合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI MS の応用例 2. GPC/ API MS の応用例 27 Nihon Waters K.K. GPC/MALDI MS Matrixassisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は 複雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの 1 つであり bulk polymer の MS 分析に有用 応用分野 : (i) 平均分子量の測定 (ii) 末端官能基や繰返しユニットの測定 ( ユニットは重合体の性能の特性に重要 ) (iii) 生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター (iv)polymerisation 重合度の測定 27 Nihon Waters K.K. 2 1
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製 サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析 レーザーによる固相中でのイオン化 ソフトなイオン化 一般に 不揮発性高分子の(準) 分子イオン [MH] が最小のフラグ メンテーションで生成 o Proteins o Peptides o Oligonucleotides o Polysaccharides o Synthetic polymers 正 負双方のイオン化が可能 27 Nihon Waters K.K. 3 27 Nihon Waters K.K. 4 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) ショートレーザーパルス (12 ns) がターゲット に照射 窒素レーザーが一般的 337 nm 照射サイズ: ~11 mm レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され サンプ ルに穏やかに移行 ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが 直接 蒸発 イオン化 2
ポリマー分析における MALDI 法の制約 However, ダイナミックレンジ 高い多分散度がある重合体の正確な質量分布等 MALDITOF MS のテクニックには 制限あり 1.3 以上の多分散度のサンプル ( ほとんどの商品ポリマー ) では 紛らわしい平均分子量データとなる Detector response vs m/z 多分散サンプルにおける最適 matrix/sample ratio 設定の困難さ Multimer 形成と多価イオンによるシグナルの損失 単分散のサンプルの分析はこれらの制限を受けない 27 Nihon Waters K.K. 5 アプローチ 解決策は単分散フラクションに分画するために MALDI MS の前でサンプルを GPC (SEC) を使用してクロマト分離する MALDI MS の為のサンプルの GPC (SEC) 分離と溶離液分取 / 定着システムの開発 27 Nihon Waters K.K. 6 3
一般的手順 GPC (SEC) による単分散フラクションの分離により より簡便に MALDI MS 分析が可能 GPC 分離後 フラクションを分取 サンプルは precoated MALDI target プレート又は適当なマトリクス溶液を伴った mixed postcolumn に連続的に供与される レーザーが連続的に供与されるサンプルに照射され, 各部位のマススペクトルを取得 ソフトウェアは GPC 分画後の個々のスペクトルを結合し 分画前の元の多分散サンプルの分子量分布に補正 換算 27 Nihon Waters K.K. 7 Waters GPC/MALDI TYOF MS system for polymer characterisation Waters Micromass MALDI micro high performance MALDITOF mass spectrometer 27 Nihon Waters K.K. 8 4
GPC/MALDI MS 分析例 (Polylactide glycolide) 27 Nihon Waters K.K. 9 イントロダクション Poly(DLLactidecoglycolide) (PLG) はドラッグ デリバリーに使用される生物学的適合性と生物分解性ポリエステル 分子量データは性能の特性に関連するため重要 PLG polymers 通常は highly polydisperse (Pd>1.5) 分散型 PLG. への GPC 分画 / MALDIMS の応用 27 Nihon Waters K.K. 1 5
イントロダクション O O [ O CH C ] m [ O CH 2 C ] n CH 3 Figure. Poly(DLLactidecoglycolide) (PLG) PLG is a copolymer of lactide and glycolide. オリゴマーも分子量の複雑な混合物として存在 27 Nihon Waters K.K. 11 MALDI (No GPC) スペクトルが共重合体の組成情報を提供している間 正確な分子量分布が得られない 1 7 7 2. 6 4 6 4 Lactide Glycolide Copolymer MW: acid MW: mer 8 3. 5 6 5 9 8 4 4. 5 1 7 3 Lactic acid: C 3 O 3 H 6 9 72 8 8 8. 4 3 9 2. 3 6 2 5 Glycolic acid: C 2 O 3 H 4 76 58 9 2.3 1 3 8 9 6. 2 3 2 1 9 7 6. 1 4 1 4 1 6 2. 4 3 1 1 3 5. 7 8 1 3 1 1 9 3. 6 6 8 5 1 4 8. 9 7 8 8 1 7 2 7. 4 3 6 3 8 9 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 m / z PLG GPC 分画前の PLG の MALDI MS スペクトル 27 Nihon Waters K.K. 12 6
