Microsoft Word - ZC_PAGE_j.doc

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ちえこみねむら
5 years ago
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1 遺伝子多型を検出する電気泳動法 - 亜鉛サイクレンを用いたポリアクリルアミド電気泳動法 (PAGE) ヒトゲノム計画が完了した現在生命活動においてゲノム情報がどのように利用されているのかを解析することゲノミクスがこれからの課題となっていますヒトゲノムの塩基配列が決定されても大多数の遺伝子産物についての機能は分かっておらずまた機能の分かっているものでもそれらの発現調節機構の詳細は依然不明のままですゲノムミクスにおいて最も重要なことの一つは疾患発症に関連する遺伝子の解析ですヒトの遺伝子の塩基配列には多型とよばれる個人差があり特に 1 個の塩基が他の塩基に置換した一塩基多型 SNP single nucleotide polymorphism は 1000 塩基対に 1 ヵ所の高頻度で存在します SNP と特定の疾患が関連する場合 SNP はその疾患のマーカーとして利用できますしたがって SNP の研究成果は疾患の診断や予測やゲノム創薬やオーダーメード医療へと発展することが期待されますしかしそれを実現するためにはより高精度でかつ簡便迅速低コストに解析できる SNP 検出法の開発が急務です私たちの研究室ではチミン塩基に優先的に結合し DNA中のチミン塩基にも結合する亜鉛サイクレン Zn 1,4,7,10-tetraazacyclododecane Zn cyclen を用いたポリアクリルアミド電気泳動法亜鉛サイクレン PAGE というSNP検出法を開発していますこのプロトコルで紹介する亜鉛サイクレン PAGEには以下のような長所があります実験操作は一般的なポリアクリルアミド電気泳動法と同じです特別な装置や高価な蛍光プローブは不要ですミニゲル１枚につき約１ドルの亜鉛サイクレンをゲル内に添加するだけで分析ができます放射性同位元素は使用しません一般的なDNAのゲル蛍光染色で検出できます電気泳動による分離操作を利用しているので非特異的PCR産物が混ざったサンプルも分析できますヘテロ接合体の検出や遺伝子変異動物の遺伝子検査にも利用できます参考文献 1. A novel procedure for simple and efficient genotyping of single nucleotide polymorphisms by using the Zn2+-cyclen complex. Nucleic Acids Research, 30, e126 (2002), Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike 2. Reliable and cost-effective screening of inherited heterozygosity by using Zn2+ cyclen polyacrylamide gel electrophoresis. Clinical Chemistry, 51, (2005), Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Hirokazu Kojima, Yoko Nakano, Kazuaki Chayama, and Tohru Koike 3. Non-SCN5A related Brugada syndromes: Verification of normal splicing and trafficking of SCN5A without exonic mutations. Annals of Human Genetics, 71, 8-17 (2007), Yukiko Nakano, Satoshi Tashiro, Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita Kikuta, Sou Takenaka, Miwa Miyoshi, Hiroshi Ogi, Eichiro Sakada, Tomokazu Okimoto, Yukoh Hirai, Noboru Oda, Fumiharu Miura, Kazuko Yamaoka, Tohru Koike, and Kazuaki Chayama

2 使用するトリスヒドロキシメチルアミノメタン Tris グリシン塩酸アクリルアミド N, N メチレンビスアクリルアミド過硫酸アンモニウム SYBR Green I TEMED テトラメチルエチレンジアミン EDTA 2Na グリセロール硝酸亜鉛六水和物 BPB ブロムフェノールブルー KOD Plus- DNA ポリメラーゼ東洋紡株式会社亜鉛サイクレン硝酸塩受託合成品株式会社ナード研究所すべてのは電気泳動用または特級が望ましい使用する機器など電気泳動装置 ATTO AE-6500 型ラピダスミニスラブ電気泳動電源 ATTO AE-8130 型マイパワー500 ゲル撮影装置 ATTO AE-6920V-FX デンシトグラフ容量可変ピペット 10μℓ 200μℓ 1000μℓ 5000μℓ 電子天秤スターラー ph メーターピペットチップメスシリンダースパーテル遠心チューブシリンジ保存用ビンポリプロピレン製タッパーゲル染色用使用する溶液 A液 30%(w/v) アクリルアミド水溶液冷暗所保存アクリルアミド 29.7 g N, N メチレンビスアクリルアミド 0.3 g 100 にメスアップ適量 B 液 30%(w/v) アクリルアミド水溶液冷暗所保存アクリルアミド 29.0 g N, N メチレンビスアクリルアミド 1.0 g 100 にメスアップ適量 C 液 1.5 M Tris-HCl 緩衝液 ph Tris 18.2 g 80 6 M 塩酸 ph 8.8 に調整適量 100 にメスアップ適量

