質量分析セミナー autoflex III LRF 韮澤崇 Bruker Daltonics K.K.
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization マトリックス支援レーザー脱離イオン化 2
MALDI の基本原理 Matrix と Sample の混合結晶 LASER による Matrix の励起 脱離およびイオン化 ( プロトン化 ) LASER H + ソフトなイオン化多価イオンを生成しづらい 3
TOF-MS の基本原理 Laser P1 G M + m + 20kV ion source drift region detector 1 E= mv 2 =Uz 2 t~ m/z m M t( s) イオンの飛行速度 : おおよそ数 10km/ 秒 ( マッハ 100 以上 ) 4
Principle of Time-of-Flight Mass Spectrometry (TOF-MS) 5
高感度測定用サンプルターゲットプレート AnchorChip technology 6
Principle of AnchorChip TM Sample Preparation Dried Droplet AnchorChip Hydrophobic coating 7
Size Comparison: Dried Droplet vs. AnchorChip TM Matrix: 2,5-DHB 200μm アンカー使用時 2 mm 8
Peptide Mix on AnchorChip TM vs. Dried Droplet Matrix: -HCCA Anchor Diameter: 400 m 10 fmol 100 amol 1400 1900 2400 2900 m/z 1400 1900 2400 2900 m/z 1 fmol 10 amol 1400 1900 2400 2900 m/z 5 amol 1400 1900 2400 2900 m/z 1400 1900 2400 2900 m/z 9
In-Gel Digest: Anchorchip Preparation 同一条件による比較 c/o Christine Gauss, GPC 10
アプリケーション 分子量の測定 タンパク質 DNA 低分子 合成高分子 タンパク質の同定 ( 電気泳動で分離精製 ) PMF/PFF 未知タンパク質の配列解析 ( トップダウン解析 ISD) 11
分子量の測定 Matrix: SA Positive Linear mode もし鎌形赤血球貧血症だと -30 -globin -globin -globin: 6 Glu Val コード :GAG GUG 12
IgG 150kDa in SA matrix; Positive Linear mode Intens. [a.u.] 8000 [M+H] + [M+2H] 2+ 6000 4000 2000 0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 225000 250000 m/z 13
DNA 測定例 Intens. [a.u.] x10 4 1.5 DNA 30mer 6118 9192 1.0 DNA 20mer 0.5 0.0 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z 14
DNA 測定例 x104 1.2 Intens. [a.u.] 1.0 0.8 0.6 0.4 7694 15395 * 50mer_GP2\0_G6\1\1SLin 50mer 0.2 0.0 x104 1.5 Intens. [a.u.] 1.0 0.5 7431 11026 21839 * 70mer_GP2\0_H6\1\1SLin 70mer 0.0 x104 Intens. [a.u.] 3 * 99mer_GP2\0_G8\1\1SLin 2 10246 15120 30101 99mer 1 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 m/z 15
分子量の測定 Intens. [a.u.] x10 4 1.2 1.0 484.244 0.8 0.6 0.4 462.280 0.2 0.0 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 m/z 16
分子量の測定 MS/MS スペクトル possibly sugar moiety possibly fatty acid moiety 17
分子量の測定 Intens. [a.u.] x10 4 1.50 元素組成解析 1.25 1199.773290 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 1200 1220 1240 m/z 18
Polymer 解析 a.i. 4000 3500 複雑な多成分系からなる混合物の同定 分子量 構成パターン 3000 2500 2000 1500 Matrix:Dithranol 1000 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 m/z 19
Polymer 解析 Intens. x10 9 1.0 PPG PPG PPG PPG PPG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG 0.8 PS PS PS PS PS PS 0.6 0.4 0.2 0.0 2600 2700 2800 2900 3000 3100 m/z 20
タンパク質の同定 分離精製方法の違いにより同定までのプロトコルが異なる 2 次元電気泳動での分離精製後のサンプルは が用いられる 21
ゲル内消化プロトコル 22
ゲル内消化プロトコル 23
タンパク質の同定 (*Mascot は Matrix Science 社製 ) 切り出し 消化 2D-PAGE 抽出 データベース検索 (biotools/mascot) m1 m2 m3 m1 レーザーピークリスト m2 m3 MALDI 調製 m/z 24
Protein Identification PMF 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 MALDI MS Peptide Fingerprint 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 25
