DATASHEET: ILLUMINA RNA ANALYSIS mrna-seqsmall RNA RNA Genome Analyzer csnp mrna Genome Analyzer 1 mrna 1 mrna-seq poly-a 3 Small RNA Small RNA RNA 1: Application Technology Product MRNA-SEQ Discovery Sequencing mrna-seq Small RNA mrna-seq mrna mrna-seq poly-a RNA 1 csnp BeadArray Profiling DASL RNA FFPE / Blood mrna-seq Validation VeraCode DASL RNA mrna-seq
: Genome Analyzer.99 1 SNP Genome Analyzer 1 RNA ID mrna mrna mrna-seq 3 mrna-seqpcr mrna-seq mrna-seq 3: mrna-seq mrna-seq RNA 1 poly-a RNA RNA cdna cdna mrna-seq G e n o m e Analyzer 9.% 3 99.99% RefSeq 3,11 UHR 31,9
DATASHEET: ILLUMINA RNA ANALYSIS オリゴが結合されています Cluster 図: 高い相関を示すmRNA-Seqと定量 PCRの結果 Stationではフローセル上に張り付いた 図: mrna-seqのサンプル調製 cdnaを定温増幅し 1分子を1,分 Total Time Hands-On Time 1. hr 1. hr RNA 断片化 1 hr min cdna 合成. hr min hr min ゲル精製 1. hr 3 min PCR 濃縮 1 hr 3 min 11. hr 3.7 hr 子程度にまで増やしてクラスターを形 qpcr Fold-Change (Brain/UHR) r =.9 成します フローセル上に高密度に並 Poly-A RNA 抽出 んだクラスターは 完全自動化された Genome Analyzerでシーケンスされま す イルミナシーケンステクノロジー は独自に開発した種類の蛍光標識さ れた可逆的塩基と特別なポリメラーゼ アダプター付加 を採用し 数千万のクラスターを同時 mrna-seq Fold-Change (Brain/UHR) 71遺伝子において mrna-seqの発現比 は定量PCRと高い相関を示しています 並行に1塩基ずつ迅速にシーケンスし ます タグプロファイリング よりシンプルなゲノムワイドmRNAの ます 低サイクルPCRを行い サンプ 探索には タグプロファイリングを用 ル内のアダプターが付加されなかった いることができます タグプロファイ cdnaやrnaのコンタミネーションを リングは転写産物全体ではなく 短い 最低限に抑えます タグをシーケンスすることによって転 サンプル調製合計時間 サンプルからデータまでの時間 < 1 week イルミナのmRNA-Seqサンプル調製 キットは標準的な分子生物学手法を用い ています 自動化されたシーケンステク ノロジーと併用することで 最小限のハン ズオン時間でデータを迅速に得ることが できます これらのmRNAテンプレートライ 写物の同定および定量を行います イ ブラリーを用い イルミナGenome ルミナのタグプロファイリングプロト AnalyzerシステムでDNAサンプルと同 コールは独自かつ位置がわかっている じようにシーケンスを行います ライ あるいは1塩基ペアのcDNAタグを ブラリーは完全自動化されたCluster 用いて転写産物を同定します これら Station上でフローセルに流します フ のタグは生物種のリファレンスゲノム タグプロファイリングも 感度 カ と比較することで 発現された遺伝子 バレッジ が調節可能なデジタルデー ローセルには アダプターに相補的な を同定することができます 図: 1塩基の解像度でスプライスジャンクションとcSNPを検出 イントロン エクソンジャンクションの的確な位置の検出は ギャップ 灰色の線 を伴う個々のリードのゲノムへのアライン結果で判定できます 1塩 基多型 SNP はリファレンスゲノムに対して異なる塩基をもつ複数のリードによって検出されます 図では期待されるGに対してAの多型が赤文字で 表示されています
図7: 低発現転写産物における優れた再現性を示すタグプロファイリングの結果 UHR UHR vs. Brain 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Brain (log) 1 Sample Counts (log) Sample Counts (log) Brain 1 1 Sample 1 Counts (log) 1 1 1 Sample 1 Counts (log) 1 1 1 UHR Counts (log) MAQCのヒト脳由来サンプルをタグプロファイリングプロトコールで調製し フローセルの1レーンでシーケンスを行った実験を繰り返し行い ました 結果はサンプル１とサンプル２で表示され タグプロファイリングの高い再現性を示しています 同様の結果がMAQCのUHRサンプ ルでも観察されています 異なるサンプル間の発現差は 脳およびUHRのレーンの結果を比較することで得られます 青点は量サンプルで発 現差がなかったデータポイント 赤点は２倍以上の発現差を示します p=.9 脳とUHRを比較したスキャッタープロットの灰色の四角で 囲まれた部分は 1細胞あたり1転写産物以下 万タグにつき3回のタグカウント のデータを示しています タ プローブ設計を必要としないバイ ます 研究者は目的に合わせてカバ シーケンスします 得られた結果は真 アスのない探索 そしてゲノムデータ レッジ深度を調節し ダイナミックレ 核生物ゲノムにおける新規転写産物同 ベースの更新に合わせて再度アノテー ンジを広げ 低発現転写産物の探索と 定などに用いることができます 理論 ションできるデータ といったmRNA 定量を達成することができます 的な計算では ヒトゲノムのサイズで -Seq同様の特長を有しています タグ またタグプロファイリングは ハイ 99.%の1塩基ペアタグは1回しか起 プロファイリングは発現している遺伝 ブリダイゼーションベースのマイクロ こりません 1 1,既知遺伝子から 子の全長をシーケンスしないため よ アレイ結果の検証法としても使うこと 得られた結果を解析した結果では ヒ り少ないリード数で高い感度を達成す ができます トゲノムにおいて7%の1塩基ペアタ ることができます 例えば サンプル グが1回起こることが予想される と あたり1万タグをシーケンスすれ 高品質データ いうことがわかりました 1 残りのタ ば 平均で細胞あたり1コピーの転写 タグプロファイリングでは位置が特定 グは重複遺伝子やリピート配列にマッ 産物が回カウントされることになり できるあるいは1塩基ペアタグを チするものです タグプロファイリングは多様な mrnaの特徴付けに適しています 図: 定量PCRと高い相関を示すタグプロファイリング結果 1 r =.93 slope = 1. - - - SAGE法の倍以上の感度をもつタグ プロファイリングは 圧倒的なカバ DpnII Tags vs. qpcr Data Fold Change Ratio (Brain/UHR) qpcr Fold Change Ratio (Brain/UHR) qpcr NlaIII Tags vs. qpcr Data Fold Change Ratio (Brain/UHR) DGE レッジ深度を誇ります フローセルの 1 r =.933 slope =.97 1レーンでサンプルあたり数百万のタ グを解析するため 効率的なダイナ ミックレンジと優れた再現性をもち 低発現転写産物も検証することができ ます 図7 - - - Fold Change Ratio (Brain/UHR) DGE MAQCサンプルを用いた実験では 定量PCRとタグプロファイリングの相関は.93以上の 結果を示しています 定量PCRで調べた9とのRefSeq遺伝子は NaIIIおよびDpnII プロトコールで定量化されました マイクロアレイデータとは異なり 発現比の圧縮は観 察されず 傾きは1に近い値となっています 一般に 細胞あたり1コピーの転写 産物は およそ3,ある転写産物 の1コピーに相当する と言われてい ます シーケンスデータを万単位 のテンプレート TPM: templates per million で表示させると Genome
DATASHEET: ILLUMINA RNA ANALYSIS Analyzer 1 3TPM 1 1 MAQC PCR mrna 1 cdna NlaIII mrna NlaIII DpnII mrna-seq mrna-seq Genome Analyzer Pipeline Genome Analyzer Pipeline G e n o m e S t u d i o RNA-Sequence 9 3 csnp 9: GenomeStudio RNA-Sequence 1 Pipeline NCBI RefSeq UCSC GenomeStudio RNA-Sequence SNP
Small RNA Small RNA Small RNA - Small RNA Small RNA Small RNA PCR RNA RNA Genome Analyzer Small RNA Small RNA Genome Analyzer 1 Small RNA Small RNA Small RNA cdna Cluster Station RNA Small RNA 99.% Genome Analyzer 1 Small RNA : Small RNA SMALL RNA NAME Genome Analyzer Small RNA, 11 RNA Small RNA CONTENT hsa-let-7b 7,7 hsa-let-7f, hsa-let-7a,3 hsa-mir-rg- 1,931 has-mir-3 1,7 hsa-mir- hsa-mir-3a-3p RNASmall RNA Sanger mirna Small RNA 11: Small RNA mouse rat human dog RefSeq Genes Vertebrate Multi Alignment and Conservation G G G C T G C T A C G t c a t c g t c g t c a t c g t t a t c a t c a t G G G C T G C T A C G t c a t c g t c g t c a t c g t t a t c a t c a t G G G G T G C T A c g t c a t c g t t g t c a t c g t c a t c a t c a t G G G G T G C T G c g t c a t c a t t g t c a t c a t c a t c a t c a t Small RNA mirna 7 Small RNA (has-mir-9)
DATASHEET: ILLUMINA RNA ANALYSIS mrna-seq Small RNA RNA Small RNA RNA (1) Saha S, Sparks AB, Rago C, Viatcheslav A, Wang CJ, et al. () Using the transcriptome to annotate the genome. Nat Biotech : -1. () Rodriguez A, Vigorito E, Clare S, Warren MV, Couttet P, et al. (7) Requirement of bic/microrna-1 for normal immune function. Science 31(): 3. (3) Campbell TN and Choy FY () RNA interference: past present and future. Curr Issues Mol Biol 7(1):1- () Marsit CJ, Eddy K, Kelsey KT () MicroRNA responses to cellular stress. Cancer Res ():3-. () Lu C, Tej SS, Luo S, Haudenschild CD, Meyers BC et al. () Elucidation of the Small RNA component of the transcriptome. Science 39: 17-19
DATASHEET: ILLUMINA RNA ANALYSIS QUANTITY mrna-seq mrna-seq Sample Prep Kit RS--1 GAII Standard Cluster Generation Kit 3-Cycle Sequencing Kit 1 Tag Profiling Sample Prep Kit GAII Tag Profiling Cluster Generation Kit 1-Cycle Sequencing Kit 3-Cycle Sequencing Kit Small-RNA Small RNA Sample Prep Kit GAII Small RNA Cluster Generation Kit 1-Cycle Sequencing Kit 3-Cycle Sequencing Kit PhiX NlaIII DpnII NlaIII DpnII FC-- FC-- FC--7 FC-- 1 1 FC--31 FC--3 FC--9 FC-- 1 PhiX v Control Kit CT-91-1 Genomic Sequencing Primer Kit CT-91- Genome Analyzer II IIx Genome Analyzer -1 3- -3-7 -13-13 F Tel (3)7- Fax (3)7- www.illuminakk.co.jp 9 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina illuminadx Solexa Making Sense Out of Life Oligator Sentrix GoldenGate DASL BeadArray Array of Arrays Infinium BeadXpress VeraCode IntelliHyb iselect CSPro GenomeStudio Illumina Pub. No. 7-9-J9 11JUN9