H29 年度レギュラトリーサイエンス研究成果報告会 節足動物媒介性感染症の監視 予察技術の高度化 ( 国研 ) 農研機構動物衛生研究部門越境性感染症研究領域暖地疾病防除ユニット 梁瀬徹
節足動物媒介性感染症 昆虫やダニなどの ( 主に吸血性の ) 節足動物が媒介する感染症の総称 細菌 Q 熱 ツツガムシ病 日本紅斑熱 原虫マラリア リューシュマニア トリパノソーマ症 糸状虫フィラリア症 ( オンコセルカ 象皮症 ) ウイルスデング熱 ジカウイルス 日本脳炎 重症熱性血小板減少症候群 (SFTS) アルボウイルスの感染が原因
アルボウイルスとは Arthropod-borne (Arbo-) virus 節足動物媒介ウイルス 脊椎動物および節足動物 ( 蚊, ヌカカ, ダニ ) 中で増殖し, 節足動物によって媒介されるウイルスの総称 ブニャウイルス レオウイルス ラブドウイルス フラビウイルス トガウイルス アスファウイルスといった異なる分類群の 500 以上のウイルスを含む
OIE * のリストに記載されているアルボウイルス感染症 *OIE: 国際獣疫事務局 ブルータング クリミアコンゴ出血熱 流行性出血病 (EHD) リフトバレー熱 日本脳炎 ウエストナイル熱 東部馬脳炎 西部馬脳炎 ベネズエラ馬脳炎 アフリカ馬疫 ナイロビ羊病 アフリカ豚コレラ 12 疾病が OIE のリストに記載
国内で流行が確認されている牛のアルボウイルス感染症 ( 監視伝染病 ) アカバネ病 アイノウイルス感染症 チュウザン病 イバラキ病 ブルータング 牛流行熱 日本脳炎 ( 法定 ) ヌカカ媒介性 蚊媒介性
アカバネ病病因 : アカバネウイルス ブニャウイルス科 オルソブニャウイルス属 ( シンブ血清群 ) 発症動物 : 牛, 水牛, めん羊, 山羊 症状 : 異常産妊娠畜 ; 流早死産, 先天異常子の分娩異常子牛 ; 体形異常 起立困難 生後感染 起立不能 神経症状 病理所見 : 関節彎曲 水無脳症 ( 先天異常子 ) 脳脊髄炎 ( 生後感染 ) *1972-75 年には約 4 万頭の異常産
背景 1 国内ではアルボウイルス感染症の流行が継続している 監視対象 : アカバネ病 アイノウイルス感染症 チュウザン病 牛流行熱 イバラキ病 ブルータング 異常産の発生は 肉用牛繁殖農家や酪農家に大きな経済的損失を与える 肥育素牛価格の高騰 国内で新しいアルボウイルスが分離され 家畜の疾病との関係が疑われる サシュペリ シャモンダ ピートン ディアギュラウイルスなど 高緯度地域で 新興 再興アルボウイルス感染症の流行が続発 欧州における ブルータング シュマレンベルクウイルス 地球温暖化 人的交流 物資の流通のグローバル化 アルボウイルス感染症の家畜衛生分野での重要度は高まっている!
アルボウイルス感染症対策を進めるためには 疫学解析 外部要因 環境 ( 生息場所 ) 地理 ( 分布 移動能力 ) 脊椎動物宿主 気象 ( 活動温度帯, 越冬 ) アルボウイルス 媒介節足動物 人類の活動による 環境の改変 人および物資の大量輸送 地球規模での気候変動,
課題の計画と目標 Ⅰ. 媒介節足動物 遺伝子マーカーを利用したヌカカの海外飛来の検証 蚊 の媒介リスクの検証 Ⅱ. 診断法の開発 変異 / 新型ウイルスに対応できる診断法の開発 牛のアルボウイルス検査マニュアルの作成 Ⅲ. 流行要因の解明 発生データや気象データを用いたアルボウイルス感染症の解析 効果的な監視 予察システムの提案へ
Ⅰ. 媒介節足動物 遺伝子マーカーを利用したヌカカの海外飛来の検証 蚊 の媒介リスクの検証 ヌカカ ( 糠蚊 )
