUC 0-tlast area under the curve from 0 to the last quantifiable sampling time point 時間 0 から測定可能な最終採血時点までの曲線下面積 C 0 initial concentration 初期濃度 CHO cells Chinese hamster ovary cells チャイニーズハムスター卵巣細胞 CI confidence interval 信頼区間 CL clearance クリアランス C max maximum concentration 最高濃度 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酵素標識免疫吸着測定法 Eq equivalent 当量 FVIII factor VIII 血液凝固第 VIII 因子 FIXa activated factor IX 活性型血液凝固第 IX 因子 FX factor X 血液凝固第 X 因子 FXa activated factor X 活性型血液凝固第 X 因子 GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 HPLC high-performance liquid chromatography 高速液体クロマトグラフィー ICH International Conference on Harmonisation 日米 EU 医薬品規制調和国際会議 IU international unit 国際単位 IVR in vivo recovery 生体内回収率 ko knock out ノックアウト LLOQ lower limit of quantification 定量下限 MRT mean residence time 平均滞留時間 NOAEL no observed adverse effect level 無毒性量 PEG polyethylene glycol ポリエチレングリコール PK pharmacokinetic 薬物動態 rfviii recombinant factor VIII 遺伝子組換え型ヒト血液凝固第 VIII 因子 SD standard deviation 標準偏差 t 1/2 half-life 半減期 t 1/2terminal terminal half-life 終末相半減期 T max maximum drug concentration time 最高血中濃度到達時間 V ss volume of distribution at steady state 定常状態の分布容積 WHO World Health Organization 世界保健機関

5 2.6.4 薬物動態試験の概要文 薬物動態試験の概要文 まとめ本項では,3 種類の in vitro 分析法のバリデーション結果及び 4 種類の in vivo モデルにおける BAX 855( 以下, 本剤 ) の薬物動態試験成績をまとめる. マウス, ラット及びサル血漿試料の FVIII 活性, マウス, ラット及びサル血漿試料の PEG-rFVIII 抗原, 並びにラット血漿試料の FVIII 抗原について測定法のバリデーション試験を実施した. 本剤の薬物動態プロファイルを E17 FVIII ko マウス, 並びに正常ラット及びカニクイザルにおいて評価した. ラットでは放射性標識した本剤の ADME に関する更なる情報が得られた. E17 FVIII ko マウス ( エクソン 17 ノックアウトマウス, 系統, ) は, ヒト患者集団を適切に反映するモデルであるため選択した. 本マウスでは, エクソン 17 のにネオマイシンカセットが挿入されており, これはエクソンスキッピングを誘導する. このエクソンの変異は重症血友病 A(FVIII の残存活性 1% 未満 ) を引き起こす. ラットは, 動物薬物動態試験及び毒性動物試験で広く用いられているため選択した. ラットは本目的のための適切な動物種として, 規制当局により一般的に認識されている. カニクイザルは, 霊長類とヒトの血液凝固系が極めて類似しており, ヒト血液凝固たん白質の試験に関する適切な動物種であると考えられるため選択した. これら 3 種類の動物種における本剤の薬理作用は in vitro 又は in vivo 試験で示されている ( 項, 項及び 項を参照 ). ラットは薬物動態試験に, カニクイザルは薬理試験及び毒性試験にも使用した. E17 FVIII ko マウスにおいて 200 IU FVIII/kg の用量で臨床的に意義のある有効性が確認された本剤の薬理試験成績に基づき ( 項を参照,WH0210 試験及び WH0110 試験 ),E17 FVIII ko マウス及びラットにおける薬物動態プロファイルを評価するため,200 IU FVIII/kg の目標用量を選択した. カニクイザルに投与した低用量 (350 IU FVIII/kg) は, 活性測定において血漿中濃度が技術的に測定可能な最低用量であった. 薬物動態試験に用いた処方 ( 溶解後に静脈内投与する凍結乾燥製剤 ) は, すべての非臨床薬理及び毒性試験に用いた処方と同一であった. 本剤の特性データ (3.2.P.5.4 項を参照 ) から, 臨床試験用及び市販予定の本剤は構造及び機能において非臨床試験で用いた本剤と同等であることが示されている. 放射性標識した本剤のラット試験を除く薬物動態試験は,GLP に準拠して実施した. これらの分析結果から, 本剤は単回静脈内投与後に非修飾型 rfviii( アドベイト ) と比較して循環時間を改善し, 曝露時間を延長することが示された 分析法 FVIII 活性発色測定法,PEG-rFVIII 抗原測定法及び FVIII 抗原測定法 ( 報告書 RD_VB_040901, RD_PPD_070902,RD_PPD_011001,RD_PPD_ 及び RD_VB_ を参照 ) を, 本剤とアドベイトとを比較する 3 種類の薬物動態試験の試料を分析するために用いた.FVIII 活性発色測定

6 2.6.4 薬物動態試験の概要文 6 法及び FVIII 抗原測定法では, 非修飾型 rfviii( アドベイト ) 及び PEG-rFVIII( 本剤 ) の両方が検出された.PEG-rFVIII 抗原の PEG 化に基づく測定法では, 予想通りアドベイトは検出されなかったが, 本剤の測定可能シグナルが示された FVIII 活性発色測定法 FVIII 活性は発色測定法で測定した. 試料をカルシウム含有緩衝液中でトロンビン,FIXa, リン脂質及び FX と混合した.FVIII はトロンビンにより活性化され, リン脂質,FIXa 及びカルシウムイオンと複合体を形成した. この複合体は FX を活性化して FXa とし, 発色基質である FXa-1 を開裂した. 遊離パラニトロアニリンの経時的変化をマイクロプレートリーダーを用いて 405 nm で測定した. 反応の傾きは試料中の FVIII 活性に比例した. 試料中の FVIII 活性は, 直近の WHO 標準品を基準として較正した社内標準品と比較して算出した. 結果は IU FVIII/mL で示した. FVIII 活性発色測定法は, 血漿試料の事前の高倍率希釈が可能であるため動物血漿のマトリックス効果を排除できることから選択した. E17 FVIII ko マウス, ラット ( 反復投与毒性試験 で本測定法を使用, 項 ) 及びカニクイザル血漿試料の FVIII 活性発色測定法のバリデーションデータを表 にまとめる. バリデーションは概して,ICH Q2(R1) ガイドライン, 分析法バリデーションに関するテキスト ( 実施項目及び実施方法 ) に従って実施した.

7 2.6.4 薬物動態試験の概要文 7 表 Summary of validation data for FVIII activity by chromogenic method in E17 FVIII Parameter Accuracy Intermediate precision Repeatability Linerarity (Range investigated) LLOQ Robustness ko mouse, rat and cynomplgus plasma samples in study RD_VB_ Acceptance criterion In vitro recovery : % Relative standard deviation : 20% Relative standard deviation : 20% Coefficient of correlation : 0.99 The lowest concentration for acceptable recovery and precision Bench top stability and freeze-thaw stability E17 FVIII ko mouse plasma 72% (0.1 IU FVIII/mL), % ( IU FVIII/mL) Result Rat plasma 58% (0.5 IU FVIII/mL), 67% (1.0 IU FVIII/mL), 81% (3.0 IU FVIII/mL), 98% (10.0 IU FVIII/mL) Cynomolgus monkey plasma % % % % % % % ( IU FVIII/mL) ( IU FVIII/mL) ( IU FVIII/mL) 0.2 IU FVIII/mL 3.0 IU FVIII/mL 1.0 IU FVIII/mL 2 hours at room temperature (82-100%) and 3 freeze-thaw cycles (88-93%) 1 hour at room temperature (85-97%) and 3 freeze-thaw cycles (87-100%) 1 hour at room temperature (86-90%) and 3 freeze-thaw cycles (89-94%) 本測定法は, 天然 FVIII と PEG-rFVIII の活性を区別しないため,PEG-rFVIII を特異的に検出しない. また, 本測定法は, 異なる動物種の FVIII 活性も区別しないため, ラット及びカニクイザルにおいて, 内因性 FVIII 活性が検出された. このベースライン値は, 本剤の投与により加算される PEG-rFVIII の活性を算出するために, 添加した血漿試料の FVIII 測定値から減じた.E17 FVIII ko マウスの血漿から FVIII 活性は検出されなかったため, 本測定法は E17 FVIII ko マウス血漿における FVIII を選択的に測定できる. 以上のように, 本測定法は E17 FVIII ko マウス, ラット及びカニクイザルの血漿における本剤の FVIII 活性の測定に適切である PEG-rFVIII 抗原測定法本剤は ELISA 法で測定した. 簡潔に記載すると, プレート結合抗 PEG 抗体を用いて PEG 部分を介して試料中の PEG-rFVIII を捕捉した. 洗浄後, 捕捉した PEG-rFVIII 量をポリクローナル抗 FVIII ペルオキシダーゼ複合体で測定した. 具体的には, 結合ペルオキシダーゼ活性を発色基質で測定した. 既知濃度の rfviii 結合 PEG を含む本剤試料を用いて作製した標準曲線により測定法の

