アフィニティービーズのご紹介 住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 -
製品概要 生体分子 ( タンパク質や核酸など ) のアプリケーションに幅広く対応できるアフィニティ精製用担体 ( 球状ビーズ ) です ビーズ表面に施した弊社独自の表面処理により非特異吸着が高度に抑制されています 高 S/N 比を実現! ビーズ表面の活性エステル基がアミノ基 (-NH2) をもつリガンド ( タンパク質 核酸等 ) を共有結合により 強固に固定できます ビーズを前処理する事無く 直接 ビーズにリガンドを固定できます ビーズのコア材は樹脂ではなくシリカなので 比重が大きく遠心分離後 上清とビーズがはっきりと分かれ B/F 分離が容易に行えます < 主な用途 > ターゲット物質の効率的な精製 高感度相互作用解析など - 2 -
担体 ( ビーズ ) の性状 アミノ基と共有結合 R アミノ基を持つリカ ント 活性エステル基 低吸着セグメント長さ 20A 10mm アフィニティービーズの SEM 画像 ポリマーによる表面処理 ポリマーはコアに直接結合 ( 共有結合 ) 多孔質シリカビーズ コア材 多孔質シリカ ( 孔径 7nm) 平均粒径 5μ m 充填密度 0.675g/ml 官能基 活性エステル 官能基密度 0.05μ mol/mg 主鎖から官能基までの距離 約 20A - 3 -
Q. リガンドの固定化量は? Q&A A. IgG( 抗体 ) Avidin の下記例をご参考下さい リカ ント 分子量 固定量 固定化時のリガンド濃度 μ g/mg pmol/mg mg/ml IgG 146,000 7.2 49 300 Avidin 60,000 4.2 70 1,250 Q. 有機溶剤 酸 アルカリ性に対する耐性は? A. 下記を確認下さい 殆どの有機溶剤に耐性があります 酸性についてはフッ酸には溶けますが それ以外の酸には比較的耐性があります グリシン塩酸 (ph2.5) に室温 1 分間浸漬で問題ありませんでした アルカリ性については ph9.5 で 37 4 時間までは物理的な劣化は確認されませんでしたが コア材がシリカですので基本的にアルカリ性には弱いとお考えください - 4 -
リガンドの固定化スキーム R 活性基 : アミノ基を持つ化合物と反応 + H 2 N R R : 小分子リガンド抗体アビジン 低吸着表面 R + R DNA 置換反応 ビーズ表面の活性基とアミノ基 (-NH2) を持つ化合物が置換反応し固定化されます - 5 -
アプリケーション例 アビジン固定化ビーズの調製 P.7~12 ビオチン固定化ビーズの調製 P.13~18 サンドイッチ法による IL-4 の検出 P.19~20 SDS-PAGE による CRP の検出 P.21~24 DNA ハイブリダイゼーション反応 P.25~27-6 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定 アビジン固定化量及び非特異吸着量の定量 S-BIO ビーズの官能基にアビジンを直接固定化し, ビオチン標識化 HRP を捕捉 1 1.1711 S/N=19.5 0.7505 S/N=7.6 Anti Human IgG の非特異吸着を評価 Bio tin Avidin 0 0.0599 0.0983 HRP-Biotin HRP-Antibody HRP-Biotin HRP-Antibody Anti Human IgG Avidin Y S-BIO R beads A 社アヒ シ ンビーズ S/N 比が高い - 7 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定 検出感度曲線 1.5 1 高感度! S-BIO ビーズの官能基にアビジンを直接固定化し, ビオチン標識化 HRP を捕捉 0.5 S-BIO R A 社 (1mg 使用 ) (1mg 使用 ) Bio tin 0 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 Avidin [HRP-Biotin](M) 高感度検出可能 - 8 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定 ヒト血清の非特異吸着量 0.4 0.3215 アビジン化したビーズに対するヒト血清中の IgG の非特異吸着 0.1275 Anti Human IgG Y 人血清中の IgG Avidin 0 S-BIO S-BIO R beads R A 社 A 社アヒ シ ンビーズ ヒト血清の非特異吸着が少ない - 9 -
< 応用例 > アビジンの固定 アビジンビーズ特性比較まとめ 特性 S-BIO アヒ シ ンヒ ース A 社アヒ シ ンヒ ース コア材 シリカ 磁性粒子 平均粒径 5mm 1.05mm 充填密度 0.40g/ml 沈降性 / 分離性 卓上遠心機 磁石で分離 ビオチン捕捉能 A 社以上 2500 pmol free biotin 再分散性 ピペッティングで可 ピペッティングで可 S/N 比 A 社以上 検出感度 A 社以上 人血清 IgGの非特異吸着 A 社以下 - 10 -
< 応用例 > アビジンの固定 アビジンビーズ作製プロトコル (i) ビーズ 37mg と 50mg /ml アビジン溶液 ( 弊社固定化溶液 )1ml を混合し, 37 で 4 時間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 1 PBS Buffer で数回洗浄 (iv) 弊社フ ロッキンク 溶液 1ml を投入し活性基を不活性化 室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi)1 PBS Buffer で数回洗浄 (vii) 乾燥 ( 凍結乾燥可能 ) - 11 -
