資料 11-2 飼料添加物の効果安全性についてアルカリ性プロテアーゼ平成 30 年 1 月 29 日農林水産省消費安全局畜水産安全管理課

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1 資料 11-2 飼料添加物の効果安全性についてアルカリ性プロテアーゼ平成 30 年 1 月 29 日農林水産省消費安全局畜水産安全管理課

2 目次 1 名称等 2 2 起源又は発見の経緯外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等 2 3 効果に関する事項効果を裏付ける基礎的試験 (in vivo 試験 ) 鶏効果を裏付ける野外応用による試験鶏鶏鶏鶏鶏鶏鶏 8 4 安全性に関する事項毒性試験一般毒性試験反復投与毒性試験 ( 短期ラット ) 特殊毒性試験変異原性試験対象家畜等を用いた飼養試験鶏 10 5 審議結果 11 6 参照 ( 参考文献及び参考資料 ) 12 1

3 アルカリ性プロテアーゼに関する効果安全性について 1 名称等一般名 : アルカリ性プロテアーゼ化学名 :Chymotrypsin CAS 番号 : 用途 : 飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進対象家畜及び推奨添加量 : 鶏用飼料 24,000 単位 /kg 飼料単位タンパク消化力単位を示す 2 起源又は発見の経緯外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等プロテアーゼはペプチド結合を加水分解する酵素の総称である飼料に添加することで消化管でタンパク質アミノ酸の消化率を向上させ生体内での利用を促進する国内においては 1990 年に Aspergillus melleus Bacillus licheniformis 又は Streptomyces caespitosus 由来のアルカリ性プロテアーゼが飼料添加物として指定され 1998 年に Bacillus subtilis 由来のアルカリ性プロテアーゼが追加された今回追加が要望されたアルカリ性プロテアーゼは Bacillus licheniformis Si3 株を宿主とし遺伝子組換え技術により Nocardiopsis prasina 由来のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を合成して得た DNA を挿入させてアルカリ性プロテアーゼ産生能を向上させた組換え生産菌 Bacillus licheniformis JPBL001 株から産生される単一アルカリ性プロテアーゼ製剤である本物質は海外では米国 EU 等で飼料添加物として鶏用飼料等への使用が認められている 2

4 3 効果に関する事項 3-1 効果を裏付ける基礎的試験 (in vivo 試験 ) 鶏 ( 採卵鶏 ) 採卵鶏 ( ジュリア 400 日齢 ) を用いて基礎飼料 ( ) 又は基礎飼料にプロテアーゼを 24,000 単位 /kg(960~1,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 10 日間給与した (1 群 6 羽 ) 乾物粗タンパク質粗脂肪粗繊維可溶無窒素物及び総エネルギーの消化率可消化エネルギー可消化養分総量を算出するため期間後半 5 日間に糞便を採取したなお基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 21.2% であった乾物粗タンパク質粗繊維及び総エネルギーの消化率可消化エネルギー可消化養分総量についてはプロテアーゼ添加群はよりも有意に高かった (p<0.05)( 表 1 参照 ) [ 参照 1] 表 1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果プロテアーゼ添加群 (24,000 単位 /kg) 消化率 (%) 乾物 75.8± *±1.6 粗タンパク質 84.1± *±1.2 粗脂肪 68.1± ±6.1 粗繊維 1.6± *±4.3 可溶無窒素物 81.7± ±2.2 総エネルギー 77.1± *±1.4 可消化エネルギー (Mcal/kg) 3.06± *±0.06 可消化養分総量 (%) 71.6± *±1.21 ±SD *: との間に有意差あり (one-way ANOVA, p<0.05) 3-2 効果を裏付ける野外応用による試験鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Ross PM3 雄 1 日齢 ) を用いて基礎飼料 ( ) 又は基礎飼料にプロテアーゼを 24,000 単位 /kg(2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した (1 群 20 羽 12 反復 ) なお飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 21.1% 22~35 日齢では 20.0% であった飼料要求率についてはプロテアーゼ添加群はよりも有意に低かった (p<0.05) ( 表 2 参照 ) [ 参照 2] 3