由来地域によるヌカカの遺伝子差異の検証 仮 説 : アルボウイルスは 感染したヌカカとともに気流に乗って国内に侵入する 国内のヌカカの個体群の中にも 近隣の地域の個体群と同じ遺伝子を持つものがいるはず!! 対象種 : ウシヌカカ Culicoides oxystoma 主要なアルボウイルス媒介種 アジア アフリカ オセアニアに広く分布 サンプル :248 個体 (11 ヶ国 1 地域 ) 日本 中国 韓国 台湾 ベトナム フィリピン ラオス カンボジア タイ インドネシア オーストラリア イスラエル 方 法 : ミトコンドリアゲノム上の 1948 塩基 * を PCR で増幅後ダイレクトシーケンス 最尤法によって分子系統樹解析を実施 国内の集団が遺伝学的に東アジアやベトナム北部 フィリピンの集団と高い相関があ ることが判明 継続的な流入を強く示唆 南西諸島の個体群では 東南アジアとの関連性を推察
アカバネウイルスの蚊からの分離 (Oya et al., 1961) 1.1959 年 関東北部でキンイロヤブカおよびコガタアカイエカからアカバネウイルスを分離 2. 家畜舎の壁に止まった蚊 ( おそらく吸血後に休息中 ) を吸虫管もしくは真空ポンプで採集 3. 飼育無し もしくは一晩飼育して ドライアイスボックスで保存後 ウイルス分離に供試 ( 蚊の中腸内に残っている動物の血液中のウイルスを分離した可能性 ) アカバネウイルスはヌカカによって媒介される! 1. 野外で採集した Culicoides 属のヌカカから 多くのウイルス株が分離 ( 血液は消化されており ウイルスは体腔内で増殖?) 2. ウイルスがヌカカの体内で増えることを 感染実験により証明 獣医学の教科書やマニュアルには 両者が媒介すると記述!! 蚊とヌカカは 全く異なる生態学的特徴を持つ ( 移動距離 発生源 活動期間等 ) 流行リスクを正確に把握するためには 媒介者をはっきりさせる必要がある
蚊によるアルボウイルス媒介能の検証 対象種 : コガタアカイエカ ( 牛舎における優占種のひとつ ) 方法 : 1 野外で採集した吸血蚊から卵を採取 孵化させ 実験室内で飼育して蚊の雌成虫を得る 2 ウイルス液を胸部にマイクロインジェクション もしくはウイルス混和血液を用いた人工吸血法により経口摂取させる 3 インキュベーター (25 ) で 約 2 週間飼育 4 ウイルス特異的プライマーを用いた RT-PCR 法で ウイルスを検出 マイクロインジェクション 接種後 約 2 週間飼育 蚊類の飼育 人工吸血法 ウイルスの検出
アカバネウイルスの接種試験 マイクロインジェクション 14 日後 経口摂取 ( 人工吸血法 ) 14 日後 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 P N 4.4X10 6 copies 4.4X10 4 copies P: 陽性対照 (OBE-1 株 ),N: 陰性対照 (D.W.),M:100bp ラダーマーカー マイクロインジェクションにより 全個体で陽性 ウイルスは体腔内で増殖可能 経口接種個体では 10 個体中 2 個体で陽性 中腸細胞にウイルスが感染可能 コガタアカイエカがアカバネウイルスを伝播する可能性!?
だ液および脚からのアカバネウイルス遺伝子の検出 だ液 後脚 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P N M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P N M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 P N M M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 P N M P: 陽性対照 (OBE-1 株 ),N: 陰性対照 (D.W.),M:100bp ラダーマーカー 感染したコガタアカイエカでは 一部の個体のだ液からウイルス遺伝子を検出 媒介が可能?
