細胞増殖測定細胞染色プロトコル

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2 Cell Counting Kit Cell Counting Kit -8 3 Cell Counting Kit -F -Cellstain- -Cellstain- -Cellstain- Calcein-AM solution -Cellstain- CytoRed solution -Cellstain- BCECF-AM special packaging -Cellstain- -Cellstain- -Cellstain- -Cellstain- DAPI solution -Cellstain- EB solution -Cellstain- PI solution -Cellstain- -Cellstain- AO solution -Cellstain- Hoechst Cellstain- Hoechst Cellstain- -Cellstain Cellstain- Double Staining Kit

3 3 3

4 8 Cell Counting Kit 8 l g l g 8 1 (Cell Counting 8 (Cell Counting 8 3 High-Throughput Screening Cell Counting CellCounting 8 96 Cell Counting Cell Counting 8 Cell Counting Kit : nm Cell Counting Kit-8 : nm Cell Counting Kit Cell Counting Kit -804 Cell Counting Kit!! Cell Counting Kit-8!!

5 8 Cell Counting Kit l g l g 8 l g l Counting Kit-8 cells /ml l g Cell Counting Kit Cell Counting Kit : nm Cell Counting Kit-8 : nm 60

6 8 Cell Counting Kit , , l l g : DMEM (10% FBS) : RPMI1640 (10% FBS) 37, 3 hr 37, 35 hr 5% CO 2 5% CO 2 : 450 nm : 450 nm Cell Counting Kit-8 3 Cell Counting 8 3

7 8 Cell Counting Kit cells /ml

8 8 Cell Counting Kit 96 Cell Counting Kit nm Cell Counting Kit, Cell Counting Kit l g l g 8 Cell Counting Cell Counting 8

9 8 Cell Counting Kit w /v 10

10 8 Cell Counting Kit Cell Counting Kit (Cell Counting Kit ( 還元体 ) 脱水素酵素 酸化体 基質 WST18 1-Methoxy PMS 18 1-Methoxy PMS Cell Counting Kit (Cell Counting Kit Cell Counting Kit (Cell Counting Kit Cell Counting Kit (Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit (Cell Counting Kit