5 表 2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果プロテアーゼ添加群 (24,000 単位 /kg) 増体量 (g) 2,473 a ±51 2,504 a ±56 飼料摂取量 (g) 3,967 a ±68 3,954 a ±82 飼料要求率 a ± b ±0.022 ±SD 各項目内の異文字間に有意差あり (one-way ANOVA Newman-Keuls test, p<0.05) 鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Ross308 雄 1 日齢 ) を用い基礎飼料 ( ) 又は基礎飼料にプロテアーゼを 24,000 単位 /kg(2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 36 日間給与した (1 群 64 羽 12 反復 ) なお基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~20 日齢では 21.0% 21~36 日齢では 19.0% であった 1 日増体量及び 1 日飼料摂取量についてはプロテアーゼ添加群はよりも有意に高かった (p<0.05)( 表 3 参照 ) [ 参照 3] 表 3 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果プロテアーゼ添加群 (24,000 単位 /kg) 1 日増体量 (g/ 日 ) 51.4 b 52.8 a 1 日飼料摂取量 (g/ 日 ) 81.9 b 83.5 a 飼料要求率各項目内の異文字間に有意差あり (two-way ANOVA, p<0.05) 鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Ross PM3 雄 1 日齢 ) を用い基礎飼料 ( ) 又は基礎飼料にプロテアーゼを 19,200 24,000 単位 /kg(1,600~4,000 2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した (1 群 20 羽 8 反復 ) 窒素脂肪の各消化率及び可消化エネルギーを算出するため期間後半 14 日間の回腸内容物を採取したなお基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 21.1% 22~35 日齢では 19.0% であった増体量及び飼料摂取量についてはプロテアーゼ添加群はよりも有意に高かった (p<0.05) 窒素消化率可消化エネルギーについてはプロテアーゼ 24,000 単位添加飼料群はよりも有意に高かった (p<0.05)( 表 4 参照 ) [ 参照 4] 4

6 表 4 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果プロテアーゼ添加群 ( 単位 /kg) 19,200 24,000 増体量 (g) 2,286 b ±95 2,412 a ±63 2,430 a ±45 飼料摂取量 (g) 3,688 b ±136 3,841 a ±87 3,848 a ±109 飼料要求率 a ± a ± a ±0.037 窒素消化率 *(%) c ± bc ± a ±0.63 脂肪消化率 *(%) a ± a ± a ±0.83 可消化エネルギー *(%) b ± ab ± a ±0.89 ±SD 各項目内の異文字間に有意差あり (one-way ANOVA Newman-Keuls test, p<0.05) *:1 群あたり 64 羽鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Arbor Acres 雌雄 1 日齢 ) を用い基礎飼料タンパク質低減飼料のそれぞれについてプロテアーゼ無添加飼料 ( ) プロテアーゼを 24,000 単位 /kg(2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 42 日間給与した ( 試験 1(1 群 24 羽 4 反復 ) 試験 2(1 群 16 羽 4 反復 )) なおタンパク質低減飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 21.64% 22~35 日齢では 19.24% 36~42 日齢では 17.24% 基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 22.62% 22 ~35 日齢では 20.17% 36~42 日齢では 18.16% であった試験 1では飼料要求率についてはタンパク質低減飼料においてプロテアーゼ添加群はよりも有意に低かった (p<0.05) 基礎飼料のプロテアーゼ添加群とでは有意差はなかったが改善傾向がみられた ( 表 5-1 参照 ) 試験 2では飼料要求率についてはタンパク質低減飼料においてプロテアーゼ添加群はよりも有意に低かった (p<0.05) 基礎飼料のプロテアーゼ添加群とでは有意差はなかったが改善傾向がみられた ( 表 5-2 参照 ) [ 参照 5] 表 5-1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 ( 試験 1) タンパク質低減飼料基礎飼料 24,000 単位 /kg 24,000 単位 /kg 増体量 (g) 2,110 2,163 2,193 2,227 飼料摂取量 (g) 3,714 3,658 3,726 3,719 飼料要求率 a b ab b 各項目内の異文字間に有意差あり (ANOVA Duncan s multiple range test, p<0.05) 5