8 2.6.4 薬物動態試験の概要文 8 較正を行った. 試料中 PEG-rFVIII 抗原量は rfviii 結合 PEG 濃度として算出した. 本測定法は PEG-rFVIII を特異的に測定及び検出し, それ以外のシグナルは示さなかった. 結果は ng rfviii 結合 PEG/mL で示した. E17 FVIII ko マウス, ラット及びカニクイザル血漿試料の ELISA 法による rfviii 結合 PEG のバリデーションデータを表 にまとめる. バリデーションは概して,ICH Q2(R1) ガイドライン, 分析法バリデーションに関するテキスト ( 実施項目及び実施方法 ) に従って実施した. バリデーションで得られたデータの評価には Findlay ら [2] が推奨する許容基準を適用した. 表 Summary of validation data for rfviii-bound PEG by ELISA method in E17 FVIII ko mouse, rat and cynomplgus plasma samples in studies RD_PPD_070902, RD_PPD_ and RD_PPD_070901, respectively Result Acceptance criterion Parameter Accuracy Intermediate precision Repeatability Linerarity (Range investigated) Specificity LLOQ Robustness Mean recovery : % (75-125% at the limit of quantification) Relative standard deviation : 20% ( 25% at the limit of quantification) Relative standard deviation Coefficient of correlation : 0.99 No reaction with native, non-pegylated FVIII The lowest concentration for acceptable recovery and precision Freeze-thaw stability E17 FVIII ko mouse plasma (RD_PPD_070902) Rat plasma (RD_PPD_011001) Cynomolgus monkey plasma (RD_PPD_070901) % % % % % % % % % (5-400 ng rfviii-bound The E17 FVIII ko mouse plasma did not elicit false positive signals. 5 ng rfviii-bound PEG/mL 4 freeze-thaw cycles (108.0%) (5-400 ng rfviii-bound The rat plasma did not elicit false positive signals. 5 ng rfviii-bound PEG/mL 4 freeze-thaw cycles (89.0%) (5-400 ng rfviii-bound The cynomolgus monkey plasma did not elicit false positive signals. 5 ng rfviii-bound PEG/mL 4 freeze-thaw cycles (101.4%) 以上のように, バリデーションデータは, 本測定法が E17 FVIII ko マウス, ラット及びカニクイザル血漿試料における本剤の測定に適していることを示した.

9 2.6.4 薬物動態試験の概要文 FVIII 抗原測定法製剤及び血漿試料中の FVIII は, プラスチック製マイクロプレートウェルの内壁にコーティングしたマウスモノクローナル抗ヒト FVIII 抗体で捕捉した. 次に, 西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したマウスモノクローナル抗ヒト FVIII 抗体を, 捕捉した FVIII の残存する遊離抗原決定基に結合させた. 結合ペルオキシダーゼ酵素を 3,3,5,5 -テトラメチルベンジジン基質との反応に基づいて定量した. 強酸による反応停止後, 発色強度は血漿試料中に予め存在する FVIII 濃度に正比例した. 結果は IU FVIII/mL で示した. 既知濃度の FVIII を含む標準血漿を用いて作製した標準曲線により測定法の較正を行った. 本測定法ではモノクローナル抗ヒト FVIII 抗体を用いたため, ヒト FVIII に選択的であり, ラット FVIII 抗原とは交差しなかった. 本測定法は, 抗ヒト FVIII 抗体とカニクイザル FVIII との高い交差反応性のため, カニクイザルの血漿試料には使用できなかった. ELISA 法によるラット血漿試料中の FVIII 抗原測定のバリデーションデータを表 にまとめる. バリデーションは概して ICH Q2(R1) ガイドライン, 分析法バリデーションに関するテキスト ( 実施項目及び実施方法 ) に従って実施した. バリデーションで得られたデータの評価には Findlay ら [2] が推奨する許容基準を適用した. 表 Summary of validation data for FVIII antigen by ELISA method in rat plasma sample in study RD_VB_ Parameter Acceptance criterion Result of rat plasma Accuracy Intermediate precision Repeatability Linerarity (Range investigated) Specificity LLOQ Robustness In vitro recovery : % Relative standard deviation : 20% Relative standard deviation : 20% Coefficient of correlation : 0.99 No FVIII antigen detectable The lowest concentration of the FVIII antigen standard Freeze-thaw stability % % % ( IU FVIII/mL) Rat plasma did not show a detectable FVIII antigen level 0.03 IU FVIII/mL (1/10 diluted samples) 3 freeze-thaw cycles (82-111%) 以上のように, 本測定法はラット血漿における本剤の FVIII 抗原の測定に適切であることが確認されている.

10 2.6.4 薬物動態試験の概要文 吸収本項では,E17 FVIII ko マウス, ラット及びカニクイザルにおいてアドベイトと比較した本剤の循環時間を評価するため, 主に AUC 0-tlast,MRT 及び t 1/2terminal について記載する. ラット及びカニクイザルにおける本剤の用量比例性についても AUC 0-tlast に基づいて記載する. 検討したすべての薬物動態パラメータは表 に示す. AUC は循環血液中の薬物量に比例する代表的な指標であり, また,MRT は薬物が循環血液中に滞留する平均時間であることから, これらはバイオアベイラビリティに関する情報が得られる主要な薬物動態変数である. また, 消失期において血漿中薬物濃度が半減するまでに要する時間である t 1/2terminal も重要な変数である E17 FVIII koマウスにおける本剤の薬物動態 (PV 試験 ) 目的 : 本試験の目的は, 本剤の非臨床用 2 ロット及びアドベイトの市販用 1 ロットを E17 FVIII ko マウスに静脈内ボーラス投与 ( 目標表示用量 200 IU FVIII/kg) し, 薬物動態プロファイルを評価することであった. 本剤 2 ロットの薬物動態プロファイルに明らかな差異がなかったため,2 ロットの結果を統合した. 方法 : 本試験はマウスを順次屠殺するデザインで実施した. 被験物質又は対照物質の静脈内投与後, 10 評価時点 (5 分,1,3,6,9,16,24,32,40 及び 48 時間後 ) においてそれぞれマウス 8 匹 ( 雌雄各 4 匹 ) から心穿刺により採血した. また, ベースライン値解析のため, 無処置動物 8 匹からも採血した. すべての血漿試料について FVIII 活性及び rfviii 結合 PEG を分析した. 結果及び結論 : FVIII 活性について, 用量補正 AUC 0-tlast,MRT 及び t 1/2terminal を表 に示す. 表 The FVIII activity dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the mouse study PV Item Nominal dose (IU FVIII/kg) n Dose-adjusted AUC 0-tlast (h IU FVIII/mL / IU FVIII/kg) BAX a [ to ] ADVATE b [ to ] a: 8 males and 8 females (The results of two lots were pooled.) b: 4 males and 4 females Point estimate [95% CI] MRT (hours) 7.9 [7.4 to 8.4] 4.9 [4.4 to 5.6] t 1/2terminal (hours) 5.9 [5.2 to 6.3] 4.3 [3.8 to 5.0]