酵素消化物スペクトルから MASCOT PMF Search へ ~Biotools & MASCOT~ (*Mascot は Matrix Science 社製 ) Biotools software MASCOT search 26
タンパク質の同定 27
タンパク質の同定 スポット 2 PMF 28
タンパク質の同定 Combined LIFT(MS/MS) Search 4 つの PSD MS/MS スペクトルをコンバインすると ウシのアルブミンがヒット しかも高スコア 29
タンパク質の修飾解析 アミノ酸配列 ( 候補 ) を算出 30
タンパク質の修飾解析 N 端が修飾されているとすると よって修飾は Kが修飾されているとすると 良く一致 N 端ではなく Kから先が一致せずに存在と判定 31
未知タンパク質の配列解析 Sample Target Precursor Ion Selector (PCIS) Source 2 (LIFT) CID LID/T³ ISD Gridless DE MALDI Source Ion Source Collision Cell 32
未知タンパク質の配列解析 ISD ( In Source Decay) フラグメントイオンの種類 N- 末端イオン ISD a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3 H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH Fohlmann et al. (1988) IJMSIP 86, 137 R 1 R 2 R 3 R 4 x 3 y 3 z 3 x 2 y 2 z 2 x 1 y 1 z 1 *ISD では c- および y-ion が特徴的に観測される C- 末端イオン N- H N R1 O ISD ca. 1.5-12kD N H R2 O H N R3 O N H R4 O H N H N R1 O N H ISD ca. 1.5-12kD R2 O H N R3 O N H R4 O H N -C c i c i+1 c i+2 c i+3 yi+3 yi+2 y i+1 y i C-ion series Y-ion series 33
未知タンパク質の配列解析 T 3 -sequencing(terminus analysis by TOF/TOF) Protein Sequence ISD fragmentation N 1 4kDa N c-ion Invisible due to matrix peaks C Invisible due to matrix peaks y-ion C 4 1kDa T 3 -sequencing (ISD+LIFT) N N N-terminal peptides C-terminal peptides C C ISD は intact のタンパクから直接シークエンスに関する情報を得ることができる 優れた手法であるが 末端部分 ( 低分子量領域 ) についてはマトリックス由来のピーク群に隠されてしまうために 情報が得られない T 3 -sequencing はそれを補うためのもので ISD と LIFT(TOF/TOF による MS/MS 測定 ) を組み合わせた MS/MS/MS 的な測定手法である ISD によって生成した c-ion もしくは y-ion を選択し その MS/MS を行うことで末端部分のシークエンス解析が可能になる 34
未知タンパク質の配列解析 Intens. [a.u.] 8000 BSA 66kDa 6000 66431 4000 2000 33295 198470 132549 0 50000 100000 150000 200000 250000 m/z 35
未知タンパク質の配列解析 BSA 66kDa reisd D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H Ion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 c D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T CV A D ES HA G C E K S L H y D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13121110 Abs. Int. * 1000 c A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T G C E K S 36 34 32 30 28 26 4083.927 c 35 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 1036.498 c 9 899.441 c 8 828.424 c 7 1192.612 c 10 1467.782 c 12 1339.688 c 11 1582.816 c 13 1752.927 c 15 1695.902 c 14 2011.008 c 17 1881.974 c 16 2148.069 c 18 2423.219 c 20 2295.152 c 19 2480.255 c 21 2593.325 c 22 2805.474 c 24 2692.398 c 23 2989.576 c 26 2918.552 c 25 3223.651 c 28 3136.630 c 27 3351.694 c 29 3627.812 c 31 3514.744 c 30 3986.893 c 34 3883.905 c 33 3755.851 c 32 4345.987 c 37 4230.953 c 36 4475.009 c 38 4612.044 c 39 4839.162 c 41 4711.090 c 40 4952.178 c 42 5165.283 c 44 5051.279 c 43 5407.398 c 46 5294.316 c 45 5508.402 c 47 5637.420 c 48 5855.513 c 50 5784.453 c 49 6085.513 c 52 5984.328 c 51 6954.781 c 61 6897.785 c 60 7186.657 c 63 7057.730 c 62 7401.817 c 65 7314.788 c 64 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 m/z 36