7 表 5-2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 ( 試験 2) タンパク質低減飼料基礎飼料 24,000 単位 /kg 24,000 単位 /kg 増体量 (g) 2,660 b 2,753 ab 2,768 ab 2,827 a 飼料摂取量 (g) 4,458 4,450 4,493 4,430 飼料要求率 a b ab b 各項目内の異文字間に有意差あり (ANOVA Duncan s multiple range test, p<0.05) 鶏 ( ブロイラー ) 試験 1 ブロイラー (RossPM3 雄雌 1 日齢 ) を用い基礎飼料 ( ) 基礎飼料にプロテアーゼを 24,000 単位 /kg(2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した (1 群雄雌ともに 12 羽 12 反復 ) タンパク質脂肪エネルギーの消化率を算出するため 35 日目の回腸の内容物を採取したなお基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 21.0% 22~35 日齢では 20.0% であった雄ではプロテアーゼ添加群はよりも増体量及び飼料摂取量については有意に増加し飼料要求率は有意に減少した (p<0.05) またタンパク質脂肪エネルギーの消化率はプロテアーゼ添加群はよりも有意に増加した (p<0.05) 雌では全項目で有意差はなかった ( 表 6-1 参照 ) 試験 2 ブロイラー (RossPM3 雄 1 日齢 ) を用い基礎飼料タンパク質低減飼料のそれぞれについてプロテアーゼ無添加飼料 ( ) プロテアーゼを 24,000 単位 /kg (2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した (1 群 12 羽 12 反復 ) タンパク質脂肪エネルギーの消化率を算出するため 35 日目の回腸の内容物を採取したなお基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 20.0% 22~35 日齢では 19.5% タンパク質低減飼料に含まれる粗タンパク質は 1~21 日齢では 19.3% 22~ 35 日齢では 17.1% であったタンパク低減飼料では飼料摂取量飼料要求率についてはプロテアーゼ添加群はよりも有意に減少した (p<0.05) エネルギーの消化率については有意に増加した (p<0.05) 基礎飼料のプロテアーゼ添加群とでは増体量飼料要求率について有意差はなかったが改善傾向がみられた ( 表 6-2 参照 ) [ 参照 6] 6

8 表 6-1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 ( 試験 1) 雄雌 24,000 単位 /kg 添加群 24,000 単位 /kg 添加群増体量 (g) 2,262 b 2,393 a 2,162 2,149 飼料摂取量 (g) 3,723 b 3,835 a 3,547 3,535 飼料要求率 1.65 a 1.60 b 消化率 * (%) タンパク質 76.9 b 82.8 a - - 脂肪 88.6 b 91.1 a - - エネルギー 70.6 b 77.8 a - - 各項目内の異文字間に有意差あり (two-way ANOVA Newman-Keuls test, p<0.05) *:1 群あたり 8 羽表 6-2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 ( 試験 2) タンパク質低減飼料基礎飼料 24,000 単位 /kg 24,000 単位 /kg 増体量 (g) 2,220 2,243 2,353 2,364 飼料摂取量 (g) 3,911 a b 3,873 3,830 飼料要求率 1.76 a 1.71 b 消化率 * (%) タンパク質脂肪エネルギー 75.5 b 76.6 a - - 各項目内の異文字間に有意差あり (two-way ANOVA Newman-Keuls test, p<0.05) *:1 群あたり 8 羽鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Ross708 雄雌 7 日齢 ) を用いタンパク質低減飼料についてプロテアーゼ無添加飼料 ( 陰性 ) プロテアーゼを 12,000 24,000 48,000 96,000 単位 /kg(1,040~2,640 2,080~5,280 4,160~10,560 8,320~21,120 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料基礎飼料 ( 陽性 ) をそれぞれ 15 日間給与した (1 群 5 羽 7 反復 ) 粗タンパク質及び各種アミノ酸の消化率を算出するため 15 日目に回腸の内容物を採取したなおタンパク質低減飼料に含まれる粗タンパク質は 20.25% 基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 22.5% であった増体量については 24,000 48,000 96,000 単位 /kg 添加群はよりも有意に増加した (p<0.05) 飼料要求率については 48,000 96,000 単位 /kg 添加群はよりも有意に低下した (p<0.05)( 表 7 参照 ) [ 参照 7] 7