11 2.6.4 薬物動態試験の概要文 11 本剤群の用量補正 AUC 0-tlast の点推定値 (h IU FVIII/mL /IU FVIII/kg) は であり, アドベイト群 (0.0421) の 1.9 倍であった. 本剤群の MRT の点推定値 ( 時間 ) は 7.9 であり, アドベイト群 (4.9) の 1.6 倍であった. この延長は本剤群の t 1/2terminal の点推定値 ( 時間 ) である 5.9 にも反映され, アドベイト群 (4.3) の 1.4 倍であった. 本傾向は, 両投与群における他のすべての薬物動態変数で同様であり ( 表 を参照 ),PEG 化により rfviii の循環時間が改善することが本モデルで示された. また, 本剤群の rfviii 結合 PEG を分析し, 比較可能なパラメータについて FVIII 活性の測定値を確認した.FVIII 活性及び rfviii 結合 PEG の MRT(7.9 vs. 8.0 時間 ),t 1/2terminal (5.9 vs. 6.1 時間 ), CL(12.2 vs ml/h/kg),ivr(56.3 vs. 62.5%) 及び Vss(96.1 vs ml/kg) はそれぞれ類似していた ( 表 を参照 ). アドベイト投与では rfviii 結合 PEG は検出されなかった. 以上のように, 本試験から, ヒト rfviii の PEG 化により血管内循環時間が延長し, 結果として曝露時間が増大することが示された ラットにおける本剤の薬物動態 (PV 試験 ) 目的 : 本試験の目的は, 本剤の非臨床用 2 ロット及びアドベイトの市販用 1 ロットをラットに静脈内ボーラス投与 ( 目標表示用量 200 IU FVIII/kg) し, 薬物動態プロファイルを評価することであった. また, ラット毒性試験用情報を収集するため, 本剤の非臨床用 1 ロットのより高い 2 用量 ( 350 及び 700 IU FVIII/kg) を検討した. 本剤 2 ロットの薬物動態プロファイルに明らかな差異がなかったため,2 ロットの結果を統合した. 方法 : 単一動物デザインを採用し, 各群 8 匹 ( 雌雄各 4 匹 ) の動物を用いた. 投与後,8 評価時点 (5 分, 並びに 1,4,8,12,22,32 及び 48 時間後 ) で試料を採取した. 製剤中及び血漿中の FVIII 活性を測定した. ただし, 本測定法では, 内因性ラット FVIII と投与したヒト rfviii 又は PEG-rFVIII とは区別されない. ラット FVIII 活性ベースライン値との相互作用を回避するため, ヒト FVIII に対して選択性を有しラット FVIII 抗原との交差反応を示さない FVIII 抗原を用い, すべての血漿試料について FVIII 抗原及び rfviii 結合 PEG を分析した. 本剤 3 用量の用量比例性を以下のステップアップ法により検討した. 最初に低用量と中用量の, 次に低用量と高用量の同等性を検定した. 用量補正 AUC 0-tlast に関する幾何平均値の比の 90% CI が基準範囲内 0.8~1.25[1] にある時, 同等と判断した. 結果及び結論 : FVIII 抗原について, 本試験で得られた用量補正 AUC 0-tlast,MRT 及び t 1/2terminal を表 に示す.

12 2.6.4 薬物動態試験の概要文 12 表 The FVIII antigen dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the rat study PV Item Nominal dose (IU FVIII/kg) /Actual dose (IU FVIII/kg) n Dose-adjusted AUC 0-tlast (h IU FVIII/mL / IU FVIII/kg) 200 / a [0.064 to 0.079] BAX / b [0.072 to 0.097] 700 / b [0.052 to 0.070] ADVATE 200 / b [0.043 to 0.058] a: 8 males and 8 females (The results of two lots were pooled.) b: 4 males and 4 females Geometric mean [95% CI] MRT (hours) 7.5 [6.5 to 8.7] 7.9 [6.4 to 9.7] 6.7 [5.4 to 8.2] 6.2 [5.0 to 7.6] t 1/2terminal (hours) 6.1 [5.3 to 7.1] 7.5 [6.2 to 9.2] 6.9 [5.6 to 8.4] 5.5 [4.5 to 6.7] 本剤の低用量群では, 用量補正 AUC 0-tlast の幾何平均値 (h IU FVIII/mL /IU FVIII/kg) は であり, アドベイト群の AUC 0-tlast (0.050) の 1.4 倍であった. また,MRT の幾何平均値 ( 時間 ) である 7.5 はアドベイト群 (6.2) の 1.2 倍であり,t 1/2terminal の幾何平均値 ( 時間 ) である 6.1 はアドベイト群 (5.5) の 1.1 倍であった. 本傾向は, これら投与群における他のすべての薬物動態変数で同様であり ( 表 を参照 ),PEG 化により rfviii の循環時間が改善することが本モデルで示された. 本剤の中用量群では, 用量補正 AUC 0-tlast の幾何平均値 (h IU FVIII/mL /IU FVIII/kg) は であり, 本剤の低用量群 (0.071) の 1.2 倍, 本剤の高用量群 (0.060) の 1.4 倍であった. rfviii 結合 PEG について, 本試験で得られた用量補正 AUC 0-tlast,MRT 及び t 1/2terminal を表 に示す. アドベイトの投与により rfviii 結合 PEG は検出されなかった.

13 2.6.4 薬物動態試験の概要文 13 表 The rfviii-bound PEG dose-adjusted AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the rat study PV Item Nominal dose (IU FVIII/kg) /Actual dose (ng rfviii-bound PEG/kg) n Dose-adjusted AUC 0-tlast (h ng rfviii-bound PEG/mL / ng rfviii-bound PEG/kg) 200 / a [0.046 to 0.058] BAX / b [0.055 to 0.077] 700 / b [0.054 to 0.075] a: 8 males and 8 females (The results of two lots were pooled.) b: 4 males and 4 females Geometric mean [95% CI] MRT (hours) 10.7 [9.1 to 12.7] 8.9 [7.0 to 11.3] 10.4 [8.2 to 13.2] t 1/2terminal (hours) 8.3 [7.0 to 9.9] 9.0 [7.0 to 11.6] 11.3 [8.8 to 14.5] 本剤低用量群では, 用量補正 AUC 0-tlast の幾何平均値 (h ng rfviii 結合 PEG/mL /ng rfvii 結合 PEG/kg) は であり, 本剤の中用量群及び高用量群の用量補正 AUC 0-tlast ( それぞれ 及び 0.064) の約 80% であった. 本剤の用量比例性は統計学的に検出されなかった.FVIII 抗原については, 用量補正 AUC 0-tlast の低用量 : 中用量の比は 0.851(90% CI:0.732~0.989), 低用量 : 高用量の比は 1.188(90% CI: 1.022~1.381) であり,rFVIII 結合 PEG については, 用量補正 AUC 0-tlast の低用量 : 中用量の比は 0.784(90% CI:0.664~0.926), 低用量 : 高用量の比は 0.805(90% CI:0.681~0.951) と,0.8~ 1.25 の基準範囲 [1] に基づく用量比例性は示されなかった. 本剤の低用量投与後,rFVIII 結合 PEG の薬物動態プロファイルは,FVIII 抗原の薬物動態プロファイルと類似するパターンを示した ( 表 を参照 ). 主な差異は,FVIII 抗原の MRT が 7.5 時間及び t 1/2terminal が 6.1 時間であったのに対し,rFVIII 結合 PEG の MRT が 10.7 時間及び t 1/2terminal が 8.3 時間と長かった点であった. したがって,rFVIII と PEG の結合により循環時間が延長する. 以上のように, 本剤の用量比例性は, 統計学的に検出されなかったが, 本動物モデルでは起こり得る範囲内であった. 本試験から, ヒト rfviii の PEG 化により循環時間が延長し, 結果として曝露時間が増大することが明らかにされた カニクイザルにおける薬物動態を含む本剤の用量漸増及び予備的 4 週間反復静脈内投与毒性試験 ( 試験 ) 目的 : 本試験の目的は, カニクイザルに本剤 2 ロットを静脈内投与して薬物動態プロファイルを評価し,NOAEL, 臨床用量に対する安全域及び反復投与に適した用量を検討することであった. 本試験における安全性の結果及び考察は毒性の 項に記載する.

