Ⅴ. ビブリオ属の検査法 1. はじめにグラム陰性通性嫌気性桿菌でオキシダーゼテスト陽性の菌グループをビブリオ科 (Vibrionaceae) とする ビブリオ属は現在 30 数菌種が知られている ヒトの下痢症原因菌 : Vibrio cholerae O1 O139( コレラ菌 ) 3 類感染症菌 V.cholerae non-o1 non-o139(nag ビブリオ ) V.parahaemolyticus ( 腸炎ビブリオ ) 食中毒菌 V.mimicus V.fluvialis V.furnissii 食品等の検査では V.alginolyticus V.vulnificus が分離されることが多い 2. ビブリオ属の種類と特徴 1) コレラ菌 (V.cholerae O1 および O139) コレラの原因菌で 主な病原因子はコレラトキシン (CT) である コレラは人のみが発症する疾患で 感染者のヒト糞便が主な感染源である 典型的症状は CT の作用で起こる大量の無痛性水様性下痢と脱水症状で 比較的軽症のまま経過することもあり 最近はその傾向が強い 一端単毛性のやや湾曲したグラム陰性無芽胞桿菌で 発育に食塩を必要としない 1 分類 : 現在 V.cholerae は O1~O205 の血清型に分類されている 3 類感染症菌に指定されたコレラ菌は 表 4に示す生化学的性状を示し 血清型が O1 または O139 で ctx 遺伝子を保有し CT を産生する菌である この遺伝子は線維状ファージのゲノム上にコードされ 菌から菌へ移行する 2 抗原型 :V.cholerae O1 は a b c 抗原の量的な違いで小川型 稲葉型に分 けられる 市販の診断用血清 ( または感作ラテックス ) で型別できる ( 表 1) 表 1 コレラ菌の抗原型 診断用血清 感作ラテックス 混合 (O1) 小川因子稲葉因子 a b c 小川 + + - + + - 稲葉 + - + + - + V.1
3 生物型 :V.cholerae O1 はアジア型とエルトール型に区別される ( 表 2) 表 2 アジア型とエルトール型の鑑別性状 性状溶血性 ニワトリ赤血 ホ リミキシン B ファーシ Ⅳ ファーシ Ⅴ VP 生物型 ( ヒツシ ) 球凝集性 感受性 (50U) 感受性 感受性 アジア型 - - + + - - エルトール型 + + - - + + 4 コレラ菌の取り扱い * コレラ毒素を産生する菌 (3 類感染症 ) 行政上防疫対策の対象となる * コレラ毒素を産生しない菌 ( 食中毒菌扱い ) 防疫対策とらない * 真性患者 保菌者の決定は 衛生研究所が行う ( 国内初発でない場合も含む ) 2)V.cholerae non-o1 および non-o139(nag ビブリオ ) NAG ビブリオはコレラ菌と分類学的に同じ種に属し その生態も同じである 本菌による感染症 ( 食中毒 ) が発生したときは 防疫措置の対象ではない 表 4に示す生化学的性状を示し 血清型が O1 または O139 以外 3)V.mimicus 発育に食塩を必要としない 選択分離培地上の所見は腸炎ビブリオと類似している 散発下痢症患者から分離されることは稀であり 海外旅行者に多い 4)V.parahaemolyticus ( 腸炎ビブリオ ) わが国における食中毒の主要な原因菌の一つである 汽水域および沿岸海水に生息し 夏期に主に魚介類から感染することが多い 調理器具等を介して他の食品への二次感染によることも多い 一端単毛性のグラム陰性 無芽胞桿菌で 発育に食塩を必要とする 発育至適温度は 30~37 で 42 でも発育するが 10 以下では発育しない 至適 ph は 8.0 至適条件下での増殖は 他の感染型食中毒菌に比べて速い 血清型 :K 抗原と O 抗原の組み合わせによって型別される 5)V.fluvialis および V.furnissii 食中毒菌に指定されているが 発生事例はほとんどない V.fluvialis は ブドウ糖からガスを産生しない V.furnissii は ブドウ糖からガスを産生する 両菌とも発育に NaCl を必要とする V.2
6)V.vulnificus 分離培地上の外見は腸炎ビブリオに非常によく似ているが 耐塩性 ONPG 試験 セロビオースの分解性で区別できる 慢性肝疾患 ガン 白血病等の患者に感染して敗血症を起こし 多くの場合致死的な転帰をとる アルコール依存症 糖尿病 二枚貝の生食は高リスクである 7)V.alginolyticus 海産魚介類等のビブリオ属の検査で非常に高率に分離される ヒトの下痢症とは無関係と考えられている 分離平板上で大きな集落を形成する 表 3 ビブリオ属の種類と特徴まとめ V.cholerae O1,O139 ( コレラ菌 ) V.cholerae non-o1,non-o139 (NAG ビブリオ ) 病原因子 ( 検査法 ) CT (VT-RPLA, PCR) なし 特徴 血清型 ヒトに激しい水様下痢を起こす 血清型 :O1( 稲葉型 小川型 ) または O139 コレラ菌 (O1) の生物型 : アシ ア型 エルトール型 血清型 :O2~O205 (O139 以外 ) コレラ菌と同じ種に属し その生態も同じ V.mimicus TDH? 海外旅行者に多い 腸炎ビブリオ V. furnissii TDH (KAP-RPLA,PCR) TRH( ウレアーセ テスト ) 血清型 :O と K の組み合わせ 食中毒の主要な原因菌で魚介類から感染する V. fluvialis なし集団発生事例はほとんどない V. vulnificus? 慢性肝疾患等患者は海水浴 生魚喫食に注意 V. alginolyticus なし非病原菌 V.3
