Major Histocompatibility Complex 2013; 20 (2): 121 129 平成 25 年度認定 HLA 検査技術者講習会テキスト HLA 1) 1) HLA HLA HLA PRA Panel reactive antibody DSA Donor specific alloantibody class subclass non-hla HLA キーワード :Human leucocyte antigen (HLA) Donor specific alloantibody (DSA) Panel reactive antibody (PRA) 1. はじめに Donor Recipient Graft HLA HLA HLA HLA HLA-Class1 DSA DSA HLA DSA HLA 2.HLA 抗体検査に使用する HLA 抗原の種類について HLA 1 T B 2 HLA 3 HLA 1) ドナーリンパ球 (T 細胞 B 細胞 ) 1 6 15 mm T HLA Class I HLA Class II T HLA Class II B HLA Class I Class II T HLA Class I 2) 抽出 HLA 抗原 HLA HLA Class I Class II Flow- PRA Screening Flow-PRA Specific LABScreen Mixed 3) 精製 HLA 分子 HLA HLA HLA Flow- PRA Single Antigen LABScreen Single Antigen 2013 7 11 2013 7 11 162 8666 8 1 TEL: 03 3353 8111 FAX: 03 5269 7534 E-mail: ishizuka.tsutomu@twmu.ac.jp 121
MHC 2013; 20 (2) HLA 4. ドナーリンパ球を用いたクロスマッチ検査について 図 1 B 3.HLA 抗体検査に使用するドナーリンパ球 (T 細胞 B 細胞 ) の分離法について T B 150 nm 2 HLA 37 C 30 HLA in vitro 1 LCT-XM Lymphocyte cytotoxicitycrossmatch test =CDC Complement-dependent cytotoxicity - XM 2 AHG-LCT-XM Anti-human immunoglobulin LCT-XM 3 FCXM-IgG Flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg test 1)LCT-XM HLA 3 LCT-XM HLA 1994 -HLA 1 T B 2,000 / 1 μl 1 μl 1 37 C 60 2 25 C 120 % ASHI Laboratory Manual 4th Edition 1 20 25 C 30 2 20 25 C 60 図 2 T 99.47% B 99.51% 122
HLA MHC 2013; 20 (2) 図 3 LCT-XM HLA Fc 2 図 4 AHG LCT-XM AHG anti-human immunoglobulin HLA L-chain IgG allotype IgM DTT dithiothreitol 2ME 2-mercaptoethanol IgM IgG subclass IgG1 65% IgG2 25% IgG3 7% IgG4 3% IgG1 IgG3 IgG2 IgG4 IgG4 HLA Fc 2 IgG 2 2 IgM 1 10 2)AHG-LCT-XM LCT-XM AHG anti-human immunoglobulin L-chain Type κ L-chain Type λ 4 AHG LCT-XM 1970 ASHI Laboratory Manual 4th Edition L-chain Type λ 1 4 C 20 25 C 37 C 30 60 2 20 25 C 60 90 IgG L-chain Type κ Type λ 2 Fcγ FcγRII CD32 FcγRIII CD16 L-chain Type κ Type λ 2 IgG AHG IgG L-chain 3)FCXM-IgG 200,000 /100 µl 100 µl 25 C 30 Goat F(ab') 2 anti-human IgG-FITC fluorescein isothiocyanate CD19-PE Phycoerythrin CD3-PerCP Peridinin Chlorophyll Protein Complex 4 C 30 3 123
MHC 2013; 20 (2) 臓器移植における HLA 抗体検査について 図5 FCXM-IgG の模式図および解析結果 ドナーリンパ球をプロテアーゼ処理した 3 カラー解析結果である 図6 protease 処理による Fcg レセプター FcgRII CD32 FcgRIII CD16 発現量の比較 B 細胞の Fcg レセプター FcgRII CD32 については発現を抑制することは難しいが IgG に対しては低親和性レセプターである により補体結合性 補体非結合性 IgG 抗体の両方を検出 することにより非特異的反応をある程度抑制することが できる検査法である 図 5 可能である しかし B 細胞の Fcg レセプター FcgRII ASHI Laboratory Manual 4th Edition では ドナーリ CD32 については発現を抑制することは難しいが IgG ンパ球 500,000 個 /30 µl と被検血清 30 µl を使用する に対しては低親和性レセプターである 図 6 マニュアルである しかし LCT-XM で使用するドナー B 細胞の FCXM-IgG 陰性コントロールは anti-human リンパ球と被検血清の割合とはかけ離れている IgG に対して通常 2 つの母集団として反応性を示すが ドナーリンパ球をプロテアーゼ protease type XIV 処理 この 2 つの母集団は主に B 細胞の分化によりナイーブ 124
HLA MHC 2013; 20 (2) 図 7 B B B CD19 anti-human IgG B CD19 B CD27 anti-human IgD B B B IgM IgD B IgG IgA IgE IgM B 7 B CD19 anti-human IgG B CD19 B CD27 anti-human IgD anti-human IgG + CD19 + 20.16% anti-human IgD CD27 + 21.39% anti-human IgG B B IgG B B IgD + CD27 60% B IgD + CD27 + 10% IgD CD27 + 30% HLA Class B B HLA Class B B B B DSA B 2 F(ab') 2 anti-human IgG Fc Fc NK B Fc 2 L-chain IgM IgA MESF Molecules of equivalent soluble fluorochrome 8 5. リンパ球クロスマッチ検査に影響を与える薬剤について 1 Rituximab 2 Thymoglobulin Rituximab FCXM-IgG 1)Rituximab( 抗ヒト CD20 ヒト マウスキメラ抗体 ) CD20 Pro-B B B 2)Thymoglobulin( 抗ヒト胸腺細胞ウサギ免疫グロブリン ) Thymoglobulin T CD2 CD3 125