9 表 7 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果タンパク質低減飼料 ( 単位 /kg) 陰性 12,000 24,000 48,000 96,000 基礎飼料 ( 陽性 ) 増体量 (g) b ab a a a a 飼料摂取量 (g) 1,045 1,050 1,075 1,061 1,062 1,050 飼料要求率 a ab abc bc bc c 消化率粗タンパク質 77.9 b 82.6 a 82.6 a 82.7 a 83.0 a 75.6 b アルギニン 86.9 b 90.1 a 90.4 a 91.2 a 90.9 a 86.3 b イソロイシン 79.5 ab 82.6 a 82.3 a 82.9 a 83.1 a 78.1 b リジン 80.6 b 85.9 a 85.1 a 86.4 a 86.6 a 78.4 b メチオニン 78.4 b 82.7 ab 83.0 ab 83.9 a 83.2 a 76.1 b トレオニン 75.9 b 82.2 a 83.3 a 83.9 a 83.7 a 74.2 b バリン 83.6 b 86.4 ab 88.4 a 86.3 ab 87.1 a 82.2 b ヒスチジン 82.1 ab 84.2 a 85.7 a 85.8 a 86.1 a 80.2 b アスパラギン酸 76.1 b 82.3 a 81.6 a 82.5 a 82.8 a 74.5 b システイン 77.7 b 81.8 a 81.9 a 82.1 a 82.7 a 76.8 b セリン 73.6 b 78.2 a 79.1 a 78.7 a 78.8 a 72.1 b 各項目内の異文字間に有意差あり (one-way ANOVA Tukey s HSD test, p<0.05) 鶏 ( ブロイラー ) ブロイラー (Cobb 400Y 雌雄 1 日齢 ) を用い基礎飼料 ( 陽性 ) タンパク質低減飼料 ( 陰性 ) タンパク質低減飼料にプロテアーゼを 24,000 単位 /kg (2,080~5,280 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 42 日間給与した (1 群 25 羽 6 反復 ) なおタンパク質低減飼料は同じ飼料原料を用い予め酵素によるタンパク質及びエネルギーの消化率改善を考慮して見かけの飼料中の栄養成分値が基礎飼料と同等となるようにとうもろこしと大豆かすの配合率を調整した基礎飼料に含まれる粗タンパク質は 1~14 日齢では 22.2% 15~28 日齢では 20.2% 29~42 日齢では 19.5% であった増体量飼料摂取量飼料要求率は全群間で有意差は見られなかったがタンパク質低減飼料ではプロテアーゼ添加群はよりも飼料要求率は減少する傾向がみられた [ 参照 8] 8

10 表 8 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果陰性タンパク質低減飼料 24,000 単位 /kg 基礎飼料 ( 陽性 ) 増体量 (g) 1, , ,023.5 飼料摂取量 (g) 3, , ,515.7 飼料要求率各項目内の異文字間に有意差なし (one-way ANOVA, p>0.05) 4 安全性に関する事項 4-1 毒性試験一般毒性試験反復投与毒性試験 ( 短期ラット ) ラット (SD 系 5 週齢平均体重 :20g) にプロテアーゼを 0 45, , ,950 単位 /kg 体重 ( mg/kg 体重 ) 添加した飼料を 90 日間強制経口投与した (1 群雌雄各 10 匹各用量 1 群 ) 体重増体量飼料摂取量水分摂取量血液学的検査血液生化学的検査眼科鏡検査及び臓器重量については投与に起因した影響は認められなかった剖検において肉眼的観察からは投与に起因した影響は認められなかった病理組織学検査で観察された所見は試験実施の研究所の有する同週齢及び同系統のラットにおける背景データの発生範囲内であった以上の結果からアルカリ性プロテアーゼの NOAEL は mg/kg 体重 / 日 (459,950 単位 /kg 体重 / 日 ) と考えられた [ 参照 9] 9

11 4-1-2 特殊毒性試験変異原性試験表 9 変異原性試験結果試験対象用量結果参照復帰突然変異試 Salmonella typhimurium ,250 2,500 陰性参照 10 験 *1 TA98 TA100 TA1535 5,000 µg/plate(±s9) TA1537 Escherichia coli WP2uvrA 染色体異常試験ヒト末梢血リンパ球培養 1,582 2,813 5,000 µg/ml(±s9) 陰性参照 11 *2 細胞 *3 3h 処理後 17h 培養 2,048 3,200 5,000 µg/ml(+s9) 陰性参照 11 3h 処理後 17h 培養 1,311 2,048 4,000µg/ml(-S9) 陰性参照 11 20h 培養 *1 被験物質は脱イオン水に懸濁しろ過滅菌 *2 被験物質は注射用滅菌水に懸濁 *3 健常者 ( 非喫煙男性 )3 名の採血を等量混ぜたものから得たリンパ球変異原性試験では in vitro 系において細菌を用いる復帰突然変異試験とヒトから採取した末梢血のリンパ球を培養した細胞を用いた染色体異常試験が実施された結果は代謝活性化の有無にかかわらず陰性であったしたがってアルカリ性プロテアーゼには生体に影響する変異原性は認められないと判断された ( 表 9 参照 ) [ 参照 10 11] 4-2 対象家畜等を用いた飼養試験鶏ブロイラー (Ross308 雌雄 1 日齢平均体重 43g) を用いて基礎飼料 ( ) 又は基礎飼料にプロテアーゼを 24, , ,000 単位 /kg(2,080~5,280 10,080~26,240 20,320~52,640 単位 /kg 体重 / 日 ) 添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した (1 群 33 羽 6 反復 ( 雌 :3 反復雄 :3 反復 )) 1 日増体量はと比較して 240,000 単位 /kg 添加群で有意に高く飼料要求率は 120,000 及び 240,000 単位 /kg 添加群で有意に低かった (p<0.05) 血液学的検査血液生化学的検査及び死亡率については全群において有意差は認められなかった総消化管重量についてはプロテアーゼ 120, ,000 単位 /kg 添加群で有意に減少したこれは酵素摂取により栄養素の消化改善消化管への吸収促進の結果消化管の発達が抑制されたのではないかと考察された ( 表 10 参照 ) [ 参照 12] 10