reisd による修飾部位解析 Intens. [a.u.] x104 2.0 1.5 Protein A Mb 0:C2 MS Raw 1.0 0.5 Intens. [a.u.] 0.0 6000 Protein A+mod?? Mb-K45He 0:C1 MS Raw 4000 reisd!!! 2000 0 15000 16000 17000 18000 19000 20000 m/z 37
reisd による修飾部位解析 Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A 120 100 80 60 40 20 y 11 c 11 y 30 y 35 y 44 y 46 y 25 y 28 y 33 y 49 c 35 y 40 y 43 y 45 c 22 c 25 c 28 y 32 y 38 y 48 y 50 c 40 c 34 y 42 c 43 y 13 y 17 c 20 c 30 c 32 y 37 y 47 y 21 y 24 c 27 c 48 y 39 y 15 y 41 c 42 c 13 c 17 c 19 c 21 c 24 c 26 c 29 y 31 c 37 c 45 c 47 y 34 c 39 c 15 c 41 y 12 y 16 y 18 y 20 c 23 y 23 y 27 c 31 y 36 c 44 c 46 c 33 c 38 c 49 y 14 y 29 c 16 c 18 c 12 y 19 y 22 y 26 c 36 c 14 y 53 y 58 y 52 y 55 y 57 y 59 y 51 y 54 y 56 c 57 y 60 c 50 c 52 c 54 c 56 c 59 c 51 c 53 c 55 c 58 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 m/z Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K* F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A H S Q A L P 180 160 140 120 100 80 60 40 20 y 29 c 29 c 25 y 28 y 18 c 24 y 34 y 17 c 21 y 23 c 28 y 33 y 38 y 44 c 16 c 20 y 40 c 23 y 24 y 27 y 32 y 35 y 37 y 42 y 46 y 13 y 15 c 18 y 20 c 27 y 39 c 32 c 35 y 41 y 43 y 45 y 12 y 14 c 17 y 22 c 19 y 26 c 37 y 31 c 34 c 40 c 43 c 12 y 47 c 14 y 16 y 19 c 22 c 26 c 36 y 30 c 31 c 33 c 39 c 42 y 11 c 13 c 15 y 21 y 25 y 36 c 38 c 41 c 44 c 30 c 11 y 48 y 50 y 49 y 57 c 51 c 50 y 53 c 48 c 47 y 60 c 46 y 56 y 59 y 64 y 55 c 53 y 63 y 51 c 49 c 52 y 61 c 56 y 66 c 55 y 65 y 52 c 45 y 58 c 54 c 57 c 59 y 54 y 62 c 58 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 m/z 38
reisd による修飾部位解析 Intens. [a.u.] x104 3 Mb-ISD 0:H2 MS Raw AA43 F AA44 D AA45 K AA46 F AA47 K AA48 H 4802.516 2 4917.527 5192.656 5045.607 5320.722 1 Intens. [a.u.] x104 5 F D AA43 AA44 AA45+Mod!!! Mb-K45He-ISD 0:F2 MS Raw 4765.613 4 5131.926 3 2 1 4802.600 4880.620 4917.625 5278.962 5356.777 4700 4800 4900 5000 5100 5200 5300 5400 m/z 39
9833 reisd による DNA 配列解析 m/z 40 946 1171 1485 1790 2200 2277 2588 2896 3226 3729 3845 4034 4348 4486 4776 4851 4967 5082 5256 5506 5890 6124 6508 6822 7111 7441 7730 7979 8283 8596 8903 9215 2317 3415 2080 2491 3030 4637 2700 9503 9699 9736 x10 5 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 T A T C G C G T A T A C G C G T A T A C G C G T A T A T A T C G C G T A T A C G C G T A T A C G C G T A T A 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Intens. [a.u.]
www.bruker.com ブルカー ダルトニクス株式会社 本社営業部 221-0022 横浜市神奈川区守屋町 3-9 TEL: 045-440-0471 FAX: 045-453-1827 営業担当 : 志村信之 Nobuyuki.Shimura@bruker.com アプリケーション TEL:045-440-0478 担当 : 韮澤崇 Takashi.Nirasawa@bruker.com サービス TEL:045-440-0841 Service.BDAL.JP@bruker.com 41