11 Cell Counting Kit well well well w/v% SDS mol/ l Cell Counting Kit (Cell Counting Kit- nm nm nm nm

12 Cell Line Description Reference human kidney carcinoma Fuda, et al., J. Lipid Res., 2007, 48, 1343 mouse embryonic fibroblast Huang, et al., FASEB J., 2005, 19, 2014 human epithelial carcinoma cell Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, 2563 human lung cancer cell et al. Toxicol. Sci et al. J. Biol. Chem., 2003, 278, Stankova, et al., Clin. Cancer Res., 2005, 11, ;I.Imoto, et al., Cancer Res., , ; S. Semba, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, Alexander cell pancreatic cancer cell S. wale, et al., Cancer Res., 2006, 66, 1751 multiple myeloma Inoue, et al., Am. J. Pathol., 2004, 165, 71 pancreatic tumor cell Bose, et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2005, 289, G926 human anaplastic thyroid carcinoma Furuya, et al., Endocrinology, 2004, 145, 2865 pancreatic cancer cell Mori, et al., Mol. Cancer Ther., 2004, 3, 29. ; S. wale, et al., Cancer Res. 2006, 66, murine malignant melanoma Shibata, et al., J. Immunol., 2006, 177, bovine brain microvascular endothelial Kitamuro, et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, human bronchial epithelial cell et al. Toxicol. Sci , 170 et al. Toxicol. Sci., 2006, 89, 278. bone marrow mesenchymal stem cell Miura, et al., Stem Cells, 2006, 24, human cervical carcinoma ang, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, 1610., chinese hamster ovary cell et al. Am. J. Pathol , 1337 et al. Cancer Res., 2007, 67, Ikonen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, African green monkey kidney cell Kitamuro, et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, ; H. Bando, et al., Clin. Cancer Res., 2005, 11, 5784 African green monkey kidney cell Peloponese, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, human medulloblastoma et al. Mol. Cancer Ther , et al. Clin. Cancer Res., 2006, 12, human burkitt lymphoma Ho, et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 607. human colorectal adenocarcinoma Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, chicken B-lymphocyte cell Shinozaki, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, human prostate carcinoma Davis-Searles, et al., Cancer Res., 2005, 65, ; D. J. Son, et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6, 675. human melanoma cell Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, human gastric carcinoma Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., , human pulmonary adenocarcinoma Shimura, et al., Cancer res., 2001, 61, human breast cancer cell Iliopoulos, et al., Clin. Cancer Res., 2007, 13, 268. human embryonic kidney cell Semba, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, human cervical carcinoma Shimura, et al., Cancer res., 2001, 61, 3640.; C. Shi, et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, human hepatocellular carcinoma J. K. Sicklick, et al., Carcinogenesis, 2006, 27, 748 Hippocampal neuron, primary A., et al., Toxicol. Sci., , 170.;. Ohuchida, et al., Cancer 2004, 100, 2430.; Human hepatocellular liver carcinoma Shiokawa, et al., Clin. Cancer Res., 2005, 11, ; H. Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, from Wistar rat embryos Kurata, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2004, 311, 237. et al. FASEB J , et al. Stem Cells human mesenchymal stem cell , Kasai, et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 5187 human cell acute myeloid leukemia cell Zhou, et al., Blood, 2007, 109, multiple myeloma Inoue, et al., Am. J. Pathol., 2004, 165, 71. esophageal squamous cell carcinoma Kasai, et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, ; L. Lu, et al., J. Biochem. 2007, 141, 157. et al. Cancer Res , et al. Carcinogenesis, 2002, 23, 19. mouse fibroblast Morita, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, human lung adenocarcinoma Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, human prostate carcinoma J. Son, et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6, 675. Miyake, et al., J. Immunol., 2007, 178, canine kidney epithelial cell Shimura, et al., Cancer res., , pancreatic cancer cell A. Aghdassi, et al., Cancer Res., 2007, 67, 616. et al. J. Biol. Chem , 5187; et al. J. Biol. Chem., , mouse fibroblast u, et al., Toxicol. Sci., 2006, 93, 82. human embryonal carcinoma, et al., Infect. Immun., , pancreatic cancer cell Mori, et al., Mol. Cancer Ther., 2004, 3, 29.; S. wale, et al., Cancer Res , 1751; A. Aghdassi, et al., Cancer Res., 2007, 67, 616. human lung small-cell carcinoma, et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, primary cortical neuron Chiba, et al., J. Neurosci., , pancreatic cancer cell S. wale, et al., Cancer Res., , W 264 mouse macrophage Shiga, et al., Anesth. Analg., 2001, 92, 128. B lymphoblastoid cell R. A. Dalloul, et al., Poult. Sci., 2006, 85, 446. human gastric cancer cell Ohori, et al., Mol. Cancer Ther., 2006, 5, human neuroblastoma Nakagawa, et al., Mol. Cell. Biol., 2002, 22, human neuroblastoma ang, et al., J. Virol., 2004, 78, 7916.

13 * Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 2

14 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST tests 500 tests 2000 tests (6 ) LDH LDH 5% 2 ( ) 3 P CO % 13

15 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST CO nm

16 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST CO % CO nm 10% LDH LDH LDH LDH LDH 15

17 LDH 5% 6

18 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST CO g nm

19 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST - 96 ( P19 ) 37 CO % CO g nm 18

20

21 -Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST - DH Assay Kit-WST DH Assay Kit-WST HeLa 5000 CO 2 (37 ) 1 CO 2 (37 ) 1 30 LDH LDH nm CCK-8 CCK-8 CO 2 (37 ) nm : HeLa : MEM 10% FBS : Tween 20 1

22 g 1

23 Q&A

24 Cell Counting Kit , Mg 2 25 mg PBS(-) 5 ml!!! mol/l 01 ml 10 ml! 4 mol/l

25 cells /ml

26 , , well nm Cell Counting Kit, Cell Counting Kit-8 l g l g 8 18 l g l g 8 g l g 8

27 cells /ml

28

29

30 ミトコンドリア脱水素酵素 黄色溶液 難溶性沈殿

31 l g l g l g l g 8 l g Cell Counting Kit nm nm Cell Counting Kit -F06 2, Mg 2! Cell Counting Kit-F Cell Counting Kit-F 50!