MHC 2013; 20 (2) HLA 図 8 MESF Molecules of equivalent soluble fluorochrome CD4 CD5 CD7 CD8 CD25 TCRab CD11a 6. 抽出 HLA 抗原 精製 HLA 分子を用いた HLA 抗体検査について HLA HLA HLA 1 Flow-PRA Flow cytometry panel reactive antibody 2 Luminex 3 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 4 Cell tray 1)Flow-PRA Flow-PRA HLA HLA Screening Specific Single Antigen 3 HLA HLA 2 4 mm 25 C 30 Goat F(ab') 2 anti-human IgG- FITC 25 C 30 IgG anti-human IgG-FITC Flow-PRA Screening HLA Class I Class II 30 HLA Class I -unlabeled Class II -PE 2 anti-human IgG-FITC 3.3% 1 7% 2 HLA 2 HLA 9 Flow-PRA Specific HLA Class I Class II 1 1 HLA 8 FlowPRA Single Antigen HLA Class I Class II 1 HLA 8 2)Luminex 法 Luminex HLA HLA Mixed PRA Single Antigen 3 126
HLA MHC 2013; 20 (2) 図 9 Flow-PRA 2 HLA 2 図 10 Luminex NC beads 1 Trimmed Mean 100 PC beads 2 Trimmed Mean 10,000 Luminex APD Luminex 5.6 mm 100 suspension array technology HLA HLA 25 C 30 Goat F(ab ) 2 anti-human IgG-PE 25 C 30 Luminex IgG 10 anti-human IgG-PE NC beads 1 Trimmed Mean 100 PC beads 2 Trimmed Mean 10,000 PC beads IgG 2 anti-human IgG anti-human IgG Trimmed Mean 127
MHC 2013; 20 (2) LABScreen Mixed HLA Class I Class II 1 3 5 HLA LABScreen PRA HLA Class I Class II 1 1 HLA LABScreen Single Antigen HLA Class I Class II 1 HLA 3)ELISA HLA HLA Terasaki tray 25 C 30 Alkaline phosphatase anti-human IgG 25 C 30 IgG ELISA tray reader OD Optical density 100 mg/ml ATG Alkaline phosphatase anti-human IgG Antibody Diluent 10% LCT-XM 1 3 4)Cell tray Cell tray LCT-XM Class I T Class II B Terasaki tray 25 C 30 25 C 60 HLA 7. ドナー細胞上の HLA 抗原と合成ビーズを用いた HLA 抗体検査について ICFA Immunocomplex capture fluorescence analysis Luminex antigen capture HLA HLA HLA Class I Class II Goat anti-human IgG-PE Luminex IgG 8.HLA 抗体検査に影響を及ぼす被検血清中の非特異的反応処理方法について HLA HLA HLA 100,000G DTT Dithiothreitol 5 mm FBS Fetal Bovine Serum EDTA 50 mm Adsorb Out 参考文献 1) HLA 2004, 2007, 2008, 2011 http://jshi.umin.ac.jp/certification/ktext_ list.html 2) http://www.asas.or.jp/jst/pdf/info_20130115.pdf 3) 42: 1499 1504, 1984. 4) Complement-Dependent Cytotoxic Crossmatch Flow cytometric crossmatch HLA 48: 33 41, 2013. 5) ASHI Laboratory Manual, 4th Edition. 128
HLA MHC 2013; 20 (2) HLA Antibody Detection in Organ Transplantation Tsutomu Ishizuka 1) 1) Division of Transplant Immunology, Central Clinical Laboratories, Tokyo Women s Medical University Various methods have been proposed for the testing of HLA antibodies in organ transplantation. These methods include crossmatching using donor lymphocytes, and panel reactive antibody (PRA) tests using synthetic beads coated with purified HLA molecules or extracted HLA antigens. However, currently, depending on the testing method, the results can be difficult to determine due to differences in detection sensitivity, differences in the classes/subclasses of immunoglobulin composing the donor-specific alloantibodies (DSA), and instances where non-hla antibodies such as natural antibodies or autoantibodies react. In this lecture, I will introduce the testing and analysis methods that are routinely used for HLA antibody testing at our institution. Key Words: Human leucocyte antigen (HLA), Donor specific alloantibody (DSA), Panel reactive antibody (PRA) 2013 129