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上 原 記 念 生 命 科 学 財 団 研 究 報 告 集, 24(2010) 1. 桂 枝 茯 苓 丸 の 臓 器 線 維 化 進 展 抑 制 効 果 柴 原 直 利 Key words: 桂 枝 茯 苓 丸, 腎 線 維 化, 肝 線 維 化 * 富 山 大 学 和 漢 医 薬 学 総 合 研 究 所 漢 方 診 断 学 部 門 緒 言 慢 性 疾 患 である 肝 臓 や 腎 臓 などの 臓 器 障 害 は, 最 終 的 にはその 臓 器 に 線 維 化 を 来 たして 不 可 逆 的 な 機 能 不 全 へと 進 展 する ものが 多 いが, 未 だ 確 立 した 治 療 予 防 法 はない. 桂 枝 茯 苓 丸 ( 以 下 KBG)は 慢 性 腎 肝 疾 患 に 対 して 頻 用 される 漢 方 薬 の 一 つであるが,その 作 用 機 序 については 不 明 な 点 が 多 い.そこで, 腎 肝 障 害 モデル 動 物 を 用 い,KBG の 臓 器 線 維 化 進 展 効 果 及 びその 作 用 機 序 について 検 討 した. 方 法 および 結 果 1. 腎 線 維 化 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果 に 関 する 組 織 学 的 検 討 Wistar 系 雄 性 ラットに 5/6 腎 摘 を 施 した 後, 自 由 飲 水 により KBG を 4 週 間 及 び 8 週 間 投 与 して 血 液, 尿, 腎 を 採 取 し, 腎 機 能 パラメーター, 組 織 学 的 変 化 について 検 討 した. 残 腎 重 量 は KBG4 週 間 投 与 により 有 意 な 低 下 を 認 め,5/6 腎 摘 によ り 上 昇 した 血 圧 は KBG により 低 下 した.BUN(Blood Urea Nitrogen)は KBG により 低 下 し, 血 清 Cr 値 も 低 下 傾 向 を 示 した. 尿 中 蛋 白 量 は KBG により 抑 制 された( 図 1). 図 1. 5/6 腎 摘 後 の 腎 機 能 障 害 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果. 5/6 腎 摘 4 週 及 び 8 週 後 における BUN(A), 尿 中 タンパク 量 (B).5/6 腎 摘 により 増 加 した BUN 及 び 尿 中 蛋 白 量 は KBG により 低 下 した. 組 織 学 的 検 討 では,GSI(Gromeluro Sclerosis Index)には KBG による 変 化 を 認 めなかったが,ICFI(Interstitial cell infiltration/fibrosis Index)は KBG により 有 意 に 低 下 した( 図 2,3). * 現 所 属 : 富 山 大 学 和 漢 医 薬 学 総 合 研 究 所 漢 方 診 断 学 分 野 1

図 2. 桂 枝 茯 苓 丸 による 腎 組 織 像 の 変 化 (PAS 染 色 ). 4 週 間 後 の Sham(A),Control(B),KBG(C) 及 び 8 週 間 後 の Sham(D),Control(E),KBG(F)の 腎 組 織 PAS 染 色 像.4 週 8 週 ともに Control では 5/6 腎 摘 によりメサンギウム 拡 大 やメサンギウム 細 胞 増 加, 分 節 状 糸 球 体 硬 化 像 とともに 間 質 に 小 円 形 細 胞 浸 潤 や 線 維 化 が 観 察 されたが,KBG では 間 質 の 小 円 形 細 胞 浸 潤 や 線 維 化 が 軽 減 していた. 図 3. 桂 枝 茯 苓 丸 の 腎 線 維 化 進 展 抑 制 効 果 の 組 織 学 的 解 析. GSI(A),ICFI(B).GSI ICFI は 5/6 腎 摘 により 著 増 し,GSI には KBG 投 与 による 変 化 を 認 めなかったが,ICFI は KBG により 低 下 した. 2. 腎 線 維 化 関 連 タンパクに 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 影 響 Wistar 系 雄 性 ラットに 5/6 腎 摘 を 施 して control 群,1% 3%KBG 群 及 び sham 群 に 分 け,4 週 間 及 び 16 週 間 飼 育 後 に 各 種 パラメーターを 測 定 した.4 週 間 後 では,BUN は 1%KBG により 減 少, 血 清 Cr は 3%KBG により 減 少, 尿 中 蛋 白 量 は 1%, 3%KBG で 減 少 した.16 週 間 後 では 血 清 Cr は 3%KBG により 減 少 し, 尿 中 蛋 白 量 は 3%KBG により 減 少 した.realtime RT-PCR 法 により 腎 線 維 化 関 連 タンパクである TGF-β 1 (transforming growth factor-β 1 ),fibronectin,timp-1 (tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1),timp-2 (tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-2) の mrna 発 現 を 検 討 したところ,4 週 間 後 では TGF-β 1,fibronectin,TIMP-1,TIMP-2 が 3%KBG により 有 意 に 減 少 した ( 図 4). 2