14 2.6.4 薬物動態試験の概要文 14 方法 : カニクイザルに本剤 2 ロットを 350,700 又は 1,500 IU FVIII/kg の表示用量で, アドベイトを 350 IU FVIII/kg の表示用量で静脈内投与した ( 表 を参照 ). 表 Dose levels and schedule of the escalating dose / PK phase of the cynomolgus monkey study Group Group description a Nominal dose Number of animals Day of study No. (IU FVIII/kg) Male Female 1 BAX 855 lot b 2 b 2 BAX 855 lot b 2 b 3 BAX 855 lot BAX 855 lot c 2 c 4 ADVATE a: lot 1 refers to BAX 855 lot and lot 2 refers to BAX 855 lot. b: Same animals as for 700 IU FVIII/kg (Day 1) c: Same animals as for 350 IU FVIII/kg BAX 855 lot 1 (Day 1) 投与前, 並びに 1 及び 8 日目の投与後 5 及び 30 分, 並びに 2,6,12,24,48,60,72,96, 108 及び 120 時間の時点で, すべての動物 (1~4 群 ) から採血した. 血漿試料中の FVIII 活性及び rfviii 結合 PEG を分析し, それぞれについて薬物動態を解析した. FVIII 活性測定では, 内因性のサル FVIII 活性とヒト rfviii 活性は区別されない. したがって, 被験物質の投与前にすべてのサルでベースライン FVIII 活性が検出された. 本剤又はアドベイトの投与後, カニクイザルにおける FVIII 活性は上昇し, 続いて経時的に低下した. 本剤のロット毎に冪乗則モデル [3] を用いて, 用量比例性を AUC 0-tlast に基づき探索的に評価した. 結果及び結論 : FVIII 活性について, 本試験で得られた AUC 0-tlast,MRT 及び t 1/2terminal を表 に示す. 低用量 ( 表示用量 :350 IU FVIII/kg) において,AUC 0-tlast の幾何平均値 (h IU FVIII/mL) は, 本剤のロット 1 で 61, 本剤のロット 2 で 77 及びアドベイトで 47 であった.MRT の幾何平均値 ( 時間 ) は, 本剤のロット 1 で 10.7, 本剤のロット 2 で 12.3 及びアドベイトで 7.5 であった.t 1/2terminal の幾何平均値 ( 時間 ) は, 本剤のロット 1 で 9.0, 本剤のロット 2 で 9.8 及びアドベイトで 5.7 であった. これらの値に基づいて, 本剤の各薬物動態パラメータをアドベイトと比較すると, ロット 1 及び 2 で AUC 0-tlast の幾何平均値はそれぞれ 1.3 及び 1.6 倍大きく, また,MRT の幾何平均値はそれぞれ 1.4 及び 1.6 倍,t 1/2terminal の幾何平均値はそれぞれ 1.6 及び 1.7 倍長かった.

15 2.6.4 薬物動態試験の概要文 15 表 The FVIII activity AUC 0-tlast, MRT and t 1/2terminal of the cynomolgus monkey study Item Nominal dose (IU FVIII/kg) /Actual dose (IU FVIII/kg) n AUC 0-tlast (h IU FVIII/mL) Geometric mean [95% CI] MRT (hours) t 1/2terminal (hours) BAX 855 lot. 1 BAX 855 lot / a 61 [45 to 83] 700 / a 105 [57 to 194] 1500 / a 158 [99 to 250] 350 / a 77 [38 to 156] 700 / a 165 [85 to 321] 1500 / a 298 [174 to 509] ADVATE 350 / a 47 [20 to 109] a: 2 males and 2 females 10.7 [9.3 to 12.3] 10.1 [6.1 to 16.6] 9.6 [8.2 to 11.3] 12.3 [5.8 to 26.0] 14.0 [7.0 to 28.0] 12.2 [9.0 to 16.6] 7.5 [1.8 to 31.8] 9.0 [6.7 to 12.2] 8.0 [5.1 to 12.7] 8.0 [5.5 to 11.7] 9.8 [3.9 to 24.5] 12.6 [4.1 to 38.7] 10.4 [7.6 to 14.2] 5.7 [1.1 to 29.1] 予想通り, 対照試料 ( アドベイト群 ) では rfviii 結合 PEG は検出されず, 本剤を投与したすべての動物の血漿試料では rfviii 結合 PEG が測定された. また,rFVIII 結合 PEG 濃度は経時的に低下し, 高用量の本剤を投与した動物ほど高濃度が検出された. FVIII 活性及び rfviii 結合 PEG の AUC 0-tlast に基づく用量比例性の詳細を表 に示す.

16 2.6.4 薬物動態試験の概要文 16 表 AUC 0-tlast and dose proportionality for the PK phase of the cynomolgus monkey study Item ADVATE BAX 855 lot 1 BAX 855 lot 2 Nominal dose (IU FVIII/kg) FVIII activity Actual dose (IU FVIII/kg) Geometric mean of AUC 0-tlast (h IU FVIII/mL) [95% CI] Doubling of dose increased AUC [95% CI] rfviii-bound PEG Actual dose (ng rfviii-bound PEG/kg) Geometric mean of AUC 0-tlast (h ng rfviii-bound [95% CI] Doubling of dose increased AUC [95% CI] n=4 (2 males and 2 females) -: not applicable [20 to 109] 61 [45 to 83] 105 [57 to 194] 158 [99 to 250] 77 [38 to 156] 165 [85 to 321] x [1.33 to 1.72] 1.85x [1.51 to 2.27] 298 [174 to 509] [1106 to 1823] 2984 [1948 to 4572] 4651 [2901 to 7456] 2463 [1275 to 4756] 5571 [4488 to 6916] x [1.35 to 1.60] 2.00x [1.66 to 2.40] [8216 to 17842] 用量を 2 倍にした時の AUC 0-tlast の増加は,FVIII 活性についてはロット 1 で 1.51(95% CI:1.33 ~1.72), ロット 2 で 1.85(95% CI:1.51~2.27),rFVIII 結合 PEG についてはロット 1 で 1.47 (95% CI:1.35~1.60), ロット 2 で 2.00(95% CI:1.66~2.40) と推定された. ロット 1 の FVIII 活性及び rfviii 結合 PEG 共に両側 95% CI の上限が 2 よりも小さかったことから, 用量比例性を下回る増加は有意水準 5% で統計学的に有意であった. これらの結果から, 検討した用量範囲において, ロット 2 では用量に比例した AUC 0-tlast の増加が, ロット 1 では用量比例性を下回る増加が示された. 試験結果のばらつきは, カニクイザルの内因性 FVIII 活性レベルのため, 予想されるものであった. 以上のように, カニクイザルを用いた本試験から, ヒト rfviii の PEG 化により循環時間が延長することが明らかにされた ラット静脈内投与後の [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) の吸収, 代謝, 分布及び排泄 ( 試験 ) 目的 :

17 2.6.4 薬物動態試験の概要文 17 本試験の目的は, ラットに [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) を単回静脈内投与後の [ 3 H] PEG-rFVIII に由来する放射能の薬物動態, 並びに吸収, 分布及び消失の程度を評価することであった.[ 3 H] PEG-rFVIII ( ) 及びその代謝物の代謝プロファイルも特定試料において検討した. 方法 : [ 3 H] PEG-rFVIII はトリチウム化した [ 3 H] PEG 試薬の結合により合成し,rFVIII に結合した PEG 骨格ではいくつかの水素 [ 1 H] がトリチウム原子 [ 3 H] により交換された. 本剤の標識体は, 他の非臨床試験で用いた本剤の非標識体と同等の有効成分を生産する, 類似の工程で調製された. [ 3 H] PEG-rFVIII の比活性は, 他の非臨床 in vivo 試験で用いた非臨床用 4 ロットの比活性の範囲 (3,691.6~4,355.7 IU FVIII/mg たん白質 ) を下回っていた. 予測される放射性分解による経時的な活性の漸減を制限するために, 本試験の in vivo 部分は標識体合成後可能な限り速やかに開始するようにデザインした. したがって, 放射性標識体は標準的設備を備えていない別施設 ( ) で調製しなければならなかった. 調製の違いにもかかわらず, 保持された放射活性は小規模なバッチとしては妥当な高さであると考えられた. したがって,FVIII 活性に認められた差異は [ 3 H] PEG-rFVIII の分布に影響を及ぼさないと判断された. 雌雄の Sprague Dawley 系ラットに [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) を単回静脈内投与して放射活性の吸収, 分布, 代謝及び消失を検討した. 排泄物及び血液採取用動物に, 目標容量 0.68 ml/kg で表示用量 1 mg/kg の [ 3 H] PEG-rFVIII を単回静脈内投与した. 全身オートラジオグラフィ用の動物には, 目標容量 1.36 ml/kg で表示用量 2 mg/kg を単回静脈内投与した. 両用量共に, 用いた検出方法 ( 液体シンチレーション計測法, オートラジオグラフィ ) で 6 週にわたり十分に高い放射活性が測定可能であった. 試験デザインを表 に示す. 比活性が 2,088 IU FVIII/mg の時, これらの単回投与量 (1 又は 2 mg/kg) はそれぞれ FVIII 活性の表示用量 2,088 又は 4,176 IU FVIII/kg に相当する. 表 Design of the rat ADME study Number Nominal dose Target dose Group of animals (mg/kg)/actual volume No. Male Female dose a (mg/kg) (ml/kg) Samples collected / Urine, Feces, Tissues, and Carcass / Blood, Tissues, and Carcass / Blood and Carcasses for Whole-Body Autoradiography a: The radioactivity dose for Groups 1 and 2 was μci/kg and µci/kg for Group 3. 試料の採取手順を以下に記載する. < 第 1 群 >

