基礎から学ぶ 固相抽出 (SPE) カラムの基礎とあなたの日々の作業に役立つ弊社独自のノウハウを伝授 シグマアルドリッチジャパン合同会社ライフサイエンスアプライド事業部アナリティカルテスティング営業部佐々木豊 JASIS2017 新技術説明会 A-8 2017 年 9 月 8 日 ( 金 ) 12:15~13:05
本日の内容 固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的 特長 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性 チャネリングの予防 充填剤間 フリッツの気泡除去 充填剤の活性化 固相抽出カラムの使用方法 様々なカラム形状 サンプルマトリクスからの充填剤選択 各充填剤の選択と使用方法 分散型固相抽出について 自然落下を快適に行うテクニック 通液速度と回収率の関係 様々な溶出方法 ディスポーサブルライナーの活用
1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的 特長 液液抽出 有機溶媒を大量に使用操作が煩雑で時間がかかる固相抽出 簡単 迅速に前処理 マトリクス 目的物質 膨大な量のマトリクスに含まれる 微量な分析対象物を測定するため機器分析の前に 前処理 という工程が必要 3
1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的 特長 マトリクス 目的物質 マトリクス ( 妨害物質 ) を除去し精製する マトリクスを保持させ除去する 4
1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的 特長 マトリクス 目的物質 分析に適した濃度に濃縮する 目的物質を保持させ溶出する 5
1. 固相抽出とは? 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 化学構造分子量 目的物質 疎水性 親水性イオン性配位性 充填剤の種類充填剤量 充填剤 溶媒 有機溶媒組成バッファー ph 6
1. 固相抽出とは? 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 目的物質の極性高い ( 親水性 ) 低い ( 疎水性 ) 充填剤の適用範囲と使用する溶媒カーボン系充填剤 < 保持が強く溶出が困難 > 水 メタノール アセトニトリル アセトン トルエン ヘキサン C18 C8 系充填剤水 メタノール アセトニトリルポリマー系充填剤水 メタノール アセトニトリル 7 イオン交換系充填剤水溶液 ( バッファー ) シリカゲル充填剤ヘキサン ジクロロメタン
本日の内容 固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的 特長 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性 チャネリングの予防 充填剤間 フリッツの気泡除去 充填剤の活性化 固相抽出カラムの使用方法 様々なカラム形状 サンプルマトリクスからの充填剤選択 各充填剤の選択と使用方法 分散型固相抽出について 自然落下を快適に行うテクニック 通液速度と回収率の関係 様々な溶出方法 ディスポーサブルライナーの活用
2. 固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状 シリンジ型 リバーシブル型 96well プレート ディスク型 最も汎用な形状 カラムがサンプルや溶媒のリザーバーになり 操作が簡単 通液方向とは逆方向から溶出が可能 複数のカートリッジの連結が容易 96サンプルを迅速処理 自動化システムに対応 大容量サンプルに対し迅速処理が可能 ポリプロピレン製とガラス製を用意
2. 固相抽出カラムの使用方法サンプルマトリクスからの充填剤選択 サンプルマトリクス サンプルは何に溶解しているか? 水溶液 有機溶媒 非 ~ 中極性 化合物 イオン性化合物 中 ~ 高極性 化合物 吸着逆相アニオンカチオン 順相 吸着 10 C18 C8 Phenyl ST/DVB Poly Amide HLB ENVI TM -Carb Carboxen ST/DVB NH 2 PSA SAX SCX WCX MCAX CN NH 2 PSA Si DIOL Florisil Alumina ENVI-Carb Carboxen ST/DVB
2. 固相抽出カラムの使用方法 C18, C8, Phenyl, HLB など ( 逆相モード ) 1 サンプル調製 2 コンディショニング 3 サンプルロード 水溶液 バッファー溶液で調製 ( 有機溶媒を 10% 以下にする ) 酸性化合物は ph3~4 中性化合物は ph6~7 塩基性化合物は ph7~9 に調整 粘性のあるサンプルは 1:1 か 1:2 の割合でバッファー溶液で希釈 再現性や回収率に関わる重要な作業 この後 詳しく メタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒をカラムサイズの 1~2 倍量を通液 サンプル溶液が水の場合は 溶媒通液後に水を通液させる 通液速度を 1 秒間に 1 2 滴の一定速度に保つ 4 洗浄 5 溶出 5~20% の溶媒やバッファー溶液 通液速度は 液滴がつながらない程度 メタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒 カラムサイズの1~2 倍量を 1 秒間に1,2 滴の速度で通液 イオン性化合物の場合 ph 調整で回収率が改善
