Agilent's Next Generation Mciroarray System - 1 Million Feature Platform

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1 earray7.6 ベイト設計ガイド SureSelect ターゲットエンリッチメントシステムカスタムキット 概要 p2~11 DNA キャプチャキット p12~ BaitGroup の作成 p23~ Library の作成 p58 ~ Quote の作成 p70 ~ RNA キャプチャキット p75~ BaitGroup の作成 p78~ Library の作成 p58 ~( 上記 DNA キャプチャと同じページをご参考ください ) Quote の作成 p70~( 上記 DNA キャプチャと同じページをご参考ください ) 既存のカタログキット ( ライブラリ ) に追加するライブラリの作成 p87~ SureSelect データ解析時の Build に関する注意点 p108~ version 3.4 with the Wizard はライブラリ作成途中での内容確認ができないので使用を推奨していません

2 変更箇所 Version3.4の主な変更箇所 Repeat Maskに関する推奨の変更 Version3.3の主な変更箇所 キャプチャ性能を最大にするためのMaximize Performanceの機能の記述を追加 Exon Interval FinderでのUTRを除く機能の記述を追加 Windows Maskerの機能の追加 Supplemental Libraryの作製および追加方法のUpdate Version3.2の主な変更箇所 RNAキャプチャ製品のデザイン方法の記述を追加 DNAキャプチャの複数 ELID 製品 ( 最大 34Mb,5ELID 分 ) のデザイン方法の記述を追加 カタログプラスカスタムキットに関する記述のUpdate Version3.1.3の変更箇所 イネ アカゲザル マーモセット メダカゲノムを追加 (2010 年 10 月時点 ) SureSelect 新製品を追加 Version3の変更箇所 ゲノムBuild 情報を追加 (2010 年 5 月時点 ) インデックスカスタムキットに関する記述を追加 Human All Exonプラスカスタムキットに関する記述を追加 Version2の変更箇所 Exon Interval Finder Interval Finder 機能の記述を追加 その他細かい説明の追加 Slide 2

3 DNA キャプチャキットと RNA キャプチャキット DNA キャプチャ用キット キャプチャ対象はゲノム DNA です 最大 34 Mb までのターゲット領域がキャプチャできます キャプチャしたいゲノム DNA 上のエクソンまたは任意の領域にベイトがデザインされます エクソンキャプチャ キャプチャしたい領域設定 Bait RNA キャプチャ用キット キャプチャ対象は転写産物です 最大 6.8 Mb までのターゲットがキャプチャできます キャプチャしたい転写産物の配列に対してベイトがデザインされます Slide 3

4 インデックス (Index) キット 複数のサンプルを 1 レーンもしくは 1 区画に混合してシーケンスする手法です マ ルチプレックスシーケンスまたはバーコードシーケンスとも呼ばれます 個々の サンプルを識別するために 各サンプルの DNA フラグメントには 固有のインデ ックス ( バーコード ) 配列を付加させます SureSelect のプロトコルでは イン デックス配列の付加は ベイトによるキャプチャ (Enrichment) の後の PCR の 過程で行われます カスタムデザインのキットで Bait がカバーするターゲット領域が 3Mb 未満の場 合 インデックスキットが自動的に選択されます インデックス ( バーコード ) 配列サンプルごとに異なる配列 異なるバーコード配列を付けた複数のサンプルを混合してシーケンス Adapter1 サンプルの配列 Internal Adapter Adapter2 Slide 4

