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ゆりかみやまる
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1 QCWS 参考プロトコル抗体検査 (LABScreen) 平成 29 年度版作成者日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ抗 HLA 抗体 WG

2 改訂履歴版数改訂日施行日改訂理由改訂内容改訂責任者判定方法の見直しその他の記載整備判定時に確認するべき事項について修正と追加を加した 2 専用解析ソフトに必要なファイルの参照先を更新その他誤記等の記載整備現状に合わせた記載整備製品内容等を最新情報に更新した再検査対象の判断基準について修正した 3 再検査時の DTT を用いた検体処理の遠心速度を修正した判定方法について修正した

3 目次 1.LABScreen 製品概要 LABScreen の使用目的原理 LABScreen の種類抗 HLA 抗体検査検査機器の準備キット内容検体処理検体の処理検査の手順 HLA Fusion による LABScreen の解析 LABScreen 解析カタログのインポート方法 LABScreen データのインポート方法 LABScreen Mixed 解析 LABScreen Single Antigen 解析レポートの作成... 23

4 1.LABScreen 製品概要 1.1 LABScreen の使用目的原理 LABScreen は LABScan システム (Luminex) を使用して検体 ( 血清または血漿 ) 中の HLA 抗体を検出する為の研究用試薬で精製した HLA 抗原がコーティングされたマイクロビーズである高感度に HLA 抗体を検出する事ができる LABScreen ビーズと検体を反応後 PE 標識抗ヒト IgG 抗体で染色し Luminex により蛍光強度を測定し HLA 抗体を検出する 1/24

LABScreen Single Antigen:1 ビーズに対しリコンビナント HLA 抗原が 1 種類のみ結合しており HLA 抗体の抗原特異性が分かるなお追加で開発された LABScreen Single Antigen Supplement を併用すれば日本人に見られる HLA アリルのほぼ全てを網羅しているため ( 表 1) さらに高精度なアリルレベルでの DSA

5 1.2 LABScreen の種類 LABScreen は LABScreen Mixed LABScreen PRA LABScreen Single Antigen の 3 種類のキットがある ( 図 1) これらの試薬は殆どの HLA 抗原型を網羅している 1. LABScreen Mixed: ビーズに 3-5 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており HLA 抗体の有無を確認できる 2. LABScreen PRA:1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており HLA 抗体の有無およその特異性 %PRA * を確認できる 3. LABScreen Single Antigen:1 ビーズに対しリコンビナント HLA 抗原が 1 種類のみ結合しており HLA 抗体の抗原特異性が分かるなお追加で開発された LABScreen Single Antigen Supplement を併用すれば日本人に見られる HLA アリルのほぼ全てを網羅しているため ( 表 1) さらに高精度なアリルレベルでの DSA 測定が可能となる ( 図 2) * %PRA(Panel Reactive Antibody): 全パネル細胞の何 % が陽性となるかの値 %PRA が高い程様々な抗原に対する抗体を保有している指標となる製品名目的 LABScreen Mixed HLA 抗体のスクリーニング (1 ビーズに 3~5 パネル ) LSM12(ClassI&II&MICA) 19 種類のビーズ ( 現在 ) LABScreen PRA LS1PRA(ClassI) LS2PRA(ClassII) LS12PRA(ClassI&II) %PRA * とおおよその特異性 (1 ビーズに 1 パネル ) ビーズの種類 ClassI:55 ClassII:35 ( 現在 ) A11 A2 Cw4 B13 B62 LABScreen Single Antigen LS1A04(ClassI) LS1A04SP (ClassI+SupplementI) LS1ASP01(SupplementI) LS2A01(ClassII) LS2ASP01(SupplementII) LS2A01SP (ClassII+SupplementII) 特異性の検出 DSA の同定 (1 ビーズに 1 抗原 ) ビーズの種類 ClassI:97 SupplementI:54 ClassII:95 SupplementII:24 ( 現在 ) 図 1. LABScreen の種類及び使用目的 2/24

6 表 1:LABScreen Single Antigen+ Supplement での日本人アリル頻度カバー率図 2: 各種 LABScreen による HLA 抗体測定レベル 3/24