2. 固相抽出カラムの使用方法シリカゲル, フロリジル, アルミナなど ( 順相モード ) 1 サンプル調製 2 コンディショニング 非極性溶媒 ( ヘキサン ジクロロメタンなど ) で抽出 希釈 サンプル溶液中に水分が残存すると保持が弱くなるため 硫酸 Na や硫酸 Mg で乾燥させる サンプルと同じ溶媒 もしくは非極性溶媒をカラムサイズの 2~3 倍量を通液 固相カラムに付着した水分も影響 この後 詳しく! 3 サンプルロード 通液速度を 1 秒間に 1 2 滴の一定速度に保つ 4 洗浄 5 溶出 サンプルと同じ溶媒 もしくは非極性溶媒 通液速度は 液滴がつながらない程度 アセトン メタノール IPA アセトニトリルのような溶媒 カラムサイズの1~2 倍量を通液 分画を取る時は 徐々に溶媒の極性を高めていく
2. 固相抽出カラムの使用方法 SAX, NH2, SCX, WCX など ( イオン交換モード ) 1 サンプル調製 サンプル溶液をバッファー溶液で 1:1 に希釈し 目的物質がイオン化するよう ph を調整 塩基性化合物は ph3~6 のバッファー溶液を 10~25mM 用いる 酸性化合物は ph7~9 のバッファー溶液を 10~50mM 用いる 2コンディショニング 3サンプルロード 4 洗浄 5 溶出 メタノールやアセトニトリルをカラムサイズの 1~2 倍量通液 サンプル調製で用いたバッファー溶液と同一の ph と塩濃度を持つバッファー溶液で充填剤固定相をイオン化させる 通液速度を 1 秒間に 1 滴以下の一定速度に保つ サンプル調製で使用したような ph を持つバッファー溶液通液 メタノール アセトニトリル水溶液 通液速度は 液滴がつながらない程度 塩基性化合物は 2~5% 水酸化アンモニウム /50~100% メタノール溶液 酸性化合物は 2~5% 酢酸 /50~100% メタノール溶液 強イオン性化合物は 1M 以上の高塩濃度溶液または より選択性の高い対イオンの投入
2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について QuEChERS( キャッチャーズ ) とは? 抽出用の塩類や精製用の充填剤をサンプルと共に振盪し 遠心分離する前処理方法 Quick 迅速 : 前処理に必要な時間は約 10 分 Easy 簡単 : 複雑な操作なし Cheap 安価 : 高額な機器は不要 使用する消耗品はいずれも安価 Effective 効果的 : サンプル量が少量で使用可能 Rugged 堅牢 : 多検体ルーチン分析を行うのに 十分な方法 Safe 安全 : 有害な化学物質や塩素系溶媒は不使用 1サンプルの溶媒の使用量は 約 10~12mL と少量なため安全 14
2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析抽出工程 サンプルを凍らせドライアイスと共にホモジナイズしたものを 秤量しアセトニトリルを添加 振盪する 抽出用塩類の充填剤を加えて振盪し 遠心分離をする 15
2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析精製工程 遠心分離後 上澄みを分取し精製用充填剤を加え振盪する 遠心分離後 上澄みを分取し試験溶液に調製する 16
2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について製品ラインアップ 17
本日の内容 固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的 特長 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性 チャネリングの予防 充填剤間 フリッツの気泡除去 充填剤の活性化 固相抽出カラムの使用方法 様々なカラム形状 サンプルマトリクスからの充填剤選択 各充填剤の選択と使用方法 分散型固相抽出について 自然落下を快適に行うテクニック 通液速度と回収率の関係 様々な溶出方法 ディスポーサブルライナーの活用
3. コンディショニングの目的コンディショニングの重要性 固相抽出カラムの性能を最大限に発揮するには? コンディショニングをしっかりと行うことが大切 カラムの洗浄チャネリングの予防充填剤間 フリッツの気泡を抜く充填剤 ( 順相系 ) の活性化 ブランク低減充填剤と溶媒をしっかり接触させる通液速度の安定化保持挙動の安定化 19
3. コンディショニングの目的チャネリングの予防 使用した固相抽出カラム :C18 1g/6mL 左 : コンディショニング無し右 : アセトニトリル 5mL 水 5mL 2 回でコンディショニング サンプル : アズレンスルホン酸ナトリウム水溶液 40mg/mL を 2 滴 ( うがい薬 ) を添加 チャネリング コンデイショニング無し コンデイショニング有り 洗浄 : 水 5mL サンプルが均一なバンドを形成しないと 適切なクロマトグラフィーが行えない 20
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 カーボン系の固相抽出カラムにヘキサンを流した 通液速度 0.9mL/min 気泡が存在したので除去した 通液速度 2.3mL/min 気泡の存在で通液速度が大幅に異なった この実験ではカラム出口付近に気泡があったため除去できたが 充填剤間やフリッツ中の気泡に対してどう対処するか? 気泡 気泡の除去により 通液速度は約 2.5 倍に上昇 21
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 気泡を除去して 通液速度を安定化させる 固相抽出カラムごとの通液速度のバラツキを無くす 充填剤と溶媒 サンプルの接触効率を向上させ 負荷量を最大化する ユニークな気泡の除去方法をご紹介します バキュームマニホールドが使用できる環境をご用意ください 22
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 1 必要な本数の固相抽出カラムをバキュームマニホールドの付属ラックにセットする 2 コンディショニング溶媒を固相抽出カラムに入れる 23
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 3 付属ラックごと真空槽に入れる 4 減圧する 24