32 Cell Counting Kit-F Cell Counting Kit-F l g nm nm

33 , , well Cell Counting Kit-F Cell Counting Kit-F

34 cells /ml

35 l g nm nm

36 l g l g Cell Counting Cell Counting

37 Cell Counting Kit-F Calcein-AM (Calcein) Cell Counting Kit-F Cell Counting Kit-F Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-F 無蛍光 蛍光

38

39

40 Calcein-AMFluorescein diacetate (FDA)CFSE fluorescein Propidium iodide (PI)Ethidium bromide (EB) DAPI DNA

41 -Cellstain- Calcein-AM -Cellstain- CFSE -Cellstain- FDA -Cellstain- DAPI -Cellstain- EB -Cellstain- PI -Cellstain- Calcein-AM solution -Cellstain- CytoRed solution BCECF-AM -Cellstain- DAPI solution -Cellstain- EB solution -Cellstain- PI solution DMSO PBS(-) -Cellstain- AO -Cellstain-AO solution -Cellstain- Hoechst Cellstain- Hoechst Cellstain- MitoRed -Cellstain- Rh123 ( DMSO (DMSO ) -Cellstain- Calcein-AM mg 0.5-1mmol/l -Cellstain- Calcein-AM solution ml 1mmol/l 1-20 mol/l -Cellstain- CFSE mg 0.5-1mmol/l ( PBS(-) -Cellstain- CytoRed solution ml 1mmol/l ) -Cellstain- FDA mg 0.5-1mmol/l BCECF-AM Special packging µg x mmol/l! PBS(-)

42 -Cellstain- DAPI mg 1 mg/ml -Cellstain- DAPI solution ml 1 mg/ml of Buffer μ -Cellstain- EB mg 1 mg/ml -Cellstain- EB solution ml 1 mg/ml -Cellstain- PI mg 1 mg/ml -Cellstain- PI solution ml 1 mg/ml! -Cellstain- AO mg 1 mg/ml -Cellstain- AO solution ml 1 mg/ml 1-10 g/ml ( PBS(-) -Cellstain- Hoechst solution ml 1 mg/ml ) -Cellstain- Hoechst solution ml 1 mg/ml! DMSO (DMSO ) -Cellstain- MitoRed μg 8 1 mmol/l nmol/l -Cellstain- Rh mg 1 mg/ml nmol/l!

43

44 cells PBS(-)1 ml 30 50% PBS(-) 0.2 ml PBS(-)0.5 ml

45 1,000 rpm, 3 PBS(-) cells/ml 30 µl 15 µl µl

46 cells PBS(-)1 ml 30 50% PBS(-) 70%EtOH 1.0 ml % EtOH 100% MeOH %EtOH PBS(-)1 ml PBS(-) 0.2 ml PBS(-)0.5 ml

47 HeLa 1. BCECF-AM (x200, B ) Calcein-AM (x400, B ) CFSE (x400, B ) CytoRed (x200, G ) FDA (x400, B ) MitoRed (x200, G ) Rh123 (x200, B ) AO (x200, B ) Hoechst (x200, U )

48 HeLa 3. EB (x300, G ) DAPI (x200, U ) PI (x 200, G ) Cell Number 3% NIH3T3 Hoechst HyLite Fluor TM 555 Fluorescent Intensity HL60 Calcein-AM 488nm ( ( ) 0.5%Triton X % 0.5%Triton X-100

49 - Cellstain - Double Staining Kit ( ) Calcein-AM PI (Propidium Iodide) - Cellstain - Double Staining Kit CS01 A : Calcein-AM stock solution (1 mmol/l) B : PI stock solution (1.5 mmol/l) 4 vials 1 vial! -20 A Calcein-AM PBS(-) A B 5 ml PBS(-) A 10 l B 15 l Calcein-AM: 2 mol/l, PI: 4 mol/l! PI UV

50 HeLa 1,000 rpm, 3 PBS(-) cells/ml 200 l 100 l l

51 49010 nm 545 Calcein-AM PI mol/l PI 0.1% % 10 70% mol/l Calcein-AM Calcein-AM -Cellstain- Double Staining Kit MHD-1 (480 nm [ ]

52 PBS (Pluronic F-127) Probenecid) -Cellstain- CFSE 1mg

53 DMSO DMSO DMSO CFSE 8 Calcein-AMBCECF-AM 3 ES. A. Weston, et al., J. Immunol.Methods, 1990, 133, 87. EH. P. Zhong, et al., Hum. Immunol., 1993, 37, 264. Calcein-AMBCECF-AM EL. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, 1994, 172, 115. BCECF-AM ph Calcein-AM C F S E CytoRed Calcein-AM FDA Calcein-AMBCECF-AMCFDACFSE L. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, , 115. Calcein-AM BCECF-AM AO PIEBDAPI FDA Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38, 268.

54 53

55 -Cellstain- Double Staining Kit Calcein-AM PI Calcein-AM Calcein (AM) Calcein- AM AM PI DNA PI nm 545 nm Calcein-AM Calcein-AM PI 33 Calcein-AM L. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, , Calcein-AM PI PI UV

56

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