細胞の増殖と DNA 複製
細胞周期とその調節 M 期 G2 期 G1 期 G0 期 S 期 増殖
間期分裂準備 2h G2 期 細胞分裂 2h M 期 G1 期 ガン遺伝子による加速 S 期 Jun Fos Ras Myc G0 期静止期 WT1 p53 RB ガン抑制遺伝子産物によるブレーキング
11 3' 3' 複製のラギング鎖 複製のリーディング鎖 3' 3' 複製のリーディング鎖複製のラギング鎖 DNA ポリメラーゼは 3' 方向に複製していく. 複製のとっかかり ( プライマー ) が必要 =RNA リーディング鎖のコピーは一気に. ラギング鎖のコピーは小さい岡崎フラグメントをつなぎ合わせるやりかたで. このRNAプライマーは消失後すぐにDN Aリガーゼで修復される 3' 3' 末端 RNA は分解され消失する 3' 3'
複製基点の認識ヘリカーゼ二本鎖 DNAの水素結合切断 (ATPの消費) DNAジャイレース ( トポイソメラーゼ ):DNA 二本鎖切断 鎖を回転 切れ目を閉じる 1 本鎖 DNA 結合タンパク質 (SSB) 再会合 ( アニーリング ) の防止 RNAポリメラーゼ ( プライマーゼ ) 複製基点にRNAプライマー (4-15bp) を作る DNAポリメラーゼ RNAプライマーの後ろ (3 末端から ) に5 3 方向に合成 ( リーディング鎖 )
DNAポリメラーゼ RNAプライマーの後ろ (3 末端から ) に5 3 方向に合成 ( リーディング鎖 ) DNAポリメラーゼ : 二量体 ( リーディング鎖用とラギング鎖用 ) ラギング鎖の合成 DNAポリメーラーゼが鋳型配列を読み取る方向と合成方向が逆向きラギング鎖の鋳型鎖をねじってポリメラーゼの中を通す
細胞分裂と寿命の問題を考える 寿命はなぜ決まっているのか 老化 加齢の問題とは何か DNA 複製における末端の問題
加齢による機能の衰え = 老化老化 : 多細胞生物に固有の現象 単細胞生物 細胞分裂をしながら現在まで何億年も生存してきた. 多細胞生物 種に固有の平均寿命を持っている. 40 30 20 10 20 才 老化の現象 40 cm2の傷の治癒日数 30 才 40 才 0 0 14 28 42 56 70 この遅延化は, 1 細胞自身の持つ増殖能力にあるのか 細胞自身に原因を求める 2 細胞が増殖するために必要な細胞外環境にあるのか コラーゲンの劣化, ホルモンや免疫系の衰え血管系の障害の進行
細胞の分裂寿命 (Proliferative lifespan) 組織 トリプシンでほぐす シャーレにまく 1 PDL 2 代培養細胞
集団倍加レベル (Population doubling level=pdl) 仮に, 継代のたびに4 倍希釈でまき直せば1 継代毎に2PDLずつ増加 8 倍希釈してまき直せば3PDLずつ増加 * 初代培養でシャーレ一杯になるまでの分裂回数がわからないのでこれは無視する
ヒト胎児器官から分離した細胞の分裂寿命 起源組織 平均 PDL 心臓 9.85 肝臓 19.75 肺臓 46.24 いくらでも増殖を続ける細胞はない.100 回を越える分裂寿命を持つものはない 50 回の分裂の最期に近づくと増殖が次第に遅くなって細胞はG0 期にはいって戻らなくなる 分裂寿命は, 由来臓器によって異なる 分裂寿命は細胞固有の性質である
繊維芽細胞供与者の年齢と分裂寿命の関係 PDL 75 Martin ら 1970 50 25 0 0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 ( 才 )
老化を支配する遺伝子? 早く老化してしまう病気 ( 遺伝病 ) 遺伝的早老症 (Progeria) ワーナー症候群 (Warner Syndrome) PDL 75 繊維芽細胞分裂寿命と早老症 (Goldstein,1978) 50 対照群平均 25 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
細胞の分裂寿命は遺伝子に支配されている 1. ヒト遺伝子の構造 ヒト染色体細胞分裂中期の様相テロメア (telomere) セントロメア 細胞分裂に先立って複製された染色体がセントロメア ( 動原体 ) によって束ねられている
原核生物 ( 細菌 ) の遺伝子構造 真核生物 ( 菌類 高等植物 動物 ) の遺伝子構造 直鎖の 2 本鎖構造 端がある テロメア領域 テロメア領域 - TTAGGG TTAGGG TTAGGG -----3' 6 塩基を単位とする反復配列 (repeated sequence)(ttaggg)n. ヒトでは2,000 以上反復 (12Kb)
染色体の DNA 分子 遺伝子遺伝子遺伝子 5 3 テロメア サブテロメア テロメア サブテロメア
9 DNA 複製のたびにテロメアは短くなる 線状 2 本鎖 DNA の複製問題
11 3' 3' 複製のラギング鎖 複製のリーディング鎖 3' 3' 複製のリーディング鎖複製のラギング鎖 DNA ポリメラーゼは 3' 方向に複製していく. 複製のとっかかり ( プライマー ) が必要 =RNA リーディング鎖のコピーは一気に. ラギング鎖のコピーは小さい岡崎フラグメントをつなぎ合わせるやりかたで. このRNAプライマーは消失後すぐにDN Aリガーゼで修復される 3' 3' 末端 RNA は分解され消失する 3' 3'
1930 年代 B. McClintock H.J. M u ller 末端を欠いた染色体が融合しやすいことを発見 Muller : テロメア (telomere) という用語の提唱 1972 年 E.H. Blackburn ゾウリムシ ( Tetrahymena) でテロメアDNAの繰り返し配列を発見 1972 年 J.D. Watson 1973 年 A.M. Olovnikov 5 末端の末端複製問題の提起 5 末端の末端複製問題と分裂時計 細胞老化機構の関連について提案 1984 年 C.W. Greider テトラヒメナにおいてテロメラーゼ活性の検出