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 5 減圧するおよそ 30 秒 ~1 分間 細かい気泡が上昇 下部からも気泡が抜ける 充填剤とフリッツ中の気泡が ほぼ完全に除去できる 25
3. コンディショニングの目的充填剤間 フリッツの気泡除去 各コンディショニング方法による比較使用した固相抽出カラム :C18 1g/6mL 5mL アセトニトリルを用い 3 つの方法でコンディショニングした後 5mL アセトニトリルを自然落下で通液させその時間を測定 A B C 26 自然落下による通液速度比較 アセトニトリル 5mL 通液時間 コンディショニング方法 Tube#1 Tube#2 A: マニホールド気泡除去 4m19s 4m17s B: 吸引法 3m51s 5m02s C: 加圧法 4m47s 5m06s 均一である ばらつきがある
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 使用した固相抽出カラム : シリカゲル 1g/6mL( 同一ロットで保管条件が異なる 2 本を比較 ) ヘキサン 3mL ヘキサン 3mL 追加 コンディショニング : n- ヘキサン 3mL サンプル : 200µL アズレン 2mg/mL ヘキサン溶液 溶出 :n- ヘキサン 3mL 2 回 順相系充填剤では 活性度の違いが保持挙動に表れやすい 27
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 一般的な順相系固相抽出のコンディショニング ヘキサン 水 順相系充填剤はヘキサンを通液させても 水分は残存し活性度は上がらない 28
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 順相系固相抽出カラム ( シリカ アルミナ フロリジルなど ) の活性度を高く一定にするには? 従来法充填剤を 130 のオーブンで一晩乾燥させる カートリッジ充填されているカラムは 加熱不可能 充填剤のみを乾燥させて 使用前にカートリッジへ充填する 代替案アセトン通液後 ヘキサンで平衡化する 第 21 回農薬残留分析研究会 1998 年シリカゲルカラムの前処理効果 ( 財団法人残留農薬研究所 杉本 島村 小林 加藤 ) でも 一定した活性度と固相抽出由来の妨害物質の低減化が可能との報告あり 29
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 改良した順相系固相抽出のコンディショニング アセトン ヘキサン 水 アセトンで水を除去することで活性度を高く一定にする 30
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 アセトン洗浄によるカラム中の水分除去 水分測定アセトンを流し溶出液を分画捕集した溶出液中の水分量を Karl Fisher 水分測定装置 ( 電量法 ) で測定 Mositure Content (ppm) in eluate 100,000 90,000 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 Ag ION 750mg/6mL Alumina N 2g/6mL DSC-NH2 1g/6mL DSC-SAX 1g/6mL DSC-SCX 1g/6mL PSA 1g/6mL LC-Florisil/LC-Si = 1g/1g/6mL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Acetone Volume (ml) 31
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 アセトンからヘキサンへの平衡化 アセトン - ヘキサン平衡化アセトン洗浄後ヘキサンを流し その溶出液を分画捕集した溶出液中のアセトン含有量を HPLC-UV で測定 900,000 Peak area of acetone in eluate 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 Ag ION 750mg/6mL Alumina N 2g/6mL DSC-NH2 1g/6mL DSC-SAX 1g/6mL DSC-SCX 1g/6mL PSA 1g/6mL 100,000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 32 Hexane Voume (ml)
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 使用した固相抽出カラム :Alumina N 1g/6mL PCB 異性体 20 成分を分画 Tube#1 と Tube#2 は 同一ロットで保管状況が異なる Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% Oil #155 #188 #202 #209 #208 #206 #194 #189 #104 #30 #54 #10 #1 Biphenyl #3 #169 #126 #77 #37 #15 Tube#1 ヘキサンコンディショニングのみ Elution % 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% Supelclean LC-Alumina-N 1g/6mL without acetone washing #208 #206 #188 #30 #194 #155 #202 #209 #189 #104 Biphenyl #1 #3 #10 #15 #169 #37 #54 #126 #77 Tube#2 ヘキサンコンディショニングのみ 10% 10% 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hexane Acetone Elution Volume (ml) 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hexane Acetone Elution Volume (ml) 同一ロットだが保管状況により活性が変わったため 保持挙動にも影響した 33