18 2.6.4 薬物動態試験の概要文 18 放射活性の排泄及びマスバランス分析のため, 第 1 群の動物から以下の試料を採取した. 尿は投与後 0~8 時間及び 8~24 時間, 並びに投与後 1,008 時間まで 24 時間間隔で採取した. 糞は投与後 1,008 時間まで 24 時間間隔で採取した. 投与後 336 及び 672 時間を除き,984 時間までの各 24 時間の採取間隔毎にケージを約 30 ml の水で洗浄した. 各試料の重量を記録した. 投与後 336 及び 672 時間の時点では, 排泄物採取後に動物を清潔なケージに移した. 投与後 336 及び 672 時間, 並びに最後の排泄物採取後, ケージを 1% リン酸三ナトリウム水溶液で洗浄し, ガーゼで拭き取った. ケージ洗浄液及びガーゼを回収し, 重量を記録した. 各動物から組織を摘出し, 適宜, 生理食塩液で洗浄して水分を拭き取り, 重量を測定した. < 第 2 群 > 投与後 0.083,0.25,0.5,1,3,5,8,12,24,48,72,168,336,504,672 及び 1,008 時間の各時点で雌雄各 2 匹の動物の頸静脈から血液 ( 約 1.5 ml) を採取し,3.8% クエン酸ナトリウム緩衝液を含む試験管に移した. 動物一匹からの採血は 2 時点のみとした (1 及び 2 回目の採血時間の組合せ :0.083/1,0.25/8,0.5/24,3/168,5/336,12/504,48/672,72/1,008 時間 ). 血液は, 放射能測定用に分取するまで氷上に置き, 血漿を得るために遠心分離した. 投与後 1,8,24,168 及び 672 時間の 2 回目の採血に続いて, プロファイリング用にイソフルラン麻酔下で心穿刺により血液 ( 約 4.5 ml) を採取した. 組織を摘出し, 適宜, 生理食塩液で洗浄して水分を拭き取り, 重量を測定した. < 第 3 群 > 投与後 1,8,24 及び 168 時間の各時点で雌雄各 1 匹の動物の頸静脈から血液 ( 約 2 ml) を採取し,3.8% クエン酸ナトリウム緩衝液を含む試験管に移した. 試料は分取するまで氷上に置き, 血漿を得るために遠心分離した. 各動物を過量のイソフルラン麻酔により屠殺し, 直ちにヘキサン / ドライアイス中で約 5 分間凍結し, 全身オートラジオグラフィに供した. 採取試料における放射活性濃度は, 液体シンチレーション計測法又は全身オートラジオグラフィにより測定した. 代謝物プロファイルは HPLC により測定した. 結果及び結論 : [ 吸収 ] 最初の採取時点における血液中及び血漿中放射活性の最高平均濃度は, 雄ではそれぞれ 17,800 及び 24,200 ng Eq/g, 雌ではそれぞれ 16,900 及び 23,300 ng Eq/g であった ( 表 ).

19 2.6.4 薬物動態試験の概要文 19 表 Average concentrations of radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) Collection ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII ( )/g time point Blood Plasma (hours) Male Female Male Female NS NS animals/sex/time point NS: no sample 放射活性は, 血液及び血漿から雄ではそれぞれ 827 及び 655 時間, 雌ではそれぞれ 306 及び 276 時間の t 1/2 を以て消失した. 血液中及び血漿中平均 AUC 0- 値は, 雄ではそれぞれ 307,000 及び 448,000 h ng Eq/g, 雌ではそれぞれ 327,000 及び 447,000 h ng Eq /g であった ( 表 ). 表 PK parameters for radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) Matrix Blood Plasma Sex T max (hours) C 0 (ng Eq/g) C max (ng Eq/g) t 1/2 (hours) AUC 0-t (h ng Eq/g) AUC 0- (h ng Eq/g) Male Female Male Female 血液中及び血漿中濃度データ ( 表 ), 並びに薬物動態パラメータ ( 表 ) にはわずかに性差があり, 雄で見かけの t 1/2 が長かったが,[ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性への曝露量は同程度であった. 雄での長い t 1/2 は, 主に 1,008 時間後の濃度が高かったためと考えられる ( 表 ). 血液 : 血漿中濃度比の平均値 ( 表 ) から,[ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性と血液の細胞成分との結合は強くないことが示唆される.

20 2.6.4 薬物動態試験の概要文 20 表 Average blood:plasma concentration ratios of radioactivity in blood and plasma from rats (Study , Group 2) Collection time point Blood:Plasma Concentration ratios (hours) Male Female NS NS animals/sex/time point NS: no sample 低濃度のトリチウム水が, 雌雄ラットの血漿おいて複数の時点で認められた. トリチウム水は, PEG 構造中の放射性トリチウム (T) と水中の非放射性水素 (H) の置換を示す. この置換は PEG のトリチウム化の安定性に関連する. 投与後 1,008 時間までの放射活性の平均パーセンテージとして表した血漿試料中トリチウム水は, 雄では 0.0~11.4%, 雌では 0.0~12.6% であった. 最高レベルのトリチウム水は概して遅い時点で認められた. ただし, トリチウム水の見かけの増加は低濃度の放射活性で最も顕著であり, 試験期間を通して血漿中トリチウム水の実質的な時間依存性の増加は明らかでなかった. [ 分布 ] [ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性の分布は雌雄共に広範であり, 血液及び血漿, 並びにすべての分析マトリックスにおいて放射活性が定量可能であった. 組織における放射活性の C max は 1,8,24 及び 168 時間後の採取時に観察された. 放射活性の最高濃度は, 血漿, 血液及び腎臓では雌雄共に投与後 1 時間, 副腎では 1( 雌 ) 又は 24( 雄 ) 時間, 脾臓及び肝臓では雌雄共に 24 時間, 並びに腸間膜リンパ節では 24( 雄 ) 又は 168( 雌 ) 時間の時点で認められた ( 表 ).

21 2.6.4 薬物動態試験の概要文 21 表 Average concentrations of radioactivity in blood, plasma and tissues from rats Tissue Adrenal glands Bladder (urinary) Blood Bone (both femurs) Bone marrow (both femurs) Brain Cecum Cecum contents/wash Eyes (both) Eyes (lens) Fat (reproductive) Heart Kidneys Lacrimal gland Large intestine Large intestine contents/wash Liver Lungs Lymph nodes (mesenteric) Muscle (thigh) Ovaries Pancreas Pituitary gland Prostate (Study , Group 2) ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII ( )/g Sex Collection time (hours) male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female

22 2.6.4 薬物動態試験の概要文 22 Plasma 表 Average concentrations of radioactivity in blood, plasma and tissues from rats Tissue Salivary glands Skin (dorsal, shaved) Small intestine Small intestine contents/wash Spleen Stomach Stomach contents/wash Testes Thymus Thyroid Uterus 2 animals/sex/time point -: not applicable (Study , Group 2)( 続き ) ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII ( )/g Sex Collection time (hours) male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female male female

23 2.6.4 薬物動態試験の概要文 23 図 の全身オートラジオグラフィは, ラットに 4,176 IU FVIII/kg の表示用量を単回投与後 168 時間 (1 週間 ) の [ 3 H] PEG-rFVIII の分布を図示する. 図 Whole-body autoradiograph for female animal at 168 hours (Study , Group 3)