5 カタログキットとカスタムキット 目的のキットがカタログ製品にない場合 earray を使用してカスタムキットを作成できます カスタムキットは ターゲットサイズまたは ELID 数によって価格が変わります DNA キャプチャ用カタログキット Human All Exon 50Mb キット Human All Exon V2 キット Human All Exon キット Human Kinome キット Human Chr X キット Mouse All Exon キット RNA キャプチャ用カタログキット Human Kinome RNA キット DNA キャプチャ用カタログプラスカスタムキット DNA キャプチャ用カスタムキット対応生物種全 15 種類 DNA Capture MP1 DNA Capture MP2 DNA Capture MP3 DNA Capture MP4 DNA Capture MP0 DNA Capture 2ELIDs DNA Capture 3 ELIDs DNA Capture 4 ELIDs DNA Capture 5 ELIDs < 200kb 200kb - 500kb 500kb 1.49Mb 1.5Mb 2.99 Mb 3Mb 6.8Mb 最大 13.6Mb 最大 20.4Mb 最大 27.2Mb 最大 34.0Mb RNA キャプチャ用カスタムキット対応生物種全 77 種類 Human All Exon 50Mb プラスキット Human All Exon V2 プラスキット Human All Exon プラスキット Human Kinome プラスキット RNA Capture MP1 RNA Capture MP2 RNA Capture MP3 RNA Capture MP4 RNA Capture MP0 < 200kb 200kb - 500kb 500kb 1.49Mb 1.5Mb 2.99 Mb 3Mb 6.8Mb Slide 5

6 SureSelect XT キット gdna の抽出 ライブラリの作成 キャプチャハイブリダイゼーションまで必要な試薬がセットになったキットです インデックスアダプタも必要数含まれており 安心して使用することができます 対応次世代シーケンサ : イルミナ Genome Analyzer ペアエンドマルチプレックスシーケンス Applied Biosystems SOLiD フラグメントライブラリ ペアエンドライブラリバーコードシーケンス 必要な反応数のインデックスアダプタは含まれます Herculase II AM Pure ビーズなど他に実験に必要な試薬類があります Slide 6

7 SureSelect earray のフローログインからオーダーまで ログイン ターゲットに Bait デザイン ライブラリ作製 ライブラリの注文 Library ユーザー登録無料! ご利用約款への同意が必要です 2011 年 7 月時点 DNA キャプチャ用では 15 種類 RNA キャプチャ用では 77 種類の生物種をサポートその他のゲノムは独自デザインの Bait を Upload Bait Group1 Bait Group 2 Bait Group 3.. ターゲット領域 1 キットあたり DNA キャプチャ用では約 100kb~34Mb RNA キャプチャ用では約 100kb~6.8 Mb 10 反応分からオーダー可能 April 2009 Page 7

8 用語と定義 Bait: ベイト ゲノムのターゲット領域に相補的な配列をもつ 120base の長さのシングルオリゴシーケンス 釣りの例えからの用語ゲノム DNA の池 (Pond) の中のターゲット 領域を釣ってくるためのエサ (Bait) Bait Group: ベイトグループ ひとつ もしくは複数のターゲット領域にデザインされた Bait のグループ Library: ライブラリ ひとつ もしくは複数の Bait Group から成る ひとつのキットとして製造されるオリゴのセット

9 用語と定義 ELID (Enrichment Library ID) SureSelect ライブラリの ID 番号です この番号により 個々のライブラリが認識されます earray から情報を得るときや オーダーの際に必要となる番号で重要な情報です カスタムキットを作製してオーダーする際は 必ずこの番号を記録しておくようにします 1ELID に入れられる最大ベイト数 57,680 です SureSelect のベイトはまずアレイとして製造され アレイから切り離されてビオチン化 crna に転写されます アレイ 1 枚に搭載できるスポット数が 1ELID のベイト数の上限となります 1 キットに入れられる最大 ELID 数 ベイト数が 57,680 を超えると ELID の数が増えていきます DNA キャプチャの場合 ひとつのキットには 5ELID( 最大 34Mb) まで入れることができます キットの型番と価格は ELID の数によって変わります RNA キャプチャキットは 1ELID のみです Roche のキットも 1ELID のみの対応です Slide 9

10 はじめに Agilent earray へのアクセス アクセス : はじめてのアクセスの場合 Request for Registration が必要 参考 ; 登録に関する資料 レジスタには アドレスが必要 登録には多少お時間 をいただきます Slide 10

11 Agilent earray アプリケーションの選択 Application Type を選択 Switch Application Type をクリックして DNA キャプチャの場合 SureSelect Target Enrichment を選択 RNA キャプチャの場合 SureSelect RNA Enrichment を選択 SureSelect Target Enrichment DNA キャプチャ SureSelect RNA Enrichment RNA キャプチャ Slide 11