< 応用例 > アビジンの固定 アビジンビーズ評価例 (i) アビジン化ビーズ 1mg と 5mg /ml ビオチン標識化 HRP 溶液 ( 溶媒は 1 PBS Buffer (ph7.4))1ml を混合し, 室温下, 30 分間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 0.05% の Triton 100 を含む 1 PBS Buffer で 5-10 回洗浄 (iv)3,3, 5,5 -Tetramethylbenzidine (TMBZ) を含む発色溶液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を投入し, 室温下, 15 分間攪拌 (v) 停止液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を加え反応を停止 (vi) 遠心分離後, 上澄み液の吸光度 (450nm) を測定 - 12 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定 ビオチン固定化量及び非特異吸着量の定量 2 1.4718 S/N=12.6 1.6394 S/N=2.5 ビーズにビオチンを固定化し, HRP 標識化アビジンを捕捉 アヒ シ ン濃度 (5ug/ml) 1 0.6508 Avidin 0.1164 Bio tin 0 Biotin 固定化 Biotinなし Biotin 固定化 Biotinなし S-BIOSbio R beads B 社ビーズ S/N 比が高い B 社ビーズはビオチンなしでも非特異的に固定化されるアヒ シ ンがある - 13 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定 検出感度曲線 1.5 1 0.5 S-BIO R (1mg 使用 ) B 社 (10μL 使用 ) S-BIO R 不活性化 B 社不活性化 ビーズにビオチンを固定化し, HRP 標識化アビジンを捕捉 Avidin Bio tin 0 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 [HRP-Streptavidin](M) 非特異吸着 Avidin 非特異吸着量が少ない - 14 -
Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定 ヒト血清の非特異吸着量 2.5 2.2989 ビオチン化したビーズに対するヒト血清の IgG の非特異吸着 Anti Human IgG Y 人血清中の IgG 0.2197 Bio tin 0 S-BIO R beads ビオチン B 社ビーズビオチン ヒト血清の非特異吸着が少ない - 15 -
< 応用例 > ビオチンの固定 ビオチンビーズ特性比較まとめ 特性 S-BIO B 社 コア材 シリカ アガロースゲル 平均粒径 5mm 75-300mm 充填密度 0.40g/ml 官能基密度 0.14-0.17mmol/mg 15mmol/ml of gel 耐溶剤性 DMSO, 他は未評価 Alchole, DMSO, dioxane, formabid 沈降性 卓上遠心機で可 卓上遠心機で可 再分散性 ピペッティングで可 ピペッティングで可 S/N 比 B 社以上 検出感度 B 社同等 人血清 IgGの非特異吸着 B 社以下 - 16 -
< 応用例 > ビオチンの固定 ビオチンビーズ作製例 (i) ビーズ 10mg と 16mM アミノ化ビオチン溶液 ( 弊社固定化溶液 あるいは DMSO) 100ul を混合 (ii) チューブローテーターにより 37 で 3 時間攪拌 (iii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iv) 弊社フ ロッキンク 溶液 (1ml) を投入し活性基を不活性化 室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi) 1 PBS Buffer で数回洗浄 (vii) 乾燥 ( 凍結乾燥可能 ) - 17 -
< 応用例 > ビオチンの固定 ビオチンビーズ評価例 (i) ビオチン化ビーズ 1mg と 5mg /ml HRP 標識化アビジン溶液 ( 溶媒は 1 PBS Buffer (ph7.4))1ml を混合し, 室温下, 30 分間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 0.05% の Triton 100 を含む 1 PBS Buffer で 5-10 回洗浄 (iv) 3,3, 5,5 -Tetramethylbenzidine (TMBZ) を含む発色溶液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を投入し, 室温下, 15 分間攪拌 (v) 停止液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を加え反応を停止 (vi) 遠心分離後, 上澄み液の吸光度 (450nm) を測定 - 18 -
応用例 < サンドイッチ法による IL-4 の検出 > 検出感度曲線 高い濃度依存性 非特異吸着が少ない 高い濃度依存性 & 非特異吸着が少ない - 19 -
応用例 < サンドイッチ法による IL-4 の検出 > サンドイッチ法による IL-4 の検出の評価例 (i) 50μ g/ml に調製した IL-4 抗体溶液中にアフィニティービーズ 20mg を分散させ 室温にて 4 時間転倒混和して抗体固定化 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (ii) 0 32 63 125pg/mL に調製した I L-4 溶液中に上記ビーズを 5mg 分散させ 室温にて 2 時間転倒混和して抗原捕捉 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (iii) 500ng/mL に調製したビオチン標識 IL-4 抗体溶液 1mL に分散させ 室温にて 1 時間転倒混和 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (iv) 100ng/mL に調製した HRP 標識 IL-4 ストレプトアビジン溶液に分散させ 室温にて 30 分転倒混和して標識化 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (v) ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いて ビーズに捕捉された HRP 標識ストレプトアビジンの固定化量を 450nm の吸光度により測定 (vi) 他社活性型アフィニティビーズ (micromod 社の sicastar( 表面修飾基 :NHS)) についても 上記と同様の実験を実施 なお IL-4 抗体固定化後 ビーズを 1%BSA 含有 PBS1mL に分散させ 2 時間転倒混和することにより ブロッキングする工程を追加で実施した - 20 -