図 4. 腎 組 織 中 の 線 維 化 関 連 タンパク mrna の 発 現 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果. Real-time RT-PCR 法 による 腎 組 織 中 の TGF-β 1 (A),fibronectin(B),TIMP-1(C),TIMP-2(D)の mrna 発 現.4 週 間 後 では 5/6 腎 摘 により 増 加 した 各 タンパクの mrna 発 現 を 3%KBG が 抑 制 した. 3. 肝 線 維 化 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果 に 関 する 検 討 8 週 齢 雄 性 Wistar 系 ラットに TAA (thioacetamide,200 mg/kg BW),あるいは CCl 4 (Carbon tetrachloride,750 μg/kg BW) 処 置 により 肝 線 維 化 モデルを 作 製 した.Sham 群,Control 群,1% 3%KBG 群 の 4 群 に 分 け, 各 種 パラメータ ーを 測 定 した.TAA 処 置 により 血 清 ALP,AST,ALT 値 は 有 意 に 上 昇 したが,KBG 投 与 により 抑 制 された( 図 5). 3

図 5. TAA 処 置 誘 発 肝 機 能 障 害 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果. TAA 処 置 後 2 週,4 週 及 び 8 週 後 における 血 清 ALP(A), 血 清 AST(B), 血 清 ALT(C).TAA 処 置 により 増 加 した ALP,AST,ALT 値 は KBG により 改 善 した. Real-time PCR 法 による 肝 組 織 中 TGF-β 1,fibronectin,TIMP-1 mrna 発 現 量 は,6 週 間 の TAA 処 置 により TGFβ 1,TIMP-1 の mrna 発 現 量 は 有 意 に 増 加 し,KBG により 抑 制 された( 図 6). 一 方,6 週 間 の CCL 4 処 置 では 血 清 ALT 値 が 有 意 に 上 昇 し,この 上 昇 は KBG により 抑 制 されたが, 線 維 化 パラメーターに 変 化 を 認 めなかった. 4