4 SYBR Green I 染色液使用直前に調整 10 SYBR Green I １μℓ ゲルサイズに合ったポリプロピレン製タッパーに入れる分離ゲル濃縮ゲルを採用しない場合電気泳動実験 A 用 8.0 A 液 5.67 C 液 2.13 E 液 85μℓ 500μℓ TEMED 15μℓ G 液 100μℓ A 液 C 液 E 液蒸留水 TEMED を遠心チューブに加えよく混合するゲル作成直前に G 液を混合した後ゲル溶液をガラスプレートの間へ注入するトラブルシューティング１参照分離ゲル溶液濃縮ゲルを採用する場合電気泳動実験 B 用 6.5 A 液 4.33 C 液 1.63 E 液 65μℓ 370μℓ TEMED 15μℓ G 液 90μℓ A 液 C 液 E 液蒸留水 TEMED を遠心チューブに加えよく混合するゲル作成直前に G 液を混合した後ゲル溶液をガラスプレートの間へ注入する濃縮ゲル溶液電気泳動実験 B 用 2 B 液 300μℓ D 液 500μℓ 1.15 TEMED 10μℓ G 液 40μℓ B 液 D 液蒸留水 TEMED を遠心チューブに加えよく混合するゲル作成直前に G 液を混合した後ゲル溶液をガラスプレートの間へ注入する

5 泳動用サンプルの調整実施例 A ラット骨格筋電位依存性 Na チャネル遺伝子 rscn4a の PCR 産物 bp 野生型 DNA 断片 PCR 産物と一塩基変異を導入した 8 種類の変異型 DNA 断片 PCR 産物を TA クローニングベクターに挿入しそれらを鋳型 DNA とする PCR 条件 5μℓ 鋳型 DNA 0.4 ng/μℓ 0.5μℓ 0.2 ng フォワードプライマー 10μM 0.2μℓ 0.2μM リバースプライマー 10μM 0.2μℓ 0.2μM dntps 各 2 mm 0.5μℓ 各 0.2 mm μℓ buffer for KOD Plus- 25 mm 硫酸マグネシウム水溶液 0.2μℓ 1.0 mm 3.1μℓ KOD Plus- DNA ポリメラーゼ 0.1μℓ 0.1 unit ヘテロサンプルは野生型と変異型の 2 種鋳型 DNA を 1 : 1 混合して PCR を行う 95 3 分間の後秒秒秒を 35 サイクル電気泳動実験 A で泳動を行ったアプライ量は 0.5μℓ/well 実施例 B Brugada 症候群患者 10 人の心室筋由来電位依存性 Na チャネル遺伝子 hscn5a のエクソン 21 領域を含む PCR 産物 100 bp 各患者の白血球より単離精製したゲノムを鋳型 DNA とする PCR 条件 5μℓ 鋳型 DNA 1.0 ng/μℓ 1.0μℓ 1.0 ng プライマーフォワードリバース各 1.0μM 1.0μℓ 各 0.2μM dntps 各 2 mm 0.5μℓ 各 0.2 mm μℓ buffer for KOD Plus- 25 mm 硫酸マグネシウム水溶液 0.2μℓ 1.0 mm 1.675μℓ KOD Plus- DNA ポリメラーゼ 0.125μℓ unit 95 3 分間の後 95, 20 秒 60, 30 秒 68, 20 秒を 35 サイクル行った電気泳動実験 B で泳動を行ったアプライ量は 0.5μℓ/well である