7 2. 抗 HLA 抗体検査 2.1 検査機器の準備キット内容検体処理検査器具資材の準備機器 Luminex プレート遠心機 ( 回転数 1300g 以上 ) プレートシェーカーボルテックスミキサー器具資材 96 ウェルマイクロプレート (V 底推奨 ) 参考商品 : (white) "UNIPLATE"(Whatman) トレーシールピペットチップ等キット内容と保存方法未開封のキットは -65 以下で有効期限まで保存できる一度解凍したあとの保存方法と有効期限は下記のとおりである内容 LABScreen beads mix 保存方法と有効期限初回使用時まで-65 C 以下のフリーザーに保管するラベルに記載された有効期限まで保管できる一度解凍したビーズは再凍結不可解凍したビーズは最長 3 ヵ月または有効期限 (3 ヵ月以内の場合 ) まで 2 C~8 C で保管できる 10 X Wash buffer 初回使用後は最長 3 ヵ月または有効期限 (3 ヵ月以内の場合 ) まで 2 C~8 C で保管できる他に必要な試薬 LABScreen では毎回必ず陰性コントロール血清 (LS-NC) を並行してテストする -20 で有効期限まで保管できる二次抗体 (LS-AB2) は凍結乾燥の粉末状態で届く為蒸留水 ( または精製水 ) で溶解する蒸留水 ( または精製水 ) の量はロット毎に異なる場合があるので必ず製品バイアルで量を確認する溶解した後は冷蔵で 6 ヶ月間保管できる製品コード品名容量 1 検体の使用量 LS-NC LABScreen Negative Control Serum 400uL(20test) 20uL LS-AB2 PE-Conjugated Goat Anti-Human IgG 0.5mg ( 約 1000test) PBS Stock を 1uL 4/24

8 2.2 検体の処理検体前処理 ( 必須 ) 1. 検体 ( 血清または血漿 (ACD または K-EDTA 添加 )) は必ず凍結融解する融解後はしっかり転倒混和を行ってから遠心を行う ( 8,000~10,000g 10 分間以上 ) 不純物が多い検体は遠心速度時間を増やす 2. 遠心後上層下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので慎重に中間層から検体を回収して使用する再検査の為の検体処理測定基準 : メーカー設定のガイドライン (OneLambda Product Insert) 各ビーズのカウントが 50 以上であること陰性コントロール値 (NC 値 ) が 1,500 未満で陽性コントロール値 (PC 値 ) の半分以下であること PC 値が 500 以上で NC 値の 2 倍以上あること以上の基準を満たしていない場合は状況に応じて 1,2 の操作による検体処理後に再検査を実施することが望ましい 1. 陰性コントロールビーズ値 (NC 値 ) が高い場合 : 非特異物質の吸着操作使用する試薬 :AdsorbOut( 製品コード :ADSORB One Lambda) AdsorbOut 処理プロトコル ( メーカープロトコル ) 1 (1 テストあたり ) 血清 30uL に対して Adsorb Out ビーズを 3 ul 加えボルテックスする 2 室温で 30 分間振とうしながら反応させ 15,000 rpm で 5 分間遠心する 3 上清をビーズを吸わないように慎重に新しい別の 1.5mL チューブに移す 4 もし検体に Adsorb Out ビーズが混入した場合には再度超遠心し上清を移す 2. 陽性コントロールビーズ値 (PC 値 ) が低い場合 : DTT 処理による IgM 抗体の除去使用する試薬 :DTT (dithiothreitol メーカー不問 ) DTT 処理プロトコル ( 第 4 回アメリカ組織適合性学会 ASHI 推奨プロトコル ) 1 DTT 溶液 (0.05M) 10 ul に対して血清を 90 ul 加える ( DTT の終濃度は 0.005M) 2 よく混ぜた後 37 で分間反応させて 8,000-10,000g で 10 分間遠心し上清を使用する 5/24

