学会発表資料 _ 抜粋 リン酸基含有化合物分析に対する新規高耐圧ステンレスフリーカラムの有用性について 佐藤友紀 1,3, 山口忠行 2, 尾坂裕輔 2, 山本祝久 1 ( 株式会社島津ジーエルシー 1, 株式会社島津製作所 2, 独立行政法人国立循環器病研究センター薬剤部 3) はじめに リン酸基含有化合物や 属キレート性のある化合物は, 分析を う際にテーリング現象や吸着現象が起こる事が一般的に知られている この種の化合物は代謝物 薬物等に多く存在し,HPLC による分析時には溶離液に塩やキレート剤を添加する事で吸着現象を軽減できる しかしながら, これらの溶離液は質量分析計には使 できないものが多く, また, HPLC システム流路に残存しゴーストピークの原因となる事も懸念される これらの吸着現象は, カラムを含めた HPLC システム流路全体の 属部分が影響しており, 根本的な改善が広く求められているところである そこで我々は, カラムボデーに着目し開発 検討を った PEEK 製のボデーはこれらの物質に対し不活性度が非常に いが, 耐圧性が低い そのため, ステンレススチールのカラムボデー内面を特殊コーティングし, フリットは 耐圧性の樹脂素材を採 することで不活性と 耐圧の両 を目指した 本報告ではリン酸基含有化合物を い, 新開発したボデーのカラムの評価を ったのでここに報告する 2
講演概要 リン酸基含有化合物の 属吸着について 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて 分析例 3 講演概要 リン酸基含有化合物の 属吸着について 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて 分析例 4
リン酸基含有化合物について ヌクレオチド ATP,ADP,AMP,GMP,UDP,CTP など 代謝物 医薬品 ( 有効成分 ) 農薬 など 5 リン酸基含有化合物の 属吸着について Me n+ Me n+ Me n+ Me n+ Me n+ Me n+ Me n+ Metal 6
例えば 下記の HPLC 条件でヌクレオチド (ATP AMP) を分析してみると Instruments : Nexera Column : Typical C18 100mmL*2.1mmI.D., 3µm Mobile Phase : 10 mm Ammonium Formate in Water :ACN = 99:1_Isocratic flow Flow Rate : 0.2 ml / min Oven Temperature : 40 Detection : SPD-M20A at 256nm, Slit Width 1.2nm Injection Vol. : 1µL ヌクレオチドの分析例 AMP Adenosine triphosphate (ATP) ATP Adenosine monoiphosphate (AMP) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min
ヌクレオチドの分析例 ATP 島津アプリケーションニュース No.L423 より抜粋 リン酸基含有化合物の 属吸着について 配管素材の影響 -:Stainless steel 配管 (600mm) -:PEEK 配管 (600mm) Column :Typical C18 (100 mm L. 2.1 mm I.D., 3µm) Instrument : Nexera Mobile Phase : Mobile Phase : 10 mm Ammonium Formate in Water : MeCN=99:1 Flow Rate : 0.2 ml/min Column Temp. : 40 Detection : SPD-M20A at (254 nm) Injection Vol. : 1 µl 10
リン酸基含有化合物の 属吸着について 配管素材の影響 :600mmL 11 リン酸基含有化合物の 属吸着について 配管素材の影響 -:Stainless steel 配管 (600mm) -:PEEK 配管 (600mm) 2 2 Stainless steel Peak 1 5.10 Peak 2 1.49 PEEK 4.67 1.48 Peak 1. Adenosine Triphosphate 2. Adenosine Monophosphate 11 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 min 12
講演概要 リン酸基含有化合物の 属吸着について 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて 分析例 13 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて Stainless steel Body Polymer lining Polymer frit Stationary phase Mastro TM Multi Stroma: 多層 14
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて Mastro( マストロ ) カラム耐圧 Mastro C18 100mmL 2.1mmI.D., 3µm 耐圧 :50MPa (7250psi) Stainless steel Body Polymer lining Polymer frit Stationary phase 15 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて Mastro TM 16
講演概要 リン酸基含有化合物の 属吸着について 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて 分析例 17 新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて Column : Mastro C18 100mmL*2.1mmI.D.,3µm Instruments : Nexera Mobile Phase : 10 mm Ammonium Formate in Water :ACN = 99:1_Isocratic flow Flow Rate : 0.2 ml / min Oven Temperature : 40 Detection : SPD-M20A at 256nm, Slit Width 1.2nm Injection Vol. : 1µL
