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やすもりさどひら
5 years ago
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1 リン酸化タンパク質のウエスタンブロット分析 - ビオチン化フォスタグを用いたケミルミ検出 - ヒトゲノム解析の完了とともに登場したタンパク質の機能解析プロテオミクスは 21世紀の新しい科学研究分野として注目を集めていますタンパク質のリン酸化は生体反応の制御機構や病態の発症に関連した重要な化学修飾反応ですタンパク質のリン酸化に関連したプロテオーム解析リン酸化プロテオミクスには生体内リン酸化タンパク質の全体像を分析する研究 32 技術が不可欠です従来のリン酸化タンパク質の解析では P標識したタンパク質を電気泳動で 32 分離した後オートラジオグラフィーで検出する方法が最も一般的です Pで標識されたタンパク質はセリンスレオニンチロシンのいずれのリン酸化も高感度で検出できますが人の場合には標識することが困難となり臨床研究には利用できません一方抗リン酸化アミノ酸抗体を用いたウェスタンブロッティング法は放射線管理区域外でも解析できることから放射性同位体を使わないため臨床研究にも適用できますしかし抗リン酸化セリン/スレオニン抗体は抗リン酸化チロシン抗体に比べて特異性および感度が低いという問題がありますフォスタグコンソーシアムはリン酸モノエステルイオン R-P32- を捕捉する機能性分子フォスタグ Phos-tag を利用したリン酸化プロテミクス技術を開発していますこのプロトコルで紹介するフォスタグ-化学発光検出法には以下のような長所がありますセリン/スレオニン/チロシンすべてのリン酸化体を高感度で検出できます実験操作は一般的なウェスタンブロッティング法とほとんど同じですビオチン化フォスタグは室温で保存できます一般的な科学実験施設で行えます BSAなどを使ったブロッキング操作は不要です抗体を用いたリプロービング解析ができます参考文献 1) Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule, Rapid Communications of Mass Spectrometry, 17, (2003),. Takeda, A. Kawasaki, M. Takahashi, A. Yamada, and T. Koike 2) Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc(ii) complex, Dalton Transactions, (2004), E. Kinoshita, M. Takahashi,. Takeda, M. Shiro, and T. Koike 3) Quantitative analysis of lysophosphatidic acid by time-of-flight mass spectrometry using a phosphate capture molecule, Journal of Lipid Research, 45, (2004), T. Tanaka,. Tsutsui, K. irano, T. Koike, A. Tokumura, and K. Satouchi 4) Production of 1,2-Didocosahexaenoyl Phosphatidylcholine by Bonito Muscle Lysophosphatidylcholine/Transacylase, Journal of Biochemistry, 136, (2004), K. irano,. Matsui, T. Tanaka, F. Matsuura, K. Satouchi, and T. Koike 5) Detection and Quantification of n-chip Phosphorylated Peptides by Surface Plasmon Resonance Imaging Techniques Using a Phosphate Capture Molecule, Analytical Chemistry, 77, (2005), K. Inamori, M. Kyo, Y. ishiya, Y. Inoue, T. Sonoda, E. Kinoshita, T. Koike, and Y. Katayama 6) ovel immobilized zinc(ii) affinity chromatography for phosphopeptides and phosphorylated proteins, Journal of Separation Science, 28, (2005), E. Kinoshita, A. Yamada,. Takeda, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike 7) Phosphate-binding tag: A new tool to visualize phosphorylated proteins, Molecular & Cellular Proteomics, 3, (2006) in press, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike -1-