9 3. プロゾーン現象 * が疑われる場合 :PBS( メーカー不問 ) による検体の希釈希釈倍率は検体によって異なるので各施設で検討する * プロゾーン現象過剰に抗体が存在することで抗原抗体反応が抑制される現象偽陰性となる可能性あり 4. プロゾーン様現象が疑われる場合 : 補体成分の不活化使用する試薬 : 0.5M-EDTA( メーカー不問 ) EDTA 処理参考プロトコル 1 2 溶解した血清 90uL に EDTA 3uL を入れる室温で 30 分間振とうしながら反応させ 20,000g で 10 分遠心し上清を使用する * プロゾーン様現象検体中の補体成分が二次抗体の結合を阻害して偽陰性となってしまう現象主に LABScreen Single Antigen で報告されている 6/24

10 2.3 検査の手順操作の流れ前処理検体 ( 血清または血漿 ) を凍結融解転倒混和 8000g g で 10 分間超遠心反応ビーズ 5ul と検体 20ul を混合遮光室温 (20 25 ) で振とうで 30 分間反応洗浄 (3 回 ) 洗浄バッファー遠心 (1300gx5 分 or 1500gx3 分 ) フリッキングタッピングドライボルテックス PE 標識 100 倍希釈した二次抗体を 100ul ずつ添加遮光室温 (20 25 ) で振とうで 30 分間反応洗浄 (2 回 ) 洗浄バッファー遠心 (1300gx5 分 or 1500gx3 分 ) フリッキングドライボルテックスタッピング Luminex 測定時に必要なファイル測定に必要なファイルを下記 URL からダウンロードできる使用している LABScreen 製品ロットに該当する測定ファイルを選択する 7/24

11 2.3.3 標準プロトコル検体及び試薬の分注 1 96 ウェルプレートの最初のウェルに陰性コントロール血清 ( 製品コード :LS-NC) 20uL を入れる使用する LABScreen 試薬毎に LS-NC を 1 ウェルずつ使用する 2 2 番目のウェルから前処理 ( 凍結融解超遠心 ) 済みの検体 20uL を入れる 3 ビーズを軽くスピンダウンし ( 蓋の裏に付いた液を落とす ) 数秒間ボルテックスするキャップを開け 10 回程度ピペッティングをして LABScreen ビーズをよく混合するビーズ数が多いためしっかりとボルテックスミキシングすることが大切である使用後は蒸発を防ぐためにしっかり蓋を締め冷蔵で保存する凍結融解不可 4 ビーズ 5uL を各ウェルに入れピペッティングでよくビーズと検体を混合する一回目の反応 : ビーズと検体の反応 5 トレーシールを貼りアルミホイルなどで遮光し室温 (20-25 ) でシェーカーを用いて振とうしながら 30 分間反応させる 6 反応中に蒸留水で 10 X Wash Buffer ( 製品コード :LSPWABUF) を希釈し 1 X Wash buffer を必要量だけ調製する希釈は使用するチューブ等の目盛を用いての調製で問題ない 1 X Wash buffer は 1 テストあたり約 1.1mL 必要洗浄操作 :7~11 を 3 回繰り返し行う 7 反応後各ウェルに希釈済みの 1 X Wash buffer を加える添加量 :1 回目は 150uL 2 回目 3 回目は 200uL を加える 8 新しいトレーシールを貼り 1300g で 5 分間 ( または 1,500g で 3 分間 ) 遠心する 3 回目の洗浄の遠心時に 100 倍希釈の二次抗体を用意する 1 テストあたり二次抗体の Stock 溶液 ( 製品コード :LS-AB2 を滅菌水で予め溶解保存したもの )1uL を 1 X Wash Buffer 99uL に加えて 100 倍希釈する 9 トレーシールを剥がししっかりフリッキングして上清を除去するフリッキングは真下にしっかりと 1 回のみ行う何度も行うとビーズをロスする危険がある 10 フリッキング後はトレーを下向きにしたままペーパータオル等に 5 秒間押し付けて十分に水分を除去するただしこの状態で十分に除去できていないようであればペーパータオルに押し付けたまま軽くタッピングする 11 ビーズのみの状態でボルテックスする ( ドライボルテックス ) ウェルの底に張り付いたビーズがほぐれる程度 ( 約 2 秒 ~5 秒程度 ) 行うほぐれると青い点のようになっていたビーズが広がり見えなくなるドライボルテックスを長くし過ぎると蛍光値が弱くなる場合があるので注意する ( 図 4) 8/24