プロトコール Gel Permeation Chromatography (GPC) Column: Waters Styragel HR2 4.6 x 3 mm at 25 C HPLC Pump: Waters 616 pump with 6S controller Detector: Waters 41 Refractive index detector and 996 Photodiode array detector (PDA) Flow rate: Isocratic gradient of tetrahydrofuran (THF) at.3 ml/min for 6 min Injection volume: 2 ml LCMALDIprep Sample Collection Conditions Sample concentration: 1 mg/ml Sheath gas temperature: 125 C Nebulizer gas flow: 25 Foil: Dithranol 1 Time /with sodium salt Stage speed: 5 mm/min 27 Nihon Waters K.K. 13 PDA.15.1.5 1 2 3 4 5 6 Arbitrary Y / Arbitrary X File # 1 : BASELINE GPC UV Chromatogram of PLG (Lactel) absorbance at 254 nm Overlay YZoom CURSOR Res=None GPC PDA chromatogram of the selected PLG copolymer at UV wavelength of 254 nm 27 Nihon Waters K.K. 14 7
GPC 分離による多分散 ( 分子量分布 ) の軽減 1 21.2126 2466.864 4238.5762 4584.635 4785.4629 493.759 567.939 385.63 5795.4712 3777.925 1 1349.49 1364.499 3271.6724 3834.2188 4325.4932 1571.736 3241.773 2766.4451 4482.856 481.1978 921.7535 1 929.7783 113.419 1146.4146 1355.9354 1579.747 929.9463 1 3241.7795 3618.776 PLG copolymers GPC フラクションの溶出時間に伴う MS スペクトル 93.9546 2228.844 2447.364 27.5942 275.3337 117.7274 3142.66 1519.818 1854.3126 1 256.6262 2186.8171 2316.967 2461.1458 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 m/z 各フラクションの分子量を結合することによって 未分画サンプル ( オリジナル ) の分子量分布を換算 27 Nihon Waters K.K. 15 MALDIMS MS data 1 1519.818 1854.3126 228.5533 97.929 1461.6892 2114.6843 2172.75 1419.5587 1375.4899 1317.3483 2186.8171 223.8557 2258.9187 2272.9343 2316.967 2346.9697 The polymer distribution is centered at about m/z=2, (MP) 1289.2689 1245.153 1231.1182 944.1331 245.195 2461.1458 2463.964 2491.1392 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 m /z MALDI target plate にスポットされたある GPC フラクションの MS スペクトルの 1 例 27 Nihon Waters K.K. 16 8
Isotopic clusters 1 1854.3126 1868.3789 14 14 194.4821 1882.489 1884.3533 1898.3832 1912.449 1926.448 1942.426 191.4761 1896.4314 1913.3997 1852.3837 1855.2921 1869.3622 1856.2722 187.316 1899.3444 1914.3647 1924.5424 1928.4153 1866.4426 1938.5695 1885.311 1943.3986 188.4655 19.3357 1929.3842 1857.2819 1871.27 1894.546 1858.2625 1886.2987 1887.3168 198.5182 191.2976 1915.364 1916.3257 193.3834 1944.415 1865.5198 1859.2728 1872.3138 1873.2983 1888.3351 192.2894 1922.5773 1931.3527 1945.447 1946.3776 185 1 85 5 1 86 1 865 18 7 187 5 1 88 1 88 5 1 89 18 95 19 19 5 1 91 1 91 5 19 2 19 25 193 1 93 5 1 94 19 45 19 5 m /z 先のスペクトルの拡大. アイソトピック クラスター間の 14Da の差異は Lactide [OCH(CH 3 )C(O)] と Glycolide [OCH 2 C(O)] モノマーに起因 27 Nihon Waters K.K. 17 MALDI technology の利便性 MALDI 分析による the Poly(DLlactidecoglycolide) (PLG) polymer の GPC 分離の確認 GPC 分画を行う事で MALDIMS の弱点である多分散度のサンプルの問題を克服 27 Nihon Waters K.K. 18 9