12 表 10 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの安全性プロテアーゼ添加群 ( 単位 /kg) 24, , ,000 1 日増体量 (g/ 日 ) 49.4 b 48.4 b 50.4 ab 51.7 a 1 日飼料摂取量 (g/ 日 ) 飼料要求率 a a b c 総消化管重量 *(g) a ab b b 肝臓重量 *(g) 総消化管比重 *(%) 肝比重 *(%) 剖検所見 * 皮下組織の点状出血 0/12 1/12 0/12 1/12 肝臓萎縮 0/12 1/12 1/12 1/12 肝臓腫大 2/12 1/12 1/12 0/12 上大静脈肥厚 0/12 1/12 0/12 0/12 胸腺腫大 0/12 2/12 1/12 1/12 脾臓萎縮 1/12 1/12 0/12 0/12 ファブリキウス嚢腫大 1/12 2/12 1/12 2/12 各項目内の異文字間に有意差あり (ANOVA LSD test, p<0.05) *:1 群あたり 12 羽 5 審議結果アルカリ性プロテアーゼ ( 企業推奨添加量 : 鶏用飼料に 24,000 単位 /kg) の効果安全性について審議した飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進を本剤の効果とし飼料へ添加することは適当であると判断された 1 本剤の効果 : 飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進 2 対象家畜 : 鶏 11

13 6 参照 ( 参考文献及び参考資料 ) 1. 酵素剤のニワトリにおける消化率向上を確認する試験 ( 日本科学飼料協会 ) (2010) 2. The efficacy of Ronozyme ProAct(CT) on growth performance of broiler chickens fed a based on maize and soybean meal (DSM) (2007) 3. Efficacy of RONOZYME 6246 in broiler chickens (DSM) (2007) 4. The efficacy of graded levels of the liquid formulation of Ronozyme ProAct(L) on performance and, nutrient and energy digestibility of broiler chickens (DSM) (2008) 5. Efficacy of Ronozyme Proact(CT) in Broilers Diets on Live Performance and Carcass Quality (DSM) (2012) 6. A Feed Serine Protease Improves Broiler Performance and Increases Protein and Energy Digestibility (JPSA) (2011) 7. Effects of a monocomponent protease on performance and protein utilization in 7 to 22-day-old-brolier chickens (Poultry Science) (2011) 8. Effects of Supplementation of Ronozyme ProAct in Commercial Broiler Diets Application of ProAct Matrix (DSM) (2014) 9. 10R Protease, PPA 26797: A 13-WEEK ORAL(GAVAGE) TOXICITY STUDY IN RATS (Scantox) (2007) R Protease, PPA 26797:Test for Mutagenic Activity with Strains of Salmonella typhimurium and Escherichia coli (Novozymes A/S) (2007) R Protease: Induction of chromosome aberrations in cultured human peripheral blood lymphocytes (COVANCE) (2007) 12. Tolerance study with RONOZYME 6246 in broiler chickens (DSM) (2007) 12

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PowerPoint プレゼンテーション第 2 回サラシア属植物シンポジウム講演要旨平成 21 年 8 月 25 日近畿大学においてサラシア属植物エキス含有飲料の食後血糖上昇抑制効果と長期摂取および過剰摂取の安全性の検討平成 21 年 8 月 25 日企画室北林広巳 1 サラシアエキスの有効性と安全性サラシア属植物含有飲料について有効性試験安全性試験の結果をご報告いたします注 ) TB0018 コタラノール L はサラシア属植物エキス含有飲料を指します

資料 11-2 飼料添加物の効果安全性について アルカリ性プロテアーゼ 平成 30 年 1 月 29 日 農林水産省消費 安全局畜水産安全管理課

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