左図 : フリッキング中央図 : タッピング右図 : ドライボルテックス ( シール不要 ) 二次抗体によるラベリング 12 3 回目のドライボルテックス後希釈二次抗体 100 ul ずつ各ウェルに加えるトレーシールを貼り遮光し室温 (20 C~25 C) で振とうしながら 30 分間反応する 13 Luminex の電源を入れておく洗浄操作 :15~16 を計 2 回行う (

12 左図 : フリッキング中央図 : タッピング右図 : ドライボルテックス ( シール不要 ) 二次抗体によるラベリング 12 3 回目のドライボルテックス後希釈二次抗体 100 ul ずつ各ウェルに加えるトレーシールを貼り遮光し室温 (20 C~25 C) で振とうしながら 30 分間反応する 13 Luminex の電源を入れておく洗浄操作 :15~16 を計 2 回行う ( 遠心は 3 回 ) 14 反応後洗浄バッファーは加えず 1,300g で 5 分間 ( または 1500g で 3 分間 ) 遠心する 15 フリッキングタッピングドライボルテックスを 9~11 と同様に行う 16 各ウェルに 1 X Wash buffer を 200uL ずつ加えトレーシールを貼り 1300g で 5 分間 ( または 1500g で 3 分間 ) 遠心する 17 フリッキング ~ 遠心 (15~16) をさらに一回行った後フリッキングタッピングドライボルテックスを 9~11 と同様に行う 18 1 X PBS を各ウェルに 80uL ずつ加える Luminex による測定に関してすぐに測定できない場合はシールを貼り冷蔵庫で保管する蛍光値が弱くなるので必ず 24 時間以内に測定するビーズ数が非常に多くビーズがウェル底に沈みやすいのですぐに測定できない場合には測定前にしっかりとサンプルのミキシングを行う Luminex の蛍光値はその日の条件 ( レーザー出力気温等 ) に影響されるより正確に蛍光値を測定するために測定前にキャリブレーションを行う事を推奨する 9/24

13 nmfi nmfi QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査参考データプレート法とチューブ法の比較プレート法はチューブ法と比較して蛍光値の再現性が高いためプレート法を標準法として推奨蛍光値 ( ) 図 3:LABScreen Single Antigen のプレート法とチューブ法の比較ドライボルテックスの時間による影響ビーズ ( 左から蛍光値が高い順 ) ドライボルテックスの時間が長すぎると蛍光値が極端に下がるため安定している 2~ 5 秒を推奨蛍光値 ( ) 図 4:LABScreen Single Antigen におけるドライボルテックス時間の影響 10/24