アルボウイルス媒介能を獲得までの様々な障壁 脊椎動物宿主に対する親和性 ( 吸血嗜好性 ) X だ液腺 この部分を証明 Yes 中腸細胞への感染 Yes 体腔への侵入 Yes 体腔での増殖 拡散 Yes だ液腺への移行 Yes 感染の成立 ( 再吸血時 ) No No No No Yes No X X X X 卵巣への感染 Yes 経卵感染の成立 中腸 No X 卵巣
Ⅱ. 診断法の開発 変異 / 新型ウイルスに対応できる診断法の開発 牛のアルボウイルス検査マニュアルの作成
各種アルボウイルス感染症の診断法の標準化 ( 検査マニュアルの作成 ) これまでの状況 個別の監視伝染病については病性鑑定マニュアルに検査の概要が記載されている しかし アルボウイルス全般に関する検査技術のレベルには診断施設間で差があり 標準化が必要 対応 診断に係る情報を総合したアルボウイルス検査マニュアルを作成して公開することにより 検査技術の標準化を図る
牛のアルボウイルス検査マニュアル 内容 1. 本マニュアルの位置付け 2. 検査材料の採取 処理 保管 輸送の際の温度管理 3. 検査に用いる試薬および培養細胞 4. 細胞の取り扱い 5. ウイルス分離 ( 回転培養法 ) 6. ウイルスの接種および回収 7. ウイルス力価の測定 ( タイトレーション ) 8. 中和試験 9. 核酸抽出および RT-PCR 法 10. リアルタイム RT-PCR 法 11. 検査結果の解釈について 12. 参考文献
マニュアル上の記載内容 ( 血液の採取 処理 保存 ) 手順の詳細を示し 作業者がイメージしやすいように写真を多く添付
今後の予定と運用について 公表前 内容および表現の向上 ( 病性鑑定担当者等の意見を頂いて適宜修正する ) 公表のための手続き ( 農水省および他の関係機関との協議 ) ウェブサイト等で公表 公表後 必要に応じて 内容の更新を行う ( プライマーの配列や PCR 条件の変更 検査手技の変更等を想定 )
Ⅲ. 流行要因の解明 発生データや気象データを用いたアルボウイルス感染症の解析 海外からのヌカカの飛来による伝播の可能性の探索 国内での地域内流行に与える要因ついて解析 活用するデータ 1. 疾病に関するデータ おとり牛の抗体調査 流行データ 2. 地域の環境に関するデータ 家畜の飼養密度 地形や土地利用データ ヌカカの調査データ 主な解析手法 1. 空間統計解析 地域内の伝播要因の解析 国内への侵入リスク要因の解析 2. 流跡線解析 空気の流れの分析 ( 気象モデル ) 3. 気象に関するデータ 気温 降水量 風
沖縄県八重山地域で発生した牛流行熱の疫学解析 八重山地域における牛流行熱 2012 年 9 月 8 年ぶりに確認疑い事例 225 戸 西表島 初発 9/10~ 石垣島 離島間の伝播 気象モデルを用いた分析の結果 離島間の伝播には 石垣島からの関与が示唆された 9 月 10, 11, 13 の流跡線 地点 1 9/10~ 9/15~ 9/18~ 9/15~ 小浜島 9/16~ 9/15~ 地点 2 9/16~ 9/26~ 9/26~ 黒島 9/26~ 気象モテ ル METEX 前方流跡線解析 9 月 19,25 の流跡線 地域内伝播の地理的要因 媒介昆虫の飛来源の推定 発生率の推定値 (1km メッシュ ) 空間統計解析の結果 農用地や水田の割合が高い場所 傾斜角度が大きい場所は 1km メッシュ当りの発生率が高かった CAR model によるロシ スティック回帰分析 説明変数 median (95% CI) 農用地 _ 割合 0.47 (0.21, 0.74) 田 _ 割合 0.20 (-0.085, 0.48) 最小傾斜角度 0.29 (0.027, 0.54) 8 月 28 日 8 月 31 日 8 月 29 日 9 月 1 日 8 月 30 日 気象モテ ル HYSPLIT 後方流跡線解析 媒介昆虫の飛来源は東南アジアである可能性が高い 侵入時期は 8 月下旬の可能性が高い
沖縄県におけるアカバネ病の抗体陽転と気象要因に関する分析 2007~2015 年に沖縄県で実施したアカバネ病の抗体調査データを用いて 抗体陽転に関連する気象的要因を探索する 2010 年の抗体陽転状況 本島周辺 冬の気温が高いこと 冬 春 秋の降水量が多いことは 沖縄県でのアカバネ病の抗体陽転と関連していた 粟国 久米島 宮古 八重山 慶良間諸島 気象要因区分オッズ比 (95% CI) P-value 沖縄本島 最高気温 (1-3 月 ) 25.5 1.00 > 25.5 4.19 (0.93-19.97) 0.062 降水量 (1-3 月 ) 124 mm 1.00 > 124 mm 5.64 (1.10-43.23) 0.054 与那国島 西表島 石垣島 多良間島 宮古島 降水量 (4-6 月 ) 306 mm 1.00 > 306 mm 25.41 (4.23-242.63) 0.001 降水量 (10-12 月 ) 171 mm 1.00 > 171 mm 9.06 (1.55-76.26) 0.023 八重山 平均気温 (1-3 月 ) 20.0 1.00 > 20.0 4.13 (0.84-22.51) 0.078
成果の活用 気象 地理的要因ならびに媒介節足動物の生態を考慮したおとり牛の効率的な配置 海外からのアルボウイルスの侵入経路の推定および気流との関係の解明 ウイルスの検出感度の向上と手法の簡便化 診断マニュアルの作成 アルボウイルス感染症に対する効果的かつ効率的な発生予察 監視システムの提案 アルボウイルス感染症による畜産業への被害の低減