H2S 表 4 ビブリオ属の性状分離培地上の集落性状 菌 種 TCBS クロモアカ ーヒ フ リオ コレラ菌 黄色 青色 NAG ビブリオ 黄色 青色 V.mimicus 青緑色 V.fluvialis 黄色 V. vulnificus 青緑色 V.parahaemolyticus 青緑色 紫色 V.alginolyticus 黄色 白色 表 5 主な鑑別性状 菌 コレラ菌 生化学性状 種 NAG ビブリオ V.mimicus V.fluvialis V.furnissii V.vulnificus 斜 面 高 層 TSI ガ ス リ ジ ン LIM 運 動 性 VP 0 3 耐塩性 + + - - + + + d + + - - - + + + + - - + + + d + + - - - + + - + - - + + + - + + - - - + + + + - - - d + - - + + - - + + + + + - - d + - - + + - - + + - + - - + + + - - + + - - + + V.parahaemolyticus - + - - + + + - - + + + - + - V.alginolyticus インドール + + - - + + + + - + + + + + - 6 8 10 オキシダーゼ O N P G 3. ビブリオ属の検査法 1) 使用培地 1 増菌培地 : アルカリペプトン水 ( 栄研 ) ( 食塩ポリミキシンブイヨン )( 栄研 ニッスイ ) 2 分離培地 :TCBS 寒天 ( 栄研 ニッスイ 極東等 ) クロモアガービブリオ ( 関東化学 ) 3 生化学的性状確認培地 : * 1NaCl 加 TSI 寒天 1NaCl 加 LIM 培地 1NaCl 加 VP 半流動培地 1NaCl 加普通寒天斜面培地 * 耐塩性試験培地 (0,6,8,10NaCl 加 Tryptone water) V.4
2) 検査法 1 コレラ菌 便 食品 水等 直接培養増菌培養 TCBS アルカリヘ フ トン水 37 37 8-15h 一夜分離培養 TCBS 37 一夜疑わしいコロニーためし凝集 (O1,O139) (+) (-) 確認培養コレラ菌陰性 TSI,LIM ( 他のヒ フ リオの可能性 ) VP,NA 耐塩性試験 (O,6,8,10) 37 一夜性状確認 ( 表 5) 血清型別( 表 1) 毒素産生試験 ( 衛研で実施 ) 1 検体の処理 ( 増菌培養 ) 便 検体量:0.5~1g 増菌培地:10ml 食品 検体量:10~25g( 状況により ) 増菌培地 :90~225ml 河川水 海水等 検体量:~2000ml A; 遠心分離法検体を 8,000rpm で 30 分程度遠心分離した沈査を試料とする B; フィルター濾過法検体を吸引濾過 ( ホ アサイス 0.22-0.45µm) し 濾紙を試料とする * A または B の試料を増菌培地 10~ 100ml に入れ増菌培養する C;2 倍濃厚法検体に2 倍濃度に調整した増菌培地を等量加え 増菌培養する 2 分離培養 : 増菌培養液 1エーセ 画線培養 3 疑わしいコロニーためし凝集 性状試験 * TCBS 上のコレラ菌様黄色コロニーを感作ラテックス a コレラ菌診断用血清 O139 抗血清でスライト 凝集試験 * 凝集 (+): コレラ菌陽性の疑い 生化学的性状 CT 産生試験を行い決定する * 凝集 (-): コレラ菌陰性 必要に応じ 生化学的性状を調べ菌種を特定 4 毒素産生試験 * RPLA 法 PCR 法で行う ( 衛研で実施 ) V.5
2 腸炎ヒ フ リオ ( その他のヒ フ リオ ) 便 食品 環境等 直接分離増菌培養アルカリ性ヘ フ トン水 or ( 食塩ホ リミキシンフ イヨン ) TCBS 37 8-15h クロモアカ ーヒ フ リオ 37 分離培養一夜 TCBS クロモアカ ーヒ フ リオ 37 一夜疑わしいコロニー確認培養 TSI,LIM VP,NA 耐塩性試験 (O,6,8,10) 37 一夜性状確認 ( 表 5) 血清型別耐熱性溶血毒 (TDH) 産生検査 (RPLA,PCR) 3 腸炎ヒ フ リオの定量培養 (MPN) 検体の 10 倍希釈液作成 a 10ml+2 倍濃度アルカリヘ フ トン水 10ml 3 本 b 1ml+アルカリヘ フ トン水 10ml 3 本 c 0.1ml+アルカリヘ フ トン水 10ml 3 本 37 一夜培養分離培養クロモアカ ーヒ フ リオ (TCBS) 37 一夜培養疑わしいコロニー確認培養 TSI,LIM,VP,NA 耐塩性試験 (O,6,8,10) 37 一夜培養性状確認 ( 表 5) 1 検体の処理 ( 増菌培養 ) コレラ菌検査法と同じ 2 分離培養の平板上のコロニー性状は表 4 参照 3 血清型別 : 腸炎ビブリオは K 抗原と O 抗原の組み合わせで型別される K 抗原型別 : * 生菌によるスライト 凝集試験 * NA または TSI 寒天上の菌を使用 O 抗原型別 : * 加熱死菌によるスライト 凝集試験 * NA 又は TSI 寒天上の菌を 3 食塩水 ( 約 1ml) に濃厚浮遊させる * 121 30~60 分加熱 * 3,000rpm20 分遠心分離した沈渣を使用海産物等の食品を検査対象とした検査では V.vulnificus が分離されることがある 腸炎ヒ フ リオと V.vulnificus の鑑別は ONPG 試験およびセロビオース分解試験が有効である 腸炎ヒ フ リオと V.vulnificus の鑑別セロヒ オース ONPG 分解性腸炎ヒ フ リオ - - V.vulnificus + + 希釈系列毎の陽性試験関数を最確表に 当てはめ MPN 値を求める V.6