2 使用する溶液Ａ液 Tris Buffered Saline 10 TBS １ℓ Tris acl ２Ｍ塩酸 p 7.5 に調製１ℓにメスアップＢ液 10% (v/v) Tween 20 水溶液 50 Tween 20 Ｃ液 1 TBS-T １ℓ Ａ液Ｂ液 0.10 M 1.00 M 12.1 g 58.4 g 0.9 ℓ 適量適量 10% (v/v) 5 45 Ａ液の 1/10 濃度 0.1% (v/v) Tween ℓ ℓ Ｄ液 0.1 M Phos-tag BTL メタノール溶液 0.13 Phos-tag BTL-104 または BTL M メタノール 10 mg 0.13 ボルテックスを使用して溶解させた後すぐにＥ液の調整に使用する S Phos-tag BTL-104 Mol. Wt.: 767 Phos-tag BTL-105 S Mol. Wt.: 880 Ｅ液 10 mm Phos-tag Biotin 溶液室温保存６ヶ月以内 Phos-tag BTL-104 の場合Ｄ液 0.13 Ｃ液 1.17 Phos-tag BTL-105 の場合Ｄ液 0.13 Ｃ液 1.00 冷蔵保存すると Phos-tag Biotin が分離することがありますＦ液 10 mm 硝酸亜鉛水溶液 50 硝酸亜鉛六水和物 FW. 297 Ｇ液 10 mm RP 結合型ストレプトアビジン溶液 ECL Streptavidin-orseradish Peroxidase conjugate Amersham Biosciences product code RP g 50

3 Phos-tag BTL RP 結合型ストレプトアビジン複合体の調整１以下の割合の各溶液を 1.5 遠心チューブ中で混合し複合体溶液Ｈ液 500μℓ を用意する室温で 30 分間静置するＣ液 1xTBS-T 469μℓ Ｅ液 10 mm Phos-tag Biotin 溶液 1 Ｆ液 10 mm 硝酸亜鉛水溶液 20μℓ Ｇ液 RP 結合型ストレプトアビジン溶液 10μℓ 1 μℓ ２Ｈ液を限外ろ過遠心式フィルターユニットマイクロコン YM-30, Millipore の限外ろ過カップに移す３室温 10 分間 14,000 g で遠心ろ過する４限外ろ過カップ中に残った溶液 10μℓ以下を 30 のＣ液で希釈するこれを PB-S 溶液とする PB-S 溶液は 4 で冷蔵保存した場合１ヶ月は安定です [Phos-tag BTL] ４ [RP 結合型ストレプトアビジン] トラブルシューティング１参照発光検出の前処理操作１ブロット膜が入る大きさのタッパーを用意しその中にブロット膜が十分に浸かる容量のＣ液 1xTBS-T を入れるブロッティング終了直後のブロット膜をこの液に浸ける注プラスチック手袋をして操作１ 10 を行う２液が溢れないようにタッパーに蓋をして室温で１時間以上振とうする３ブロット膜をＣ液によく馴染ませた後ブロット膜を乾燥させないように気をつけてハイブリダイゼーション反応用バックハイブリバックに入れるトラブルシューティング２参照４適量の PB-S 溶液をハイブリバックの中に入れる PB-S 溶液の容量の目安はブロット膜の面積５当たり１である５ハイブリバックの口を閉じる PB-S 溶液の漏れがないことを確認した後室温で 30 分間ハイブリバックを緩やかに振とうする６ブロット膜が入る小さいタッパーを用意しその中に適量のＣ液を入れるこの時のＣ液の容量の目安はブロット膜の面積 5 当たり 10 であるハイブリバックからブロット膜を取り出しＣ液に浸ける７Ｃ液の溢れがないことを確認した後室温で 5 分間タッパーを緩やかに振とうする８タッパーの蓋を外し傾けてＣ液を捨てるブロット膜を捨てないように注意する９タッパーに操作６と同じ容量のＣ液を入れるこの時ブロット膜がＣ液に十分に浸かっているか確認した後室温で 5 分間振とうする 10 ブロット膜から過剰なＣ液を捨てた後直ちに化学発光検出操作を行う注ブロット膜は絶対に乾燥させない -3-

