CellKey システムを用いた新しい GPCR の活性評価系 Novel Functional Assay System of GPCRs by CellKey System 北里大学薬学部生命薬化学教室教授藤井秀明 Hideaki Fujii, Ph.D. (Professor) Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Kitasato University 国立がん研究センター研究所がん患者病態生理研究分野研究員宮野加奈子 分野長上園保仁 Kanako Miyano, Ph.D. (Researcher), Yasuhito Uezono, MD, Ph.D. (Chief) Division of Cancer Pathophysiology, National Cancer Center Research Institute はじめに CellKey システムの測定原理 30% G GPCR 1,2 CellKey MDS Sciex 2005 2007 2010 8 2 CellKey 1 GPCR GPCR GPCR 35 S GTP S camp Ca 2+ CellKey TM CellKey TM CellKey 図 1 国立がん研究センター研究所がん患者病態生理研究分野に導入された CellKey システム CellKey CellKey 2 Cellular Dielectric Spectroscopy 2 THE CHEMICAL TIMES 2015 No.1( 通巻 235 号 ) 3
GPCR G G s G i G q 3 G 4 CellKey 96 384 図 2 ウェル底部の電極と 細胞間および細胞内を通過した電流 (extracellular current(iec) および transcellular current(itc)) のイメージ図 図 3 GPCR 下流のシグナルとインピーダンス変化の概念図 GDP: guanosine diphosphate, GTP: guanosine triphosphate, camp: cyclic adenosine monophosphate 図 4 G タンパクのタイプとインピーダンス変化パターンの違い dziec: the changes in impedance related to extracellular current, dzitc: the changes in impedance for transcellular current 4 THE CHEMICAL TIMES 2015 No.1( 通巻 235 号 )
CellKey システムを用いた新しい GPCR の活性評価系 GPCRを標的とした化合物評価の例 G s G i G q GPCR EP4 EP4 2 2-AR H 1 H 1 EP4 G s EP4 HeLa EP4 E2 Prostaglandin E2 PGE2, 10µM 5A PGE2 G s Cholera toxin CTX, 100nM 5B EP4 Gs 2-AR Gi 2 HeLa 2 UK14,304 100nM 6A 2 G i Pertussis toxin PTX, 100ng/mL 6B 2-AR Gi H 1 G q H 1 HeLa H 1 Histamine, 10µM 7A BAPTA-AM 10µM 7B C Protein kinase C, PKC Phorbol 12-myristate 13-acetate PMA, 100nM 7C H 1 PKC G s G i G q G GPCR CellKey CellKey 図 5 EP4 受容体における化合物評価 EP4 受容体発現 HeLa 細胞を Prostaglandin E2(PGE2, 10µM) で刺激し CellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した (A) (B) Cholera toxin(ctx, 100nM) は 18 時間前処置した 図 6 α 2- 受容体における化合物評価 α 2- 受容体発現 HeLa 細胞を UK14,304(100nM) で刺激し CellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した (A) (B)Pertussis toxin (PTX, 100ng/mL) は 18 時間前処置した 図 7 H 1 受容体における化合物評価 H 1 受容体発現 HeLa 細胞を Histamine(10µM) で刺激し CellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した (A) BAPTA-AM(B) は 30 分間 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, C) は 18 時間前処置した THE CHEMICAL TIMES 2015 No.1( 通巻 235 号 ) 5
Peters D 2 4 5 G 4 G GPCR G その他の化合物評価の例 CellKey GPCR epidermal growth factor EGF EGF 8A EGF 1pg/mL EGF AG1478 1µM phosphoinositide 3-kinase PI3K wortmannin 25µM 8B, C EGF EGF EGF PI3K 図 8 EGF 受容体における化合物評価 EGF 受容体発現 HeLa 細胞を EGF(1pg/mL) で刺激し CellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した (A) AG1478(B) と Wortmannin(C) はそれぞれ 30 分間前処置し EGF にて刺激した 表 1 CellKey TM システムにて測定可能な受容体 イオンチャネル 6 THE CHEMICAL TIMES 2015 No.1( 通巻 235 号 )
CellKey システムを用いた新しい GPCR の活性評価系 おわりに CellKey GPCR GPCR 1 CellKey 3 H 3 H TRK-820 U69,593 KOR 3 H TRK-820 3 H U69,593 3 H TRK- 820 3 H U69,593 K d B max 2 6 CellKey 10 7-9 CellKey 10 表 2 モルモット小脳における [ 3 H]TRK-820 および [ 3 H]U69,593 を用いた受容体結合実験 [ 3 H]TRK-820 a [ 3 H]U69,593 K d 0.46 nm b 1.17 nm B max 284 fmol/mg protein b 83.7 fmol/mg protein a TRK-820 は [ 3 H]TRK-820 の結合を完全に置換したが U69,593 は約 80% しか置換しなかった b DAMGO(µ 作動薬 100nM) および DPDPE(δ 作動薬 200 nm) 存在下における [ 3 H]TRK-820 の K d 値および B max 値は 非存在下の値と同等であった (K d=0.51nm, B max=265fmol/mg protein) 参考文献 1 Overington, J. P.; Al-Lazikani, B.; Hopkins, A. L. Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5 12, 993-996. 2 Jacoby, E.; Bouhelal, R.; Gerspacher, M.; Seuwen, K. ChemMedChem 2006, 1 8, 761-782. 3 Molecular Devices CellKey TM. 4 Peters, M. F.; Knappenberger, K. S.; Wilkins, D.; Sygowski, L. A.; Lazor, L. A.; Liu, J.; Scott, C. W. J. Biomol. Screen. 2007, 12 3, 312-319. 5 Fujii, H.; Hayashida, K.; Saito, A.; Yokoyama, A.; Hirayama, S.; Iwai, T.; Nakata, E.; Nemoto, T.; Sudo, Y.; Uezono, Y.; Yamada, M.; Nagase, H. ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5 4 368-372. 6 Fujii, H.; Hirayama, S.; Nagase, H. Opioid Kappa Receptor Selective Agonist TRK-820 Nalfurafine Hydrochloride. Pharmacology. Ed. by Gallelli, L. InTech, 2012, 81-98. 7 Milligan, G. Mol. Pharmacol. 2004, 66 1, 1-7. 8 Prinster, S. C.; Hague, C.; Hall, R. A. Pharmacol. Rev. 2005, 57 3, 289-298. 9 Rozenfeld, R.; Gomes, I.; Devi, L. A. Opioid Receptor Dimerization. The Opiate Receptors. 2nd ed., Ed. by Pasternak, G. W. Humana Press, 2010, 407-437. THE CHEMICAL TIMES 2015 No.1( 通巻 235 号 ) 7