14 2.3.4 検査結果判定に関する注意事項蛍光値 (nmfi 値 Baseline) に関して LABScreen 検査は使用分野使用目的に応じて当然結果の解釈や治療方針等は異なるので必ず各施設で判定基準判定ルールを作成するなお判定の際の蛍光値 (nmfi * ) を絶対視せずあくまでも抗体量の目安として参照する事 * nmfi(baseline): 補正された蛍光値 normalized Mean Fluorescence Intensity の略ビーズに対する非特異反応と抗原に対する非特異反応を差し引いた値式は下記参照 nmfi= 検体の各ビーズ値 - 検体の NC ビーズ値 -(NC 血清各ビーズ値 -NC 血清の NC ビーズ ) 施設カットオフラインの検討方法オプション ( 各施設で検討 ) 1 カットオフラインは陰性コントロール血清のバックグラウンド値よりも十分に高くなるように設定するバックグラウンド値はメーカーの陰性血清を用いて 3-5 回の再現性試験を行って測定する程度の予め特異性が分かっている陽性血清があれば設定したカットオフラインで検出できるかを検証する 3 必要に応じて他の抗体検査法の過去の結果と LABScreen のカットオフが適合するか検証するまた %PRA が高く特異性の幅が広い血清でかつタイピング情報があれば自己の抗原ビーズの反応値をカットオフの目安として使用することも出来る LABScreen Single Antigen の判定方法 1 コントロール値の確認 : 測定基準を満たしていることを確認する範囲外なら再検査する (2.2.2 再検査の為の検体処理参照 ) 2 基本的には HLA Fusion の自動判定で x6 以上を陽性とするが必ず nmfi 値の確認と抗体特異性や反応グラフのショルダー ( 蛍光値が大きく下がるビーズ ) を考慮しながら陽性カットオフを決定する陽性カットオフの妥当性は検査の目的によっても異なるため各施設で設定した陽性カットオフの臨床的意義を検討することが望ましい LABScreen Single Antigen の判定時の確認事項 ( 推奨 ) 1 基本情報の確認 : 患者情報性別感作歴 ( 妊娠歴輸血歴移植歴 ) HLA タイプ情報検査日実施者使用製品使用ロットなど 2 コントロール値の確認 : ビーズカウント数 PC 値 NC 値 PC/NC 比 3 検査結果の詳細情報の確認 : 抗体特異性 ( 抗原レベルアリルレベル ) DSA の有無 nmfi 値バーチャルクロスマッチ結果など 11/24

3.HLA Fusion による LABScreen の解析 3.1 LABScreen 解析カタログのインポート方法 ( 既に最新のカタログをインポートしている場合はスキップし 3.2 以降を参照 ) 3.1.1 解析用 PC がインターネットに繋がっていない場合 1.

com/en/products-services/products/antibody-detection/labscreen.

15 3.HLA Fusion による LABScreen の解析 3.1 LABScreen 解析カタログのインポート方法 ( 既に最新のカタログをインポートしている場合はスキップし 3.2 以降を参照 ) 解析用 PC がインターネットに繋がっていない場合 1. HLA Fusion 解析時に必要なカタログファイルはインターネットに繋がっている別の PC を使用して下記よりダウンロードするダウンロードしたファイルは USB 等を使用して解析 PC の C ドライブに保存するカタログ ID: 製品コード陰性血清 Lot ビーズ Lot カタログバージョン例 : LABScreen Single Class I 陰性血清ロット 14 ビーズロット 8 revison2=ls1a04nc14_008_02 2. HLA Fusion を起動し画面の上部のタブより Utilities >Update Reference >Update Reference File を選択する 3. 新しい画面が表示されるので左側のファイルより C ドライブを選択する画面左下の Catalog にチェックを入れてカタログファイルを選択し Import Catalog ボタンをクリックする 4. 新しい画面が開き左側のカラムにカタログが表示されるので Close を押す 12/24

16 3.1.2 解析用 PC がインターネットに繋がっている場合 QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 1. HLA Fusion を起動し画面の上部のタブより Utilities >Update Reference >Update Reference Files を選択する 2. 新しい画面が表示されるので画面左下の Catalog にチェックを入れて Auto Update ボタンをクリックする 3. 別画面が表示されるので画面左下の Not in Fusion DB にチェックをいれ画面左上の LABScreen にチェックをいれ画面右下の Import ボタンを押す完了すると緑色のゲージが一番右側までいくその後 Close を押す 13/24

3.2 LABScreen データのインポート方法 LABScreen 解析用データは LABScan(Luminex) の測定用 PC

$2 の場合 :C:\ ProgramData\Luminex\xPonent31\OutPut もしくは C:\My Session ファイル名は$ HLA Fusion アイコンをクリックし User Name Password を入力しログインする初期画面左下の LABScreen