4 ドットブロティング解析試料タンパク質点着したタンパク質の量 ng 非リン酸化タンパク質牛血清アルブミン ew England Biolabs ヒト血清アルブミン Sigma-Aldrich 炭酸脱水酵素 Sigma-Aldrich β-ガラクトシダーゼ Toyobo リン酸化タンパク質 α-カゼイン Sigma-Aldrich β-カゼイン Sigma-Aldrich 卵白アルブミン Sigma-Aldrich ペプシン Sigma-Aldrich 脱リン酸化タンパク質リン酸化タンパク質をアルカリフォスファターゼ Sigma-Aldrich で脱リン酸化処理したものブロット膜ポリフッ化ビニリデン PVDF 膜 ybond P, Amersham Biosciences トラブルシューティング３参照 ECL キット ECL -plus western blotting detection reagent Amersham Biosciences 化学発光検出装置 LAS 3000 イメージアナライザー富士フィルム一般的なＸ線フィルムによる検出も可能ですリン酸化タンパク質のドットブロット膜 PVDF 膜に様々なタンパク質をドットブロットし Phos-tag BTL-104 と RP 結合型ストレプトアビジンの複合体を用いた発光検出結果非リン酸化タンパク質である牛血清アルブミンヒト血清アルブミン炭酸脱水酵素 βガラクトシダーゼは全く検出されなかった一方リン酸化タンパク質赤色であるα-カゼイン β-カゼイン卵白アルブミンペプシンは数 ng の量まで検出したリン酸化タンパク質をアルカリフォスファターゼによって処理したものでは化学発光シグナルが完全に消失した -4-

5 ウエスタンブロティング解析試料タンパク質電気泳動にアプライしたタンパク質総量は両試料とも 50 上皮増殖因子 EGF 刺激前の A431 上皮癌細胞株の抽出液 Santa Cruz Biotechnology 上皮増殖因子 EGF 刺激後の A431 上皮癌細胞株の抽出液 Santa Cruz Biotechnology ブロット膜ポリフッ化ビニリデン PVDF 膜 ybond P, Amersham Biosciences トラブルシューティング３参照 ECL キット ECL -plus western blotting detection reagent Amersham Biosciences 化学発光検出ＬAS 3000 イメージアナライザー富士フィルム一般的なＸ線フィルムによる検出も可能です A431 細胞における EGF 刺激前後の二次元電気泳動 EGF 刺激によって検出されるスポットの数とその強度が増大している特に緑の四角で囲んだ部分にその様子が観察される 20kDa 以下の低分子量領域の赤で囲んだスポットは刺激後に ECL シグナルの強度が増し青で囲んだスポットは EGF 刺激により出現している Phos-tag BTL-104 を使用 -5-

6 Phos-tag Biotin 法で検出したブロット膜の抗体によるリプロービング解析使用する溶液Ａ液 0.5 M Tris-Cl p 6.8 １ℓ Tris 0.5 M 60.6 g 0.8ℓ ６Ｍ塩酸 p 6.8 に調製１ℓにメスアップＢ液適量 10% (w/v) SDS 水溶液１ℓ SDS 10% (w/v) Ｃ液 100 g 適量ストリッピング緩衝液１ℓ Ａ液 62.5 mm Ｂ液 2 % (w/v) 2-メルカプトエタノール 0.1 M リプローブ操作１ Phos-tag Biotin で検出した後のブロット膜を乾燥させないように検出装置から取り出す乾燥状態のブロット膜はメタノールに浸した後 1 TBS-T 溶液をたっぷり入れたタッパー中室温で１時間以上振とうしてブロット膜を液によく馴染ませる注プラスチック手袋を着用する２ブロット膜の面積５当たり 25 のＣ液の入ったタッパーにブロット膜を入れる室温で 20 分間振とうする注一般的な抗体のストリッピングと異なり加熱は不要です３ブロット膜の面積 5 当たり 25 の 1 TBS-T 溶液の入った別のタッパーに操作２のブロット膜を移す室温で 1 時間緩やかに振とうする４タッパーを傾けて 1 TBS-T 溶液を捨てるブロット膜を一緒に捨てないように注意するタッパーに操作３と同量の 1 TBS-T 溶液を入れ室温で 1 時間緩やかに振とうする５操作４をさらにもう一度繰り返しブロット膜からＣ液を完全に洗い取る６ブロット膜を乾燥させないように気をつけて抗体を用いた化学発光検出操作を行う -6-