12 Slide 12 DNA キャプチャキット

13 earray がサポートしているゲノム 2011 年 7 月時点 1/2 (Build にご注意ください!) ヒト H. sapiens, UCSC hg19, GRCh37, February 2009 (2010 年 5 月 1 日より hg18 から hg19 に変更 ) マウス M. musculus, UCSC mm9, NCBI Build 37, July 2007 ラット R. norvegicus, UCSC rn4, HGSC Version 3.4, November 2004 イヌ C. familiaris, UCSC canfam2, v2.0, May 2005 ウシ UCSC bostau4, Baylor build Btau_4.0, October 2007 もしくは UMD UMD3.1, UMD build UMD_3.1, August 2009 ニワトリ G. gallus, UCSC galgal3, WUSTL v2.1, May 2006 ショウジョウバエ D. melanogaster, UCSC dm3, BDGP Release 5, April 2006 線虫 C. elegans, UCSC ce4, WormBase WS170, January 2007 出芽酵母 S. cerevisiae, UCSC saccer1, SGD, October 2003 分裂酵母 S. pombe, NCBI Build 1.1, February 2002 Slide 13

14 earray がサポートしているゲノム 2011 年 7 月時点 2/2 (Build にご注意ください!) アラビドプシス A. thaliana, TAIR 10, November 2010 イネ O.sativa, IRGSP5, June 2008 アカゲザル M. mulatta, UCSC rhemac2, Dpse_2.0, January 2006 マーモセット C. jacchus, UCSC caljac3, WUGSC 3.2, March 2009 メダカ O. latipes, UCSC orylat2, NIG/UT MEDAKA1, October 2005 ゼブラフィッシュ D. rerio, UCSC danrer6, Sanger Zv8, December 2008 Slide 14

15 earray の SureSelect アプリケーションで行うこと 1. シーケンスで読みたい領域 ( ターゲット ) を決定 2. ターゲット領域に対して Bait をデザイン 3.Bait Group を集めたライブラリを作成 Enrich したい領域 ゲノム DNA Target interval Bait Bait Group1 Bait Group2 Library gdna のどの位置でもターゲット領域として設定可能 Slide 15

16 遺伝子名や RefSeqID でエクソン領域をサーチし ベイトデザインが可能 [ ステップ 1] ベイトを作成したい遺伝子のリストを準備 GeneSymbol, Accession ID でサーチ可能 [ ステップ 2] earray で目的遺伝子のエクソン領域 ( または全領域 ) をサーチ [ ステップ 3] サーチされた領域に対して ベイトライブラリを作成 Exon Interval Finder エクソン領域の位置のみをサーチ UTR を含む 含まないを選択可能 Interval Finder UTR と Intron も含めて遺伝子領域の位置をサーチ Bait 注 ) 本機能は UCSC でサポートされていないゲノムおよびメダカで利用できません ただし イネは Accession ID でサーチが可能です

17 メソッドの選択 Without the Wizard の選択を推奨 ( 本マニュアルでは Without the Wizard を解説 ) 利点 問題点 どんなときに使用するか Following the Wizard* ガイド付き 標準的な流れに沿ったガイド付き デザインの開始から Submit までガイド ライブラリが完成するまで詳細を確認できない Bait のデザインできなかった領域を示す fate ファイルにアクセスできない 最もシンプルなデザインをするときのみ実施 ( 基本的に推奨しない ) Independent of the Wizard ガイドなし Bait がデザインできなかったターゲット領域の確認が可能 パラメータを変えて Bait を再設計することが可能 各ターゲット領域に対して いくつの Bait が設計されたかなど デザインの詳細をライブラリ作成途中に確認可能 デザインのガイドがない ターゲットセットのデザインを最適化するために ある程度の試行錯誤が予想される時に使用 Slide 17

18 ライブラリ作成までのワークフロー キャプチャしたい遺伝子リストを準備している場合 キャプチャしたい遺伝子の エクソンまたはその遺伝子領域の 位置情報をサーチ サーチされた位置情報を 元にベイトをタイリング デザイン キャプチャしたい領域の位置情報を準備している場合 キャプチャしたい領域の 位置情報を入力 入力された位置情報を 元にベイトをタイリング デザイン Slide 18