24 2.6.4 薬物動態試験の概要文 24 全身オートラジオグラフィにより分析した脾臓における放射活性は, ほとんどが赤色脾髄内の斑紋状放射活性像を呈した. トリチウム水の分布は血漿と組織の間で一致すると推測される. したがって, トリチウム水の存在が試験期間を通じて血漿に対する組織中放射活性濃度比又は分布結果に影響を及ぼすことは推測し難い. [ 代謝 ] 血漿, 尿, 糞, 腎臓, 肝臓及び肺試料について, 親化合物及びその代謝物のプロファイリングを行った. < 血漿 > クロマトグラフィーは,[ 3 H] PEG-rFVIII, 高分子量代謝物 1 か所及び低分子量代謝物 4 か所の放射活性画分を示した. 親化合物の溶出時間より早期に認められた画分は親化合物よりも分子量が大きい可能性がある. 最終画分 ( 画分 5) の保持時間は,[ 3 H] PEG-rFVIII を生成する PEG 化試薬である及び加水分解されたと一致する.[ 3 H] PEG-rFVIII 合成中に基が開裂するため, この物質はの加水分解物と考えられ, 基を含まない. 放射活性のうち [ 3 H] PEG-rFVIII が占める平均パーセンテージは長時間にわたりほぼ一定であり, 雄で 37.1(1 時間 )~41.3(12 時間 )%, 雌で 30.6(3 時間 )~39.2(12 時間 )% であった. 投与後 1 時間における [ 3 H] PEG-rFVIII 濃度は, 雌雄共に平均 6,020 ng Eq/g であった. 投与後 48 時間までに親化合物の平均濃度は, 雄及び雌でそれぞれ 953 及び 907 ng Eq/g まで低下した ( 表 ).

25 2.6.4 薬物動態試験の概要文 25 Peak 1 Parent 表 Average percent and average concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in plasma samples from rats (Study , Retenti on time (min) Total Proposed identificatio n Metabolites Parent Metabolites Metabolites Metabolites Metabolites Group 2) Concentration Percent of radioactivity (ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII injected (% of run) Sex ( )/g) Collection time (hours) male NS NS 0 female a male NS NS 953 female a male NS NS 785 female a male NS NS 141 female a male NS NS 129 female a male NS NS 428 female a male NS NS 2440 female animals/sex/time point Parent: [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) NS: peak not detected or below the limit of quantitation. a: n=1 because peak not detected or below the limit of quantitation for one animal. < 尿 > プールした尿のプロファイリングは,[ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性が 3 か所の幅広い画分として溶出し, 親化合物よりも低分子量の物質と一致することを示した.[ 3 H] PEG-rFVIII に近似する保持時間を示す画分はなかった. 放射活性の最終の幅広い画分は, 及び加水分解されたに類似する保持特性を示した. 前述のように, 基は [ 3 H] PEG-rFVIII の合成で失われたため, この物質はの加水分解物の可能性がある. 雄では 3 か所の画分は平均してそれぞれ 7.9,28.8 及び 63.1% を占め, 投与量の 3.5,13.0 及び 28.4% に相当した. 雌では 3 か所の画分は平均してそれぞれ 6.2,21.5 及び 71.6% を占め, 投与量の 3.0, 10.7 及び 35.4% に相当した ( 表 ).

26 2.6.4 薬物動態試験の概要文 26 Peak animals/sex 表 Mean percent of sample radioactivity and mean percent of radioactive dose for Retenti on time (min) metabolites in 0- to 576-hour pooled urine from rats (Study , Group 1) Total Proposed identificatio n Metabolites Metabolites Metabolites Percent of radioactivity Percent of radioactive dose Sex injected (% of run) (%) Pool time hours Mean SD Mean SD male female male female male female male female < 糞 > プールした糞試料は放射活性が非常に低かった. プールした糞のプロファイリングは, 親化合物よりも低分子量の物質と一致する保持時間を有する,1 か所の [ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性画分を示した. この放射活性物質の画分はの加水分解物と同じ保持特性を有していた. 雄及び雌からの糞は, この画分がそれぞれ 80.2 及び 82.5% を占め, 投与量の 6.9 及び 10.7% に相当することを示した ( 表 ). 表 Mean percent of sample radioactivity and mean percent of radioactive dose for metabolites in 0- to 504 (male)/408 (female)-hour pooled feces from rats (Study , Group 1) Percent of radioactivity Percent of radioactive dose Retenti Proposed injected (% of run) (%) Peak on time Sex identification Pool time (male)/408 (female) hours (min) Mean SD Mean SD male Metabolites 7.58 female animals/sex < 腎臓 > 投与後 1 時間における雌雄の腎臓プロファイルは, 低濃度の [ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性を示した. 親化合物の放射活性はそれぞれ 14.9 及び 17.5% を占め, その濃度は 333 及び 384 ng Eq/g であった. 画分 4 はの加水分解物に近似する保持特性を示し, 雄及び雌でそれぞれ 27.9 及び 27.4% を占め, その濃度は 625 及び 599 ng Eq/g であった. 投与後 24 時間の腎臓試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 10.1 及び 9.0% を占め, その濃度は 145 及び 192 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 26.8 及び 31.2% を占め, その濃度は 385 及び 664 ng Eq/g であった.

27 2.6.4 薬物動態試験の概要文 27 投与後 168 時間の腎臓試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 2.6 及び 2.3% を占め, そ の濃度は 23 及び 23 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 28.3 及び 28.3% を占め, その濃度は 254 及 び 289 ng Eq/g であった ( 表 ). Peak Parent 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in kidney from rats (Study , Group 2) Retenti on time (min) Total Proposed identification Parent Metabolites Metabolites Metabolites Metabolites 1 animal/sex/time point Parent: [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) Concentration Percent of radioactivity (ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII injected (% of run) Sex ( )/g) Collection time (hours) male female male female male female male female male female male female < 肝臓 > 投与後 1 時間における雌雄の肝臓プロファイルは, 低濃度の [ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性を示した. 親化合物の放射活性はそれぞれ 7.0 及び 1.7% を占め, その濃度は 221 及び 80 ng Eq/g であった. 画分 4 はの加水分解物に近似する保持特性を示し, 雄及び雌でそれぞれ 27.6 及び 30.9% を占め, その濃度は 867 及び 1,430 ng Eq/g であった. 投与後 24 時間の肝臓試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 1.5 及び 0.4% を占め, その濃度は 111 及び 41 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 29.3 及び 31.8% を占め, その濃度は 2,160 及び 3,030 ng Eq/g であった. 投与後 168 時間の肝臓試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 2.7 及び 0.8% を占め, その濃度は 119 及び 41 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 26.9 及び 32.4% を占め, その濃度は 1,200 及び 1,570 ng Eq/g であった ( 表 ).

28 2.6.4 薬物動態試験の概要文 28 Peak 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in liver from rats (Study , Group 2) Retention time (min) Proposed identification Parent Parent Metabolites Metabolites Metabolites Metabolites Total 1 animal/sex/time point Parent: [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) Sex Percent of radioactivity injected (% of run) Concentration (ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII ( )/g) Collection time (hours) male female male female male female male female male female male female < 肺 > 投与後 1 時間における雌雄の肺プロファイルは, 低濃度の [ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性を示した. 親化合物の放射活性はそれぞれ 14.2 及び 12.3% を占め, その濃度は 170 及び 163 ng Eq/g であった. 画分 4 はの加水分解物に近似する保持特性を示し, 雄及び雌でそれぞれ 23.6 及び 23.9% を占め, その濃度は 283 及び 316 ng Eq/g であった. 投与後 24 時間の肺試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 14.1 及び 18.6% を占め, その濃度は 118 及び 123 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 23.4 及び 22.0% を占め, その濃度は 195 及び 146 ng Eq/g であった. 投与後 168 時間の肺試料では, 雄及び雌で [ 3 H] PEG-rFVIII がそれぞれ 4.7 及び 4.2% を占め, その濃度は 15 及び 12 ng Eq/g であり, 画分 4 がそれぞれ 23.4 及び 26.0% を占め, その濃度は 73 及び 77 ng Eq/g であった ( 表 ).