7 使用した PVDF 膜前述の EGF 刺激後の細胞抽出液のブロット膜ストリッピング処理ずみ使用した抗体 RP 標識抗リン酸化チロシン抗体 PY20 Amersham Biosciences 抗リン酸化セリン抗体 Rabbit-Polyclonal Zymed Laboratories RP 標識抗ウサギ IgG 抗体 Amersham Biosciences ECL キット ECL -plus western blotting detection reagent Amersham Biosciences 化学発光検出ＬAS 3000 イメージアナライザー富士フィルム Phos-tag Biotin と抗体を使ったリプロービング解析 A: Phos-tag BTL-104 による検出像 B: A の点線で囲んだ領域と抗 ptyr 抗体でリプローブしたものとの重ね合わせ C: A の点線で囲んだ領域と抗 pser 抗体でリプローブしたものとの重ね合わせ B, C 中の緑色は Phos-tag BTL-104 で検出されたスポット B, C 中の赤紫色は抗体で検出されたスポット B, C 中の緑色と赤紫色のスポットが重なった部分は白色使用条件と注意事項 Phos-tag BTL-104 および Phos-tag BTL-105 は研究用です一般的な化学の使用法を理解している研究者により取り扱ってください人体や動物には絶対に使用しないでください匂いや刺激性はありませんが皮膚に付着したり目に入ったりした場合すぐに多量の水で洗い流してください -7-

トラブルシューティング１Ｅ液 10 μℓ 中の Phos-tag Biotin 量はこのプロトコルで使用したロットの RP 結合型ストレプトアビジン量１μℓ に比べて大過剰になっていますそのためＥ液は１μℓまで少なくしてもほぼ同じ結果が得られました各ユーザーが購入した RP 結合型ストレプトアビジン溶液に適した量の Phos-tag Biotin 量を検討してください

8 トラブルシューティング１Ｅ液 10 μℓ 中の Phos-tag Biotin 量はこのプロトコルで使用したロットの RP 結合型ストレプトアビジン量１μℓ に比べて大過剰になっていますそのためＥ液は１μℓまで少なくしてもほぼ同じ結果が得られました各ユーザーが購入した RP 結合型ストレプトアビジン溶液に適した量の Phos-tag Biotin 量を検討してください通常はこのプロトコルの使用範囲１ 10 μℓでよいと思います Phos-tag Biotin 溶液の量を少なくした場合でも硝酸亜鉛溶液の量を変える必要はありませんトラブルシューティング２Ｃ液がブロット膜に十分しみ込んでいない場合全体のバックグラウンドが高くなりブロットされたタンパク質部分のみが白く抜けたような発光しない結果になりますバックグラウンドはまだらに発光します Phos-tag Biotin を使った検出法では長時間液に浸すブロッキング操作を行わないため PVDF 膜がＣ液をはじいていないことを必ず確認してから次の操作に移ってください失敗例タンパク質部分が白く抜けて見えるトラブルシューティング３ニトロセルロース膜を使用すると化学発光検出の感度が悪くなります PVDF 膜を使用してくださいケミルミ検出の説明図 Edited by Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike フォスタグコンソーシアム: フォスタグ and Phos-tag are registered trademarks of Tohru Koike. -8-

プロトコール集 ( 研究用試薬 ) < 目次 > 免疫組織染色手順 ( 前処理なし ) p2 免疫組織染色手順 ( マイクロウェーブ前処理 ) p3 免疫組織染色手順 ( オートクレーブ前処理 ) p4 免疫組織染色手順 ( トリプシン前処理 ) p5 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理 ) p6 免疫

プロトコール集 ( 研究用試薬 ) < 目次 > 免疫組織染色手順 ( 前処理なし ) p2 免疫組織染色手順 ( マイクロウェーブ前処理 ) p3 免疫組織染色手順 ( オートクレーブ前処理 ) p4 免疫組織染色手順 ( トリプシン前処理 ) p5 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理 ) p6 免疫 < 目次 > 免疫組織染色手順 ( 前処理なし ) p2 免疫組織染色手順 ( マイクロウェーブ前処理 ) p3 免疫組織染色手順 ( オートクレーブ前処理 ) p4 免疫組織染色手順 ( トリプシン前処理 ) p5 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理 ) p6 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理後マイクロウェーブまたはオートクレーブ処理 )p7 抗原ペプチドによる抗体吸収試験 p8 ウエスタンブロッティング