GPC/ API MS API 大気圧イオン化法 (ESI, APCI) は 最も一般的な LC/MS イオン化法であり 比較的極性を有する低分子領域化合物の MS 分析に非常に適しています 応用分野 : (i) ポリマー添加剤の分子量測定 (ii) 末端官能基や繰返しユニットの測定 ( ユニットは重合体の性能の特性に重要 ) (iii) 生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター (iv) 極性ポリマーや低分子領域の重合度の測定 27 Nihon Waters K.K. 19 LC(RP)/UV & APcI chromatograms of polymer additives std_1 1 std_1 1 1 2.73 2 2.93 2.92 3 4 5 4.99 5.79 5.34 5.79 4.98 6 7.56 7 8.33 8.32 8 9.54 9.53 9 13.9 3: Diode Array 273 9.4e5 1. Tinuvin P 2. Irganox 245 3. Tinuvin 326 4. Tinuvin 234 5. Tinuvin 327 6. Irganox 11 7. Irganox 133 8.Irganox 176 9. Irgafos 168 1: Scan AP BPI 1.13e8 2.7 7.55 13.6 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. Time 27 Nihon Waters K.K. 2 1
GPC/ API MS 分析例 ( Poly methyl methacrylate, PMMA ) CH 3 * C * H n 2 COOCH 3 27 Nihon Waters K.K. 21 Normal GPC (THF) SEC_PMMA1uv 1.e1 8.62 21 3: Diode Array Range: 2.588. 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. SEC_PMMA1uv 12.16 TIC.8 5.87 8.47 9.52 1.1 789 14.93 12.29 1.2e6 739 14 5.5 6.4 1253 1355 593 45 1.81 1.87 73 2.21 4.25 1246 1227 14.98 26 1278 3.4 8.4 1179 1247 117 114 981 8.e2 6.e2 4.e2 2.e2 6.47 215 6.95 215 7.17 214 77 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. Time 27 Nihon Waters K.K. 22 11
Scheme of MakeUp solvent Flow for API HPLC (GFC) Mobile phase: for SEC e.g.,thf, CHCl3 HPLC SEC Column(s) UV/PDA.31. ml /min. Make up pump (bilt in syringe pump etc.) T joint Make up sol.:for poler solution e.g., CH3CN, MeOH.3mL/min. MS (Qp singlems, ESI/APcI) 27 Nihon Waters K.K. 23 GPC/ API MS Mn776 8.e2 8.64 3: Diode Array Range: 2.578 6.49 6.e2 4.e2 6.97 7.19 1.4 2.e2 7.45. 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. 7.23 7.55 8.23 6.98 6.83 BPI 1.3e8 6.7 8.46 6.61 1 6.5 6.16 1.26 3.7 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. Time 27 Nihon Waters K.K. 24 12
ESI at Low MW range Mn776 6.e2 4.e2 2.e2 6.49 6.97 7.19 7.45 7.79 3: Diode Array Range: 6.814e2 Mn776 386 (7.795) 425.9 1 525. 625.1 825.3 366 (7.418) 1 425.9 526. 625.1 725.2 355 (7.21) 1 526. 625.1 725.2 5.94e7 9.52e7 1.1e8. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. 