6 電気泳動実験 A 濃縮ゲルを採用しない実験 1) ゲル作成用のガラスプレートを組み立てる 2) 分離ゲル溶液を調整し注入する 3) サンプルコームを挿入分放置してゲル化させる 4) 泳動槽用緩衝液 150 と F 液 1.5 を泳動槽下部に入れる 5) サンプルコームとパッキンを抜いたゲルを泳動槽にセットする 6) 泳動槽上部に泳動槽用緩衝液を入れる 7) アプライする PCR 産物に 2 分の 1 倍量の泳動用サンプル調製液を注入した後混合する 8) 各 well にサンプルをアプライした後電源をセットする 9) 通電を始める定電流法 25 ma/ゲル約 100 分間 10) 泳動用サンプル調製液に入っている BPB の色素ライン泳動先端がゲル下端より１cm に来た時泳動終了 11) ゲルをガラスプレートから剥がす 12) SYBR Green I 染色液 10 にゲルを浸し 5 10 分間ゆっくり振とうする 13) ゲルを撮影する電気泳動実験 B 濃縮ゲルを採用した実験 1) ゲル作成用のガラスプレートを組み立てる 2) 分離ゲル溶液を調整し注入する 3) 蒸留水 1 2 を注入し重層した後分放置してゲル化させる 4) 上層の蒸留水をトイレットペーパーなどで取り除いた後ろ紙で余分な水分をさらに除く 5) 濃縮ゲル溶液を調整し注入する 6) サンプルコームを挿入分放置してゲル化させる 7) 泳動槽用緩衝液 150 と F 液 1.5 を泳動槽下部に入れる 8) サンプルコームとパッキンを抜いたゲルを泳動槽にセットする 9) 泳動槽上部に泳動槽用緩衝液を入れる 10) アプライする PCR 産物に 2 分の 1 倍量の泳動用サンプル調製液を注入した後混合する 11) 各 well にサンプルをアプライした後電源をセットする 12) 通電を始める定電流法 25 ma/ゲル約 100 分間 13) 泳動用サンプル調製液に入っている BPB の色素ライン泳動先端がゲル下端より１cm に来た時泳動終了 14) 分離ゲルのみをガラスプレートから剥がす 15) SYBR Green I 染色液 10 にゲルを浸し 5 10 分間ゆっくり振とうする 16) ゲルを撮影する

7 実施例 A rscn4a の PCR 産物 bp 野生型を鋳型 DNA とした PCR 産物数字各８種類の変異型を鋳型 DNA とした PCR 産物 +各数字野生型と各８種類の変異型の 1:1 混合を鋳型とした PCR 産物 G/A は野生型のグアニン塩基がアデニン塩基に置換した変異型であることを示す 100 bp +1 G/A 1 +5 G/T G/T 2 A/G C/A T/A 6 +7 G/C 7 +8 C/G A/G A/G 5 +3 A/G C/A G/A 200 bp T/A 7 G/C +8 C/G 8 トラブルシューティング 2 参照実施例 B 患者 10 人の hscn5a エクソン 21 の PCR 産物 100 bp 電気泳動の結果患者 2 に複数本 2 本のバンドが検出された全サンプルにおいて同領域を DNA シークエンサーでも解析を行ったその結果患者 2 のエクソンーイントロン境界部配列 5 イントロン配列においてグアニン塩基からアデニン塩基への一塩基置換が検出されたこれはスプライス異常を示唆する変異でありこれまでに報告のない世界で初めての検出例であったトラブルシューティング 3 参照

8 使用条件と注意事項亜鉛サイクレンは研究用です一般的な化学の使用法を理解している研究者により取り扱ってください人体や動物には絶対に使用しないでください匂いや刺激性はありませんが皮膚に付着したり目に入ったりした場合すぐに多量の水で洗い流してくださいトラブルシューティング１アプライするサンプル量が多くゲル染色後に DNA バンドのテーリングが観察されるような時は濃縮ゲルを採用した実験プロトコルで検討して下さいトラブルシューティング 2 泳動する DNA 断片 PCR 産物の長さが 200 bp 以内であれば変異塩基の種類に関わらず検出可能であることを確かめていますトラブルシューティング 3 サンプルのアプライ量が 2.0 μℓ/well より多くなる場合においては濃縮ゲルを採用した電気泳動実験 B の手順を行うことでよりシャープな泳動像が観察できます亜鉛サイクレン PAGE の説明図 Edited by Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike Department of Functional Molecular Science, Graduate School of Biomedical Sciences, Hiroshima University

■リアルタイムPCR実践編

■リアルタイムPCR実践編リアルタイム PCR 実践編 - SYBR Green I によるリアルタイム RT-PCR - 1. プライマー設計 (1)Perfect Real Time サポートシステムを利用し設計済みのものを購入するヒトマウスラットの RefSeq 配列の大部分については Perfect Real Time サポートシステムが利用できます目的の遺伝子を検索して購入してください (2) カスタム設計サービスを利用する