図 6. 肝 組 織 中 の 線 維 化 関 連 タンパク mrna の 発 現 に 対 する 桂 枝 茯 苓 丸 の 効 果. Real-time RT-PCR 法 による 肝 組 織 中 の TGF-β 1 (A),fibronectin(B),TIMP-1(C)の mrna 発 現.6 週 間 後 では TAA 処 置 により 増 加 した TGF-β 1,TIMP-1 の mrna 発 現 を KBG が 抑 制 した. 考 察 KBG については,フリーラジカル 抑 制 を 介 した 抗 動 脈 硬 化 作 用 や 血 管 内 皮 機 能 保 護 作 用 1,2), 内 皮 依 存 性 血 管 収 縮 抑 制 作 用 3), 糖 尿 病 性 腎 症 モデルにおける 腎 機 能 障 害 や 腎 線 維 化 抑 制 作 用 4,5),NAFLD モデルにおける 肝 線 維 化 抑 制 作 用 6) など が 報 告 されているが, 慢 性 肝 腎 疾 患 における 臓 器 線 維 化 進 展 抑 制 効 果 やその 機 序 については 不 明 であった. 5/6 腎 摘 による 腎 障 害 進 展 モデルにおいて,KBG は 腎 機 能 障 害 腎 線 維 化 進 展 抑 制 作 用 を 有 することが 明 らかとなり,その 作 用 機 序 に 腎 線 維 化 関 連 タンパクの 遺 伝 子 レベルでの 発 現 抑 制 が 関 与 する 可 能 性 が 示 唆 された 7). TAA 誘 発 肝 線 維 化 モデルでは,KBG が 胆 道 系 及 び 肝 細 胞 性 酵 素 の 上 昇 を 抑 制 するとともに 肝 組 織 の 線 維 化 関 連 タンパク 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 しており,5/6 腎 摘 による 腎 線 維 化 モデルと 同 様 に,KBG の 肝 機 能 障 害 線 維 化 進 展 抑 制 効 果 には 肝 線 維 化 関 連 タンパクの 遺 伝 子 レベルでの 発 現 抑 制 が 関 与 すると 考 えられた. 一 方,CCl 4 誘 発 肝 線 維 化 モデルでは 肝 機 能 には 改 善 が 得 られたが, 線 維 化 関 連 タンパク 遺 伝 子 発 現 に 変 化 がみられず,TAA 誘 発 肝 線 維 化 モデルとは 異 なる 機 序 が 関 与 する 可 能 性 が 示 唆 された. 以 上 のことから,KBG には 線 維 化 関 連 タンパクの 遺 伝 子 発 現 抑 制 作 用 を 介 した 臓 器 線 維 化 進 展 抑 制 作 用 があり, 慢 性 腎 肝 疾 患 への 幅 広 い 臨 床 応 用 が 可 能 と 考 えられた. 尚, 本 研 究 の 一 部 は 論 文 発 表 の 準 備 中 である 8,9). る. 共 同 研 究 者 本 研 究 の 共 同 研 究 者 は, 富 山 大 学 和 漢 医 薬 学 総 合 研 究 所 漢 方 診 断 学 分 野 の 条 美 智 子, 金 子 真 利 亜, 中 塚 友 貴 子 であ 文 献 1) Sekiya, N., Tanaka, N., Itoh, T., Shimada, Y., Goto, H. & Terasawa, K. : Keishi-bukuryo-gan prevents the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbit. Phytother. Res., 13 : 192-196, 1999. 5

6 2) Sekiya, N., Goto, H., Tazawa, K., Oida, S., Shimada, Y. & Terasawa, K. : Keishi-bukuryo-gan preserves the endothelium dependent relaxation of thoracic aorta in cholesterol-fed rabbit by limiting superoxide generation. Phytother. Res., 16 : 524-528, 2002. 3) Kasahara, Y., Goto, H, Shimada, Y., Sekiya, N., Yang, Q. & Terasawa, K. : Effects of Keishi-bukuryogan(Gui-Zhi-Fu-Ling-Wan)on endothelial function in spontaneously hypertensive rats. J. Trad. Med., 18 : 113-118, 2001. 4) Nakagawa, T., Yokozawa, T., Terasawa, K. & Nakanishi, K. : Therapeutic usefulness of Keishibukuryo-gan for diabetic nephropathy. J. Pharm. Pharmacol., 55 : 219-227, 2003. 5) Nakagawa, T., Goto, H., Hikiami, H., Yokozawa, T., Shibahara, N. & Shimada, Y. : Protective effects of keishibukuryogan on the kidney of spontaneously diabetic WBN/Kob rats. J. Ethnopharmacol., 110 : 311-317, 2007. 6) Fujimoto, M., Tsuneyama, K., Kainuma, M., Sekiya, N., Goto, H., Takano, Y., Terasawa, K., Selmi, C., Gershwin, M. E. & Shimada, Y.:Evidence-based efficacy of Kampo formulas in a model of non alcoholic fatty liver. Exp. Biol. Med., 233 : 328-237, 2008. 7) Nakagawa, T., Tashiro, I., Fujimoto, M., Jo, M., Sakai, S., Oka, H., Goto, H., Shimada, Y. & Shibahara, N. : Keishibukuryogan reduces renal injury in the early stage of renal failure in the remnant kidney model. Evid.-based Complement. Altern. Med., in press 8) Shibahara, N.:The effects of keishibukuryogan on fibrosis-related proteins in the remnant kidney model. Evid.-based Complement. Alternat. Med. in preparation 9) Shibahara, N. et al. : The effects of keishibukuryogan on fibrosis-related proteins of the liver in thioacetamide-induced liver fibrosis model. J. Ethnopharmacol. in preparation