29 2.6.4 薬物動態試験の概要文 29 Peak 表 Percent and concentration of radioactivity for [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) and metabolites in lung from rats (Study , Group 2) Retention time (min) Proposed identification Parent Parent Metabolites Metabolites Metabolites Metabolites Total 1 animal/sex/time point Parent: [ 3 H] PEG-rFVIII ( ) Percent of radioactivity injected (% of run) Concentration (ng Eq [ 3 H] PEG-rFVIII ( )/g) Sex Collection time (hours) male female male female male female male female male female male female [ 排泄 ] 静脈内投与後, 放射活性は主に尿を介して消失した. 投与後 1,008 時間における尿, 糞及び毎日のケージ洗液には, 雄で投与量のそれぞれ 51.9,38.4 及び 4.0%, 雌で投与量のそれぞれ 55.7, 44.9 及び 3.5% が認められた. 雄及び雌での総回収率の平均値は, それぞれ 97.4 及び 107.0% であった ( 表 , 図 ). 表 Mean percent of radioactive dose in urine, feces, cage rinse, cage wash and cage wipe from rats (Study , Group 1) Percent of radioactivity dose (%) Sample Male Female Mean SD Mean SD Urine Feces Cage rinse Cage wash Cage wipe Total animals/sex

30 2.6.4 薬物動態試験の概要文 30 Group 1 Males 100 Percent of Radioactive Dose Urine Feces Cage Rinse Total Time (Hours) Group 1 Females Percent of Radioactive Dose Urine Feces Cage Rinse Total Time (Hours) 図 Excretion data of male and female rats (Study , Group 1) いずれの採取間隔においても, 尿中には放射活性の平均パーセンテージとして表した低濃度のトリチウム水が認められ, その値の範囲は雄で 1.5~10.2%, 雌で 1.5~17.9% であった. 投与後 0 ~1,008 時間の尿においてトリチウム水として排泄された用量の総パーセンテージは, 雄で 3.5%, 雌で 4.1% であった.

31 2.6.4 薬物動態試験の概要文 31 以上のように, 本試験結果から, 放射性標識した本剤は細胞性血液成分に結合することなく分析した組織に分布し, 放射活性は尿及び糞を介して 6 週以内に定量的に排泄されることが示された 分布 試験において,[ 3 H] PEG-rFVIII ( ) の分布を雌雄 Sprague Dawley ラットに単回静脈内投与後に検討した ( 項を参照 ) 代謝 ( 動物間の比較 ) 試験において,[ 3 H] PEG-rFVIII ( ) の代謝を雌雄 Sprague Dawley ラットに単回静脈内投与後に検討した ( 項を参照 ) 排泄 試験において,[ 3 H] PEG-rFVIII ( ) の消失を雌雄 Sprague Dawley ラットに単回静脈内投与後に検討した ( 項を参照 ) 薬物動態学的薬物相互作用本剤は単独投与されるため薬物動態学的薬物相互作用試験は実施しなかった その他の薬物動態試験その他の薬物動態試験は実施しなかった 考察及び結論本剤の薬物動態プロファイルを E17 FVIII ko マウス, 並びに正常ラット及びカニクイザルでアドベイトと比較評価した. また, ラット及びカニクイザルの主要毒性試験にトキシコキネティクス評価を含め, これらの結果を 項にまとめる. 薬物動態試験の主要評価項目は, 本剤のバイオアベイラビリティを評価するための AUC0-tlast, 血液中循環時間の延長の可能性を検討するための MRT とし, 消失期における血漿中薬物濃度半減期である t 1/2terminal も重要な変数として評価した. E17 FVIII ko マウスにおける FVIII 活性については, 本剤群の用量補正 AUC 0-tlast の点推定値はアドベイト群の 1.9 倍であり ( それぞれ, 及び h IU FVIII/mL /IU FVIII/kg),MRT の点推定値はアドベイト群の 1.6 倍であり ( それぞれ,7.9 及び 4.9 時間 ),t 1/2terminal の点推定値はアドベイト群の 1.4 倍に延長することが示された ( それぞれ,5.9 及び 4.3 時間 ). ラット及びカニクイザルのような止血機能が正常な動物モデルでは, ヒト FVIII 活性の測定値は内因性 FVIII 濃度の影響を受ける. そのため, ラットではこの影響を回避するため,FVIII 抗原測定法を採用した. 本測定法はラット FVIII と交差反応性を示さないため, ラットにおいてヒト FVIII 及び本剤を選択的に測定可能であった. しかしながら, 本測定法はカニクイザル FVIII と反応するためヒト FVIII を選択的に測定できなかったことから, カニクイザルでは FVIII 活性測定法

32 2.6.4 薬物動態試験の概要文 32 を採用し, 本剤の投与により加算される活性を算出するために, 添加した血漿試料で測定した FVIII 活性値から内因性ベースライン値を減じて補正した. ラットに本剤を単回投与した時,FVIII 抗原の用量補正 AUC 0-tlast の幾何平均値はアドベイトの 1.4 倍であり ( それぞれ,0.071 及び h IU FVIII/mL /IU FVIII/kg),MRT の幾何平均値はアドベイトの 1.2 倍であり ( それぞれ,7.5 及び 6.2 時間 ),t 1/2terminal の幾何平均値はアドベイトと比較して 1.1 倍に延長した ( それぞれ,6.1 及び 5.5 時間 ). 本剤の用量比例性は, 統計学的に検出されなかったが, 本動物モデルでは起こり得る範囲内であった. カニクイザルに本剤 2 ロット ( 350,700 及び 1,500 IU FVIII/kg) 又はアドベイト (350 IU FVIII/kg) を投与した時の FVIII 活性について, 本剤低用量の 350 IU FVIII/kg での AUC 0-tlast の幾何平均値はアドベイト群と比較してそれぞれ 1.3( ロット 1) 及び 1.6( ロット 2) 倍大きく ( それぞれ,61 [ ロット 1],77[ ロット 2] 及び 47[ アドベイト ]h IU FVIII/mL),MRT の幾何平均値はアドベイト群と比較してそれぞれ 1.4( ロット 1) 及び 1.6( ロット 2) 倍長く ( それぞれ,10.7[ ロット 1],12.3[ ロット 2] 及び 7.5[ アドベイト ] 時間 ),t 1/2terminal の幾何平均値はアドベイト群と比較してそれぞれ 1.6( ロット 1) 及び 1.7( ロット 2) 倍長かった ( それぞれ,9.0[ ロット 1], 9.8[ ロット 2] 及び 5.7[ アドベイト ] 時間 ). 放射性標識した本剤をラットに単回静脈内投与して放射活性の吸収, 分布, 代謝及び消失を検討した. 薬物動態パラメータにわずかな性差があり雄の t 1/2 が長かったが,[ 3 H] PEG-rFVIII 由来放射活性への曝露量は同程度であった.[ 3 H] PEG-rFVIII は体内に分布し, 放射活性の最高濃度は, 血漿, 血液, 腸間膜リンパ節, 脾臓, 肝臓, 副腎及び腎臓で認められた. 放射活性は 276 時間 ( 血漿, 雌 ) 以上の t 1/2 で血液循環から除去され, 主な消失経路は尿であった. 平均総回収率から, 単回投与後 1,008 時間での完全な排泄が示されている. 以上のように,E17 FVIII ko マウス, 並びに正常ラット及びカニクイザルにおける薬物動態から, アドベイトと比較して本剤において FVIII 活性又は FVIII 抗原の循環時間が長く, 結果として, FVIII への曝露時間が延長することが示された.[ 3 H] PEG-rFVIII をラットに単回静脈内投与し, その動態を 6 週まで追及した結果,[ 3 H] PEG-rFVIII は分析した組織に分布し, 放射活性は糞中排泄を伴いながら主に尿を介して排泄され, 投与した総放射活性は 6 週以内に消失した 図表図表は適切な項に示す. 参考文献一覧 1. FDA. Guidance for Industory: Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence Findlay JWA, Smith WC, Lee JW, Nordblom GD, Das I, DeSilva BS, et al. Validation of immunoassays for bioanalysis: a pharmaceutical industry perspective. J Pharm Biomed Anal. 2000;21:

33 2.6.4 薬物動態試験の概要文 Gough K, Hutchison M, Keene O, Byrom B, Ellis S, Lacey L, et al. Assessment of dose proportionality: Report from the statisticians in the pharmaceutical industry/pharmacokinetics UK joint working party. Drug Inf J. 1995;29:

34 2.6.5 薬物動態試験概要表 薬物動態試験概要表

35 2.6.5 薬物動態試験概要表 2 目次 略号一覧 薬物動態試験概要表 薬物動態試験 : 一覧表 分析方法及びバリデーション試験 薬物動態試験 : 吸収 : 単回投与 薬物動態試験 : 吸収 : 反復投与 薬物動態試験 : 分布 薬物動態試験 : たん白結合 薬物動態試験 : 妊娠又は授乳動物における試験 薬物動態試験 : その他の分布試験 薬物動態試験 : 代謝 :In Vivo 薬物動態試験 : 代謝 :In Vitro 薬物動態試験 : 推定代謝経路 薬物動態試験 : 薬物代謝酵素の誘導 / 阻害 薬物動態試験 : 排泄 薬物動態試験 : 排泄 : 胆汁中 薬物動態試験 : 薬物相互作用 薬物動態試験 : その他 表表 Pharmacokinetics: Overview - Test Article: BAX 表 Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose Study Description - Test Article: BAX 表 Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose Study Results - Test Article: BAX 表 Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion - Test Article: BAX 855 (Radiolabeled BAX 855, i.e., [ 3 H] PEG-rFVIII, lot )... 16

36 2.6.5 薬物動態試験概要表 3 略号一覧 略号 英語 日本語 AUC 0- area under the curve from 0 to infinity 時間 0 から無限大時間までの曲線下面積 AUC 0-tlast area under the curve from 0 to the last quantifiable sampling time point 時間 0 から測定可能な最終採血時点までの曲線下面積 CI confidence interval 信頼区間 CL clearance クリアランス C max maximum concentration 最高濃度 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酵素標識免疫吸着測定法 FVIII factor VIII 血液凝固第 VIII 因子 GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 IR incremental recovery 増分回収率 IU international unit 国際単位 IVR in vivo recovery 生体内回収率 ko knock out ノックアウト MRT mean residence time 平均滞留時間 PEG polyethylene glycol ポリエチレングリコール PK pharmacokinetic 薬物動態 rfviii recombinant factor VIII 遺伝子組換え型ヒト血液凝固第 VIII 因子 t 1/2initial initial half-life 初期相半減期 t 1/2terminal terminal half-life 終末相半減期 tlast last quantifiable sampling time point 測定可能な最終採血時点 T max maximum drug concentration time 最高血中濃度到達時間 V ss volume of distribution at steady state 定常状態の分布容積 WBA whole-body autoradiography 全身オートラジオグラフィ

37 2.6.5 薬物動態試験概要表 薬物動態試験概要表 本剤の薬物動態試験の概要を下表に示す 薬物動態試験 : 一覧表 表 Pharmacokinetics: Overview - Test Article: BAX 855 Type of Study Test System Method of Administration Testing Facility Study Number Validation of FVIII activity E17 FVIII ko mouse plasma Rat plasma n.a. Baxter BioScience a RD_VB_ Cynomolgus monkey plasma Validation of PEG-rFVIII antigen E17 FVIII ko mouse plasma n.a. Baxter BioScience a RD_PPD_ Validation of PEG-rFVIII antigen Rat plasma n.a. Baxter BioScience a RD_PPD_ Validation of PEG-rFVIII antigen Cynomolgus monkey plasma n.a. Baxter BioScience a RD_PPD_ Validation of FVIII antigen Rat plasma n.a. Baxter BioScience a RD_VB_ Absorption After Single Dose Mouse Baxter Innovations Intravenous E17 FVIII ko GmbH b PV e Rat Baxter Innovations Intravenous Crl: CD(SD) GmbH b PV e Cynomolgus monkey Intravenous c e Absorption After Repeated Dose Not conducted Absorption, Distribution, Metabolism and Rat Excretion Sprague Dawley Intravenous d Pharmacokinetic Drug Interactions Not conducted Other Not conducted a: Baxter BioScience, Benatzkygasse 2-6, Vienna, Austria b: Baxter Innovations GmbH, Industriestrasse 67, A-1220 Vienna, Austria c:, Germany d:, USA e: contains GLP compliance statement n.a.: not applicable

38 2.6.5 薬物動態試験概要表 分析方法及びバリデーション試験 分析方法及びバリデーションデータのまとめを,E17 FVIII ko マウス血漿については 項及び 項に, ラット血漿については 項, 項及び 項に, カニクイザル血漿については 項及び 項にそれぞれ示す 薬物動態試験 : 吸収 : 単回投与 表 Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose Study Description - Test Article: BAX 855 Study No. PV Study No. PV Study No a Species Mouse E17 FVIII ko Rat Crl: CD(SD) Cynomolgus monkey Gender (M/F) / Number of Animals 4M/4F per time point 4M/4F 2M/2F Feeding Condition Ad libitum Ad libitum Ad libitum Vehicle/Formulation Freeze-dried, reconstitution with sterile water for injection Freeze-dried, reconstitution with sterile water for injection Freeze-dried, reconstitution with sterile water for injection Method of Administration Intravenous Intravenous Intravenous Nominal Dose (IU FVIII/kg) , 350, 700 (ADVATE only at 200 IU FVIII/kg) 350, 700, 1500 (ADAVTE only at 350 IU FVIII/kg) Actual Dose (IU FVIII/kg or ng rfviii-bound PEG/kg) n.a. FVIII antigen: 145, 260, 505 (ADVATE only at 157 IU FVIII/kg) rfviii-bound PEG: 4795, 9700, FVIII activity (lot 1/lot 2): 347/359, 693/772, 1457/1540 (ADVATE only at 404 IU FVIII/kg) rfviii-bound PEG (lot 1/lot 2): 8570/10600, 17100/20900, 38500/45600 Sample Plasma Plasma Plasma Analyte FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound FVIII antigen rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound Assay FVIII activity: chromogenic assay rfviii-bound PEG: ELISA n.a.: not available a: For comparison with other species PK data of study is shown. FVIII antigen: ELISA rfviii-bound PEG: ELISA FVIII activity: chromogenic assay rfviii-bound PEG: ELISA

39 2.6.5 薬物動態試験概要表 6 Species Gender (M/F) / Number of Animals Analyte 表 Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose Study Results - Test Article: BAX 855 Study No. PV Study No. PV Study No a Mouse Rat Cynomolgus E17 FVIII ko Crl: CD(SD) monkey 4M/4F per time point 4M/4F 2M/2F FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound FVIII antigen rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound lot 1 b lot 2 c lot 1 b lot 2 c Nominal dose 200 IU FVIII/kg Dose-adjusted AUC 0-tlast (h IU FVIII/mL / IU FVIII/kg or h ng rfviii-bound PEG/mL / ng rfviii-bound PEG /kg) BAX [32 h] ( ) ADVATE [16 h] ( ) MRT (h) BAX ( ) [16 h] [48 h] ( ) ( ) [32 h] ( ) 8.0 ( ) 7.5 ( ) [48 h] ( ) ( ) ADVATE 4.9 ( ) ( ) Dose-adjusted AUC 0- (h IU FVIII/mL / IU FVIII/kg or h ng rfviii-bound PEG/mL / ng rfviii-bound PEG/kg) BAX ( ) ( ) ( ) ( ) ADVATE ( ) ( ) t 1/2terminal (h) BAX ( ) ( ) ( ) ( ) ADVATE 4.3 ( ) ( )

40 2.6.5 薬物動態試験概要表 7 Species Gender (M/F) / Number of Animals Analyte 表 Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose Study Results - Test Article: BAX 855 (Continued) Study No. PV Study No. PV Study No a Mouse Rat Cynomolgus E17 FVIII ko Crl: CD(SD) monkey 4M/4F per time point 4M/4F 2M/2F FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound C max (IU FVIII/mL or ng rfviii-bound BAX ( ) 74.0 ( ) ADVATE 3.3 ( ) IVR (%) BAX ( ) ADVATE 69.5 ( ) CL (ml/h/kg) BAX ( ) ADVATE 22.1 ( ) V ss (ml/kg) BAX ( ) ADVATE ( ) FVIII antigen 1.9 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (126.1 to 145.6) ( ) ( ) rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound 53.8 ( ) FVIII activity rfviii-bound PEG (ng rfviii-bound lot 1 b lot 2 c lot 1 b lot 2 c ( ) ( ) ( )