解析したいバッチファイルを選択する複数選択する場合は Shift または Ctrl キーを押しながら選択して開くを押すその後

中央画面に Session ID Catalog ID が自動入力される Catalog ID が合っているか必ず確認をする Session ID に

17 3.2 LABScreen データのインポート方法 LABScreen 解析用データは LABScan(Luminex) の測定用 PC の以下の場所に自動的に保存されている Luminex XPONENT3.1/4.2 の場合 :C:\ ProgramData\Luminex\xPonent31\OutPut もしくは C:\My Session ファイル名は測定の際に入力したバッチ名.csv となっている測定 PC と別の PC で解析する場合は上記のファイルを USB 等で移動させる 1. HLA Fusion アイコンをクリックし User Name Password を入力しログインする初期画面左下の LABScreen のアイコンをクリック後画面左上にあるフォルダのアイコンをクリックする 2. 解析したいバッチファイルを選択する複数選択する場合は Shift または Ctrl キーを押しながら選択して開くを押すその後解析したいバッチファイルを選択するもし過去に解析したファイルを再度読み込む時は Include Imported にチェックする 3. 中央画面に Session ID Catalog ID が自動入力される Catalog ID が合っているか必ず確認をする Session ID に特殊記号が含まれていると HLA Fusion で解析できないので必ず半角英数字とハイフンアンダーバーのみを使用するカタログ ID の読み方 : 製品コード陰性血清ロットビーズロットカタログバージョン例 : LABScreen Single Class I 陰性血清ロット 14 ビーズロット 8 バージョン 2 = LS1A04NC14_008_02 14/24

4. 陰性コントロール血清 ( 一番目の検体 ) の NS のボックスをチェックし

コンタミネーション等が疑われる問題ない場合には Import ボタンをクリックする

18 4. 陰性コントロール血清 ( 一番目の検体 ) の NS のボックスをチェックし Import ボタン横の Check Control ボタンを押し陰性コントロール血清の測定データとメーカーデータとを比較する 5. 陰性コントロール血清の測定データがメーカーデータと乖離していた場合にはコンタミネーション等が疑われる問題ない場合には Import ボタンをクリックするデータが乖離している例 NC 血清やバッファーなどどこかでコンタミしている可能性ありメーカーデータ測定データ 6. 画面右上にある Navigator から解析したいデータクリックする青字 : 未解析のセッション黒字 : 解析済セッション 7. Summary が表示される各検体をダブルクリックすると解析画面が表示される 15/24

3.3 LABScreen Mixed 解析 3.3.1 解析手順 1. 画面左下 Statistics のコントロール値が問題ない事を確認する 2. 結果は HLA Class I 抗体 Class II 抗体および MICA 抗体の陰性 / 陽性が自動判定される MICA 抗体の結果を確認するには画面左下の MIC というタブをクリックする 3.

19 3.3 LABScreen Mixed 解析解析手順 1. 画面左下 Statistics のコントロール値が問題ない事を確認する 2. 結果は HLA Class I 抗体 Class II 抗体および MICA 抗体の陰性 / 陽性が自動判定される MICA 抗体の結果を確認するには画面左下の MIC というタブをクリックする 3. 判定結果は Final Assignment の Positive ( 陽性 ) Negative ( 陰性 ) Undetermined( 判定保留 ) を確認する判定後 Save ボタンをクリックする赤色の横線 : 陽性カットオフライン陽性カットオフ以上のビーズが一つでもあれば Positive と判定される緑色の横線 : 陰性カットオフラインすべてのビーズが陰性カットオフライン以下であれば Negative と判定されるグレーゾーン : 陰性カットオフラインと陽性カットオフラインの間にビーズがある場合 Undetermined と判定されるカットオフラインは各施設で各自検討する (2.3.3 参照 ) HLA Class I HLA Class II 2 判定結果の確認 1 コントロール値の確認 3 判定結果の保存 16/24

3.3.2 LABScreen Mixed の判定 :NBG ratio に関して LABScreen Mixed では NBG ratio という値を用いて陽性陰性のカットオフを定める NBG ratio はコントロールビーズに対して各ビーズがどれくらい反応したかの比率を表すパラメーターである

2 となっているが各施設での検討を基にカットオフ値を変更する LABScreen Mixed のカットオフ値を変更する方法 1.