応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > SDS-PAGE による CRP の検出結果 (kda) 分子量マーカー 1 2 3 250 150 100 75 50 37 25 20 15 1CRP 抗体固定ビーズ 2 抗体なし ビーズ 3CRP CRP 3μ g/ml の CRP 中に分散させた後 SDS-PAGE で電気泳動 抗体固定化ビーズで補足したCRPを遊離して検出 CRPの非特異吸着が少ない - 21 -
応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > SDS-PAGE による CRP の検出の評価例 (i) 50μ g/ml の CRP 抗体溶液にアフィニティービーズ 20mg を分散させ 室温にて 1 晩転倒混和して抗体を固定化 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄 (ii) 抗体を固定化せず 不活性化用緩衝液を用いて不活性化したビーズを上記と同様に作製 (iii) 上記ビーズ各 6mg を 3μ g/ml に調製した CRP 溶液中に分散させ 4 にて 2 時間転倒混和して CRP を捕捉 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄 (iv) グリシン HCl バッファ (ph3) を用いてビーズに捕捉された CRP を溶出し SDS サンプルバッファで変性 (v) SDS-PAGE で電気泳動 - 22 -
吸光度 @450nm 応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > CRP 抗体固定化ビーズの抗体固定化量 HRP 標識 Anti-Mouse IgG 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 CRP 抗体固定化ビーズ 抗体固定化量 Anti-CRP IgG Anti-CRP IgG ありなしありなし S-BIO - 23 - C 社 抗体固定化量が多い 抗体固定化量 不活性化ビーズ
CRP 抗体固定化ビーズの抗体固定化量評価例 (i) CRP 抗体固定化ビーズおよび不活性化ビーズ各 5mg を 1.3μ g/ml に調製した HRP 標識 Anti-Mouse IgG 溶液 1mL に分散させ 室温にて 1 時間転倒混和 (ii) 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄後 ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いて ビーズに捕捉された HRP 標識 Anti-Mouse IgG 量を 450nm の吸光度により測定 (iii) 他社活性型シリカビーズについても 同様に評価した なお CRP 抗体固定化後 ビーズを 1%BSA 含有 PBS1mL に分散させ 2 時間転倒混和することにより ブロッキングする工程を追加で実施した - 24 -
Abs DNA ハイブリダイゼーション反応 O C OR NH2 dt 30mer DNA を固定 dt 30mer ヒ オチン標識 da30mer ハイフ リタ イセ ーション反応室温 30 分 dt 30mer HRP 標識アヒ シ ン 基質 吸光度測定 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 吸光度測定結果 bare beads dtなしヒ ース dt immobilized beads dt 固定化ヒ ース ビーズ上でハイブリダイゼーション反応可能 - 25 - SUMITOMO SUMITOMO BAKELITE BAKELITE CO.,LTD. CO.,LTD.
DNA 固定化プロトコル (i) ビーズ 10mg と 5μ M アミノ修飾 dt30mer 溶液 ( 弊社固定化溶液 あるいは DMSO) 1mL を混合 37, 終夜攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 超純水で 2 回洗浄 (iv) 弊社フ ロッキンク 溶液 (1mL) を投入し活性基を不活性化 室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi) 超純水で数回洗浄 - 26 -
DNA ハイブリダイゼーション反応 プロトコル (i) 1μ M Biotin-dA30mer(100uL) のハイブリ溶液と dt30mer 固定化ビーズ 10mg を混合する (ii) 30 分間室温で撹拌する (iii) 0.05%PBS 溶液 250μ L で 3 回洗浄する (iv) 5μ g/ml の HRP 標識アビジン溶液を 100μ L ずつ分注する (v) 30 分間室温で撹拌する (vi) 0.05%PBS 溶液 250μ L で 3 回洗浄する (vii) ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いて ビーズに捕捉された HRP 標識ストレプトアビジンの固定化量を 450nm の吸光度により測定 - 27 -
アフィニティビーズ製品一覧表 キット内容 アフィニティヒ ース 本体 タンパク固定化用緩衝液 不活性化用緩衝液 プロトコル 10mm 品番品名希望小売価格 ( 税別 ) BS-X9905 アフィニティビーズ 50mg ( お試し用 ) 9,000 円 BS-X9908 アフィニティビーズ 500mg 85,000 円 - 28 -
ご不明な点 ご要望などございましたら 何なりとお問い合わせ下さい お問い合わせ先 住友ベークライト株式会社 S-バイオ事業部 マーケティング 営業部 担当 : 五十嵐 E-mail : s-bio@sumibe.co.jp TEL : 03-5462-4831-29 -