早老症患者の細胞のテロメアも短い kbp 10 5 0 早老症患者 対照群 (Allsopp ら 1992)
種々の年齢のヒトから採取された繊維芽細胞の分裂可能回数とテロメアサイズの相関 PDL 60 26-51 歳 0-25 歳 40 20 51-76 歳 5 7 9 11 平均テロメアサイズ (kb)
1988 年 C.W. Greider ヒト細胞の継代培養に伴うテロメア長の短縮の発見 1990 年 N.D. Hastie ヒト組織で年齢とともにテロメア長が短縮癌組織でテロメアが短い 1992 年 C.M. Counter テロメア短縮によって細胞の寿命がつきることを証明
短縮したテロメアの修復酵素 = テロメラーゼ (telomerase) (Blackburn 1991) TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-3' ATCC- 不完全な新生鎖 テロメラーゼによる伸長 TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA ATCC- AATCCCAAT TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA ATCC- GGGTTA AATCCCAAT TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGTTAGGGTT ATCC CCCAATCCCAATCCCAATCCCAAT- DNAポリメラーゼによる伸長
多細胞生物におけるテロメラーゼの発見 テロメラーゼ触媒ユニット遺伝子のクローニング Nakamura ら (1997) Meyerson ら (1997) Kilian ら (1997) 触媒サブユニットの遺伝子導入と発現 Weinrich ら (1997) 中山ら (1998)
Bordnar ら (1998) の実験 テロメラーゼ触媒サブユニット遺伝子をヒト網膜上皮細胞および線維芽細胞に導入し発現させた 培養細胞のテロメア長が長くなった培養細胞の分裂回数が 20 回以上増加した 網膜上皮細胞 54 回から74 回へ線維芽細胞 64 回から100 回 テロメアとテロメラーゼの機能についての最終証明
クローン羊ドリーのテロメア長は? 大人の羊の体細胞からクローニングしたので普通の子羊よりテロメアが短いはず? Shiels ら (1999) Nature May 27 日号 399 巻 :(316-317) Analysis of telomere lengths in cloned sheep ドリーのテロメア長が短いことを報告
有限寿命細胞 : テロメラーゼの発現がない 細胞の不死化 : テロメラーゼの発現が必申 _ 発生初期の細胞や生殖細胞 : テロメラーゼの発現の可能ォあり生殖細胞のテロメアは体細胞に比べ非常に長い 体細胞へ分化 : テロメラーゼ発現予制 ガン細胞とテロメア テロメラーゼ
PCR 法 PCR 法 (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis(1986) DNA のクローニングを必要とせず ごく微量の DNA があれば 標的遺伝子を簡便に解析できる 分子生物学 基礎医学 遺伝学 育種 薬学 臨床診断 犯罪捜査 考古学などなどの幅広い分野で利用され これらの分野の研究手法に一大革命をもたらした 1993 年 その功績を讃え Mullis にノーベル医学生理学賞が与えられた 5 - atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3 3 - taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5
5 - atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3 3 - taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5 加熱して 一本鎖に解離させる 確実に解離させるため 94 や 95 にする A-T と G-C では 水素結合の数が違うので結合力が異なり A-T の方が低い温度で解離する
A T 水素結合 2 3 G C
5 - atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3 5 atttactcca ctttcgatgg 5 3 - taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5 配列がぴったりするように人工的に合成した短い DNA 分子 ( プライマー ) をくっつける このとき 温度を下げる プライマー配列の AT-GC の割合でくっつく温度が異なる たいていは 55 前後 温度を下げすぎると でたらめにくっつく
Taq ポリメラーゼによる DNA 鎖合成 A G C T PPP PPP PPP PPP 合成する材料として dntp を加えてやる この反応は 72 でおこなう
72 でだいたい 10 分くらい反応させると 反応が完成する DNA のコピーは 2 倍になっている ふたたび加熱して 一本鎖に解離させる
Taq ポリメラーゼによる DNA 鎖合成 2 コピーが 4 コピー この調子で 25 サイクルくりかえすと 2 25 倍 =33,554,432 倍つまり 3000 万倍に増幅される プライマーの設計さえ間違えなければ 目的の遺伝子を大量に手に入れることができる