20 3.3.2 LABScreen Mixed の判定 :NBG ratio に関して LABScreen Mixed では NBG ratio という値を用いて陽性陰性のカットオフを定める NBG ratio はコントロールビーズに対して各ビーズがどれくらい反応したかの比率を表すパラメーターである NBG ratio = ( 検体各ビーズ値 - 検体 NC ビーズ値 )/(NC 血清各ビーズ値 - NC 血清 NC ビーズ値 ) NBG ratio のデフォルト値は陽性カットオフ値が 1.5 陰性カットオフ値が 1.2 となっているが各施設での検討を基にカットオフ値を変更する LABScreen Mixed のカットオフ値を変更する方法 1. HLA Fusion にログイン後 Utilities>Antibody Product Configuration>Set Mixed Product Configuration をクリックする 2. 下記画面にて Catalog ID から使用するカタログを選択しカットオフ値の変更を行う陽性カットオフ (Positive Threshold) 陰性カットオフ (Negative Threshold) の欄に施設で検討した値を手入力する (Class I Class II MICA それぞれ変更可能 ) 入力後は必ず Save を押す 17/24

3.4 LABScreen Single Antigen 解析 3.4.1 解析手順 1. 画面左下 Statistics のコントロール値が施設基準と比較して問題ない事を確認する 2.

値 ( 蛍光値 ) のショルダー ( 蛍光値が急に下がる点 ) CREG( 交差反応 ) エピトープ等に基づいているカットオフの設定は各施設の基準に基づいて行う変更する際には各施設で定めた nmfi 値や抗原特異性 (CREG 患者の HLA タイプの反応 ) 等を参考にする 3.

21 3.4 LABScreen Single Antigen 解析解析手順 1. 画面左下 Statistics のコントロール値が施設基準と比較して問題ない事を確認する 2. オレンジ色の縦線 ( デフォルトのカットオフライン ) にカーソルを合わせると蛍光値が表示されるので各施設の蛍光値のカットオフ基準に合わせて左右にドラッグしてカットオフラインを検討する X8 X6 X4 自動判定におけるデフォルトの陽性カットオフラインは X6 である HLA Fusion はビーズの反応を X8,X6,X4,X2 とグループ分けして解析する解析のアルゴリズムは nmfi 値 ( 蛍光値 ) のショルダー ( 蛍光値が急に下がる点 ) CREG( 交差反応 ) エピトープ等に基づいているカットオフの設定は各施設の基準に基づいて行う変更する際には各施設で定めた nmfi 値や抗原特異性 (CREG 患者の HLA タイプの反応 ) 等を参考にする 3. 画面下の CREG の表 Epitope Analysis Results から抗原特異性を確認する下記の表は各 CREG の反応を表しており 2C 5C などが各 CREG を表している紫色の抗原が陽性と判定されたものである CREG で反応性がうまく説明できる場合があるのでカットオフ変更の際に参考にする抗原レベルで乖離している例 1 Mean(Raw) となっている場合は設定の変更を行う 2 Utilities > Antibody Product Configuration > Set Analysis Configuration を選択し Product Type を LABScreen Single Antigen を選ぶ 3 その後画面下の下記のチェックボックスにチェックして Save する Epitope Analysis ResuLts では Spec : 抗原特異性 >=6 : 陽性カットオフより高い反応のビーズ数 <X6 : 陽性カットオフより低い反応のビーズ数 Mean = 各抗原ビーズ値の平均の nmfi( 蛍光値 ) が分かる抗原レベルで反応が乖離しているものが無いかを確認する 18/24

22 4. 抗原レベルでの特異性を確認する場合には画面上部の Sort Ag ボタンよりグラフをローカス毎に並び替えるもとに戻す場合は Refresh ボタンを押す 5. 画面中央上部の DNA にチェックすると抗原表記がアリル表記に切り替わるアリルによって反応性が異なる場合があるので患者ドナーのアリル情報がある場合は参照するアリル情報を結果に反映させたい場合にはを参照例 :Cw10 Cw10 C*03:02 C*03:04 6. 陽性と判断した抗原を Epitope Analysis ResuLts より選択し > ボタンで移動する複数選択する場合 Shift キーもしくは Ctrl キーを押しながら選択する取り消したい抗原がある場合は選択後 Remove を押す 7. 解析後は必ず画面右下の Save をクリックする一度保存したデータを再解析して保存する場合は Confirm ボタンをクリックする 19/24

23 3.4.2 アリルレベルでの特異性をアサインする場合 1. 画面右下の Raw Data ボタンをクリックする 2. 下記画面より陽性になったビーズのアリルをダブルクリックし Close するダブルクリック 3. 解析画面右下の Final Assignment のカラムに陽性となったアリルが表示される最後に画面右下の Save を押す追加したアリルはレポートにも反映される追加されたアリル 20/24

3.4.3 DQ DP 抗体の解析 DQ DP 抗体はデフォルト設定では DQB1/DPB1 の反応性に基づいてソフトが自動判定している DQ DP

DQA1/DPA1 に陽性反応に関係する特異性があった場合には自動で Epitope Analysis の画面に DQA1/DPA1 のアリルが表示される

次に画面上部の Sort Ag ボタンを右クリックし Sort by DQA1/DPA1 をクリックするすると DQA1/DPA1

24 3.4.3 DQ DP 抗体の解析 DQ DP 抗体はデフォルト設定では DQB1/DPB1 の反応性に基づいてソフトが自動判定している DQ DP 抗体を解析する際には DQA1/DPA1 の特異性も確認する 1. 解析画面右上の DQA1/DPA1 にチェックを入れる 2. DQA1/DPA1 に陽性反応に関係する特異性があった場合には自動で Epitope Analysis の画面に DQA1/DPA1 のアリルが表示される前後で結果を比較する 3. 次に画面上部の Sort Ag ボタンを右クリックし Sort by DQA1/DPA1 をクリックするすると DQA1/DPA1 のアリル情報でグラフが並びかえされる陽性と判定された抗原アリルは紫色で特異性が表示されるので特異性を比較確認する元に戻す場合は Refresh ボタンを押す 4. 陽性と判定した DQA1/DPA1 アリルは Epitope Analysis 画面で選択して > ボタンで Final Assignment に追加し Save する 21/24

25 3.4.4 LABScreen Single Antigen と Supplement の結合解析方法 QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 1. HLA Fusion にデータを取り込みそれぞれ解析し Save をする 2. 解析画面で Combine をクリックすると別ウインドウが開くので比較したいデータを選択し Analyze をクリックする * データのサンプル名は同一にすること * この時メッセージで出てくるように結合したデータの Save はできない 3. 下記のようにデータが画面上で Combine される但し一時的に表示させるだけであり Combine したデータの Save やレポートは出力できませんので注意すること 22/24

Custom を選択する 3. 画面右に Set Up ボタンが表示されるのでクリックする 4.

26 3.5 レポートの作成 1. 画面上部にあるメインメニューの Report をクリックする 2. 画面左部分でレポート作成したいデータの検索を行うデータ解析した日付で検索する場合 Test Date を選択して Find ボタンを押すその後 Generic Antibody Antibody Custom を選択する 3. 画面右に Set Up ボタンが表示されるのでクリックする 4. レポートに出力したい項目にチェックを入れるただし患者情報ドナー情報等入力されていない情報は出力されない Report 名を入力して画面右側の Save を押すレポートタイトル ( 英数字半角 20 字まで入力可能 ) 患者 ID 名前アサインした抗体 DSA 以外の陽性抗体を黒丸で囲める DSA を赤丸で囲めるドナー情報 DSA の有無 NC PC 値 %PRA など反応グラフの表示 23/24

27 5. 画面中央の Sessions タブより解析したいデータにチェックを入れるセッション名の横の + ボタンを押すとさらに詳細情報が表示される一つの検体だけ選択する事もできる 6. View Report をクリックすると下記の様なレポートが表示される 7. 画面左上のアイコンより PDF で保存または印刷する 24/24

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QCWS 参考プロトコル抗体検査 (FlowPRA) 平成 29 年度版作成者日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ抗 HLA 抗体 WG 改訂履歴版数改訂日施行日改訂理由改訂内容改訂責任者 2 目次 1.FlowPRA 製品概要... 1 1.1 FlowPRA の使用目的原理... 1 1.2 FlowPRA の種類... 2 2. 検査の準備... 3 2.1