7.2 7.23 7.46 8.25 BPI 6.93 9.85e7 6.59 6.72 342 (6.966) 1 625.1 725.2 825.3 332 (6.778) 1 725.2 825.3 925.4 324 (6.628) 925.4 1 825.3 125.5 7.32e7 4.97e7 1.85e7 1 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. Time 317 (6.496) 1 925.4 125.5 2.18e7 1125.5 m/z 4 6 8 1 12 14 27 Nihon Waters K.K. 25 ESI mass chromatograms Mn776 5.e2 1 1 6. 7. 8. 6.37 1125.522 1.49e7 5.74 6. 7. 8. 6.48 125.454 1.74e7 5.84 Time 6. 7. 8. 3: Diode Array 6.49 6.97 Range: 6.814e2 7.19 7.79. 6. 7. 8. 6.1 1 1425.654 6.5 7.34e6 6. 7. 8. 6.16 6.27 6. 7. 8. 6.26.256.31 6.42 1325.575 1.1e7 1225.583 9.5e6 Mn776 3: Diode Array 6.49 6.97 Range: 1.469 1. 7.45 7.79. 6. 7. 8. 1 6.59 925.379 3.2e7 5.86 6. 7. 8. 6.72 825.297 5.4e7 1 6. 7. 8. 6.85 6.93 725.28 7.32 8.52e7 6. 7. 8. 7.8 7.15 7.34 6. 7. 8. 7.42 525.979 9.76e7 6. 7. 8. 626.82 8.27e7 Time 27 Nihon Waters K.K. 26 13
ESI mass spectra 分子量分布 SEC_PMMA4_MS 3: Diode Array SEC_PMMA4_MS 244 (5.12) 5.46 Range: 1.857e1 1 1725 1825 216 1.5e1 1926 1425 1325 1927 1.e1 124 175 1928 5.e2 484 751 87 1983 3. 4. 5. 6. 7. 8. SEC_PMMA3_MS 3: Diode Array SEC_PMMA3_MS 39 (6.347) 5.67 Range: 1.469e1 1225 1 1325 215 1326 1.e1 1125 1426 1626 1727 1926 5.e2 724 125 674 3. 4. 5. 6. 7. 8. SEC_PMMA2_MS 3: Diode Array SEC_PMMA2_MS 327 (6.687) 5.96 Range: 9.755e2 925 1 215 125 484 654. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 3: Diode Array 346 (7.41) 6.49;215 Range: 6.814e2 725 1 5.e2 5.e2 2.5e2 6.97 214 7.79 21. Time 3. 4. 5. 6. 7. 8. 825 625 825 1125 1126 1325 1525 1727 1926 925 125 1226 1426 5 1 15 2 1.3e5 1.32e6 5.18e6 2.1e7 m/z 27 Nihon Waters K.K. 27 GPC elution (PDA/ESI, Map) 27 Nihon Waters K.K. 28 14
GPC elution (ESI, Map) 27 Nihon Waters K.K. 29 質量分析計イオン化 (ESI( ESI&APCI) の原理 ESI キャピラリ 4 kv APCI 加熱 脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇 帯電液滴の生成イオン蒸発 コロナ放電により試薬イオンが生成 x xh M xh x M M x x x x Waters ESCi ESI/APCI の同時取込 キャピラリ コロナニードル 試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成 ( プロトン転移またはチャージ転移 ) M: サンプル分子 X:H2O や NH3 などの溶媒分子 27 Nihon Waters K.K. 3 15
GPC with ESCi (ESIAPcI) SEC_PMMA1_ESCi 8.e2 6.e2 4.e2 2.e2 6.5 215 6.98 216 7.46 217 4: Diode Array Range: 3.34e1 4. 5. 6. 7. 8. SEC_PMMA1_ESCi 7.48 7.75;426 TIC 426 7.49e8 4.27 365 9 4. 5. 6. 7. 8. SEC_PMMA1_ESCi 2: Scan AP 7.69 7.92 BPI 425 325 8.95e7 SEC_PMMA1_ESCi 19 (7.481) 425 1 525 625 325 426 526 725 441 541 327 442 542 SEC_PMMA1_ESCi 191 (7.538) 425 1 325 525 2.91e7 726 825 641 741 925 125 1126 1226 1426 2: Scan AP 1.87e7 7.12 625 4. 5. 6. 7. 8. Time 625 426 379 526 725 542 641 825 925 1126 125 1226 1346 4 6 8 1 12 14 m/z 27 Nihon Waters K.K. 31 まとめ GPC/MS を用いる事で 従来の溶出時間情報 ( クロマトグラム ) に加え 1. マススペクトルからの質量情報やフラグメント情報 2. 低分子領域における高感度化 3. 共重合体 (copolymer) におけるより正確な解析 等が可能となった 27 Nihon Waters K.K. 32 16