3. コンディショニングの目的充填剤の活性化 使用した固相抽出カラム :Alumina N 1g/6mL PCB 異性体 20 成分を分画 Tube#3 は アセトン - ヘキサンコンディショニングを行った Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Oil #155 #188 #202 #209 #208 #206 #194 #189 #104 #30 #54 #10 #1 Biphenyl #3 #169 #77 #37 Tube#1 ヘキサンコンディショニングのみ Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Oil #209 #188 #202 #30 #155 #189 #208 #194 #104 #206 #1 # 10 #54 Biphenyl #169 # 15 #77 コンディショニング #37 #126 Tube#3 アセトン - ヘキサン 20% #126 #15 20% #3 10% 10% 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hexane Acetone Elution Volume (ml) 0% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hexane Acetone Elution Volume (ml) 水分除去により活性が上がるため 保持は強くなる傾向にある 34
本日の内容 固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的 特長 目的物質 充填剤 溶媒の三角関係 コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性 チャネリングの予防 充填剤間 フリッツの気泡除去 充填剤の活性化 固相抽出カラムの使用方法 様々なカラム形状 サンプルマトリクスからの充填剤選択 各充填剤の選択と使用方法 分散型固相抽出について 自然落下を快適に行うテクニック 通液速度と回収率の関係 様々な溶出方法 ディスポーサブルライナーの活用
4. 自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係 回収率 90% 以上 Journal of Chromatography, 622 (1993) 53-60 通液速度は 1~2mL/min( 約 1~2 滴 / 秒 ) 程度が最適である 36
4. 自然落下を快適に行うテクニック様々な溶出方法 減圧吸引 迅速に作業できるが 液枯れの恐れあり 液面監視が必要なため 多検体処理は困難 加圧方式 この 3 つの中では最もデメリットが少ない 加圧させる専用器具が必要 多検体処理は困難 自然落下 最も簡便な方法で 多検体処理も可能 気泡の影響により 通液速度が安定しない マニホールドを使用した気泡除去で解決 溶出に時間がかかる ディスポーサブルライナーの使用で解決 37
4. 自然落下を快適に行うテクニックディスポーサブルライナーの活用 マニホールドを使用した気泡除去後は 固相カラム毎の通液速度が均一になっている 気泡除去後は 自然落下での溶出において充填剤部の液枯れの心配がなく作業が容易 さらに ディスポーザブルライナーの接続で通液速度をアップさせる 製品型番 :57059 ディスポーザブルライナー 38
4. 自然落下を快適に行うテクニックディスポーザブルライナーの活用 使用した固相抽出カラム :Supelclean Sulfoxide 3g/6mL ディスポーザブルライナーの長さと自然落下での通液速度 ディスポーザブルライナー :8cm の接続で 通液速度は約 2 倍になったこのライナーの長さに比例して通液速度が変化するため 調整も可能 39
固相抽出カラム製品ラインアップ Discovery シリーズ シリカゲル基材のラインアップ Lot 間のバラツキを最小にする為 厳重な品質管理を行っており 製品には充填剤物性の証明書付き 逆相 :C18 C8 Phenyl CN 順相 :Si Diol NH 2 イオン交換 :SAX SCX WCX MCAX Supel TM -Select シリーズ ポリマー基材のラインアップシリカゲルではないため 残存シラノールの影響や不純物金属の影響を受けないため 高い回収率が得られます 逆相 :HLB イオン交換 :SAX SCX WCX MCAX 40
固相抽出カラム製品ラインアップ 使用目的別の固相抽出カラム HybridSPE -Phospholipid リン脂質除去用 Z-Sep 脂質除去用 SupelMIP 分子構造認識ポリマー Ag-ION 脂肪酸メチルエステル分画用 Supel -Tox マイコトキシン専用多機能カラム 41 Sulfoxide トランス油中の PCBs 用 EZ-POP NP 油中の PAHs 用
ありがとうございました 固相抽出カラム ディスポーサブルライナーはサンプルのご用意がございます ブースにお越しいただくか 後日お気軽にお申し付け下さい Web サイトからもご請求いただけます sigma.com/spe-jp お問い合わせは シグマアルドリッチジャパンテクニカルサポート TEL 03-6756-8245 E-Mail: sialjpts@sial.com 42
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