19 ライブラリ作成までのワークフロー続き ターゲット領域に対して Bait をタイルし Bait Group を作成 Bait がデザインされなかった領域や デザインされた Bait の数を確認 Bait Group をまとめた Library 作成 ( 最小 Bait Group 数 =1) Library の Save と Submit 必要に応じて 設定を変更して Bait を再デザイン オーダー (Quote 作成 ) Slide 19

20 カスタムキット 2 種類の作成方法 独立したライブラリの作成下記の2 種類のカスタムキットの作成方法となります P.21 以降を参照ください カスタムキット インデックスカスタムキット カタログキットに追加するライブラリの作成カタログキットにカスタムキットを追加したライブラリの作成方法となります 独立したライブラリの作成方法とは異なりますので P.87 以降を参照ください Slide 20

21 独立したライブラリの作成方法 - カスタムキット - インデックスカスタムキット カタログプラスカスタムキットの作成については P. 87 以降を 参照ください Slide 21

22 カスタムキットとインデックスカスタムキット ( 重要 ) カスタムキットをデザインする場合 ターゲット領域に対して最終的に設計された Baits がカバーする領域の合計と シーケンサの種類やリード長により キットの種類が自動的に決定されます Bait がカバーするターゲット領域が 3Mb 未満の場合 インデックスカスタムキットが自動的に選択されますのでご注意ください 3Mb 未満のターゲットサイズでは インデックスではないキットを選択することができません インデックスカスタムキットを作成した場合は インデックス ( マルチプレックス / バーコード ) 用に Bait と試薬が最適化されるので インデックスキット用のプロトコルで実験を行う必要があります ベイトの数が 57,680 を超えると ELID の数が増えていきます ELID の数が複数になった場合 キットは自動的に SureSelect XT のタイプとなり インデックス対応のプロトコルとなります Slide 22

23 Bait Group の作成 Bait のデザイン ( 遺伝子リストから開始する場合 ) Baits のページを選択し Search をクリック Baits をクリック Search をクリック Search をクリックすると キャプチャ領域をサーチする画面に入る Slide 23

24 Bait Group の作成 search 方法の指定 Interval Finder か Exon Interval Finder のどちらかを選択 Interval Finder 指定した遺伝子の全領域の位置をサーチ Exon Interval Finder (UTR 含む ) 指定した遺伝子のエクソン領域の位置をサーチ ここにチェックを入れると既知の UTR を除外して Coding Exon 領域だけをサーチします Slide 24

25 Bait Group の作成 Interval Finder と Exon Interval Finder の例 Example: E2F1 Interval Finder result Exon Interval Finder result Slide 25

26 Bait Group の作成 Interval Finder と Exon Interval Finder 使用上の注意 入力またはUploadしたGeneSymbolやAccession IDが UCSCでサーチできるIDでないと サーチができません UCSCでサーチできないIDを使用すると サーチがおこわなれません ( エラーは出ません ) どのTermでサーチが行われなかったかは Download unfound terms で確認することができます 必ずサーチ後に サーチ対象の遺伝子についてすべてサーチが行われているかどうか Download unfound terms をクリックして 内容を確認してください 例 :ABL など下記の Term は この用語では UCSC に登録されていないので サーチされていません サーチできる用語に変更して サーチをやり直す必要があります Unfoundterm ABL BCL2ALPHA BCL2BETA CRK-II Slide 26

27 Bait Group の作成 search term と Species の入力 1. Search type を選択 Gene Symbol Accession No. または CytoBand ただし CytoBand の場合は Band 全体の領域になります 2. Search term を入力選択した Type に従って Search Term を入力します 3. Species を選択現時点でサポートしている生物種は限定されています 次ページ参照 4. Search をクリック 5. Search 結果が表示される Slide 27

28 Bait Group の作成サポートしている Species Slide 28

29 Bait Group の作成 Run Bait Tiling 1. ベイト設計を行う領域を選択します サーチされた領域すべて (Select Entire Result) もしくはエクソンを個