新規高耐圧ステンレスフリーカラムによるヌクレオチドの分析例 uv 30000 AMP 20000 ATP 10000 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min ヌクレオチドの分析例 ( カラム 較 ) Peak Asymmetry uv 60000 ATP AMP Mastro TM C18 1.39 1.14 50000 Typical C18 5.10 1.49 40000 30000 ATP (Mastro) AMP(Typical C18) AMP (Mastro) 20000 ATP(Typical C18) 10000 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min
副腎皮質ホルモン製剤, 水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析 水溶性ヒドロコルチゾン製剤 ( 有効成分 ) Hydrocortisone Sodium Succinate 副腎皮質ホルモン製剤 ( 有効成分 ) Hydrocortisone Sodium Phosphate 副腎皮質ホルモン製剤, 水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析 Column : Mastro TM C18(100 mm L. 2.1 mm I.D., 3µm) Typical C18 (100 mm L. 2.1 mm I.D., 3µm) Instrument : Nexera Mobile Phase : 0.1 % Formic Acid in Water : 0.1 % Formic Acid in MeCN=50:50 Flow Rate : 0.2 ml/min Column Temp. : 40 Detection : SPD-M20A at (254 nm) Injection Vol. : 1µL
副腎皮質ホルモン製剤, 水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析 Typical C18 カラム Peak 1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate 2 1 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 副腎皮質ホルモン製剤, 水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析 Mastro TM C18 カラム Peak 1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate 1 2 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
副腎皮質ホルモン製剤, 水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析 Mastro TM C18 カラム 1 2 Peak 1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min Typical C18 カラム 2 1 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 副腎皮質ホルモン製剤の分析 Column : Mastro TM C18(100 mm L. 2.1 mm I.D., 3µm) Typical C18 (100 mm L. 2.1 mm I.D., 3µm) Instrument : Prominece UFLCXR + LCMS - 2020 Mobile Phase : A:0.1 % Formic Acid in Water B: 0.1 % Formic Acid in MeCN 0.01min ポンプ B.Conc 10% 5.00 ポンプ B.Conc 80 5.01 ポンプ B.Conc 10 6.50 ポンプ B.Conc 10 Flow Rate : 0.2 ml/min Column Temp. : 40 Detection : MS (SIM mode) Injection Vol. : 2µL
副腎皮質ホルモン製剤の分析 10ppm 1.4 1.3 (x100,000) Mastro TM C18 カラム S/N : 685 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 Typical C18 カラム S/N : 492 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 副腎皮質ホルモン製剤の分析 5ppm (x10,000) 7.5 7.0 6.5 Mastro TM C18 カラム S/N : 567 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 Typical C18 カラム S/N : 425 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 1ppm (x10,000) 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Typical C18 カラム S/N : 141 Mastro TM C18 カラム S/N : 539 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 副腎皮質ホルモン製剤の分析 0.1ppm 3.9 3.8 (x1,000) Mastro TM C18 カラム S/N : 34 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 Typical C18 カラム S/N : 9.5 2.5 2.4 2.3 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min
副腎皮質ホルモン製剤の分析 25ppb (x1,000) 3.5 3.4 3.3 3.2 Mastro TM C18 カラム S/N : 24 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 Typical C18 カラム S/N :2.8 2.6 2.5 2.4 2.3 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min まとめ リン酸基含有化合物の分析において新規高耐圧ステンレスフリー LC カラム Mastro TM が有効である事が示唆された ギ酸 ギ酸アンモニウム等の揮発性の塩を用いリン酸基含有化合物を分析したところ 般的なステンレスボデーカラムに べ良好なピーク形状となった事より LC/MS(/MS) 分析において有効である事が示唆された
終わりに 本資料は静岡県 学薬学部生体機能分子分析学分野轟 堅 郎准教授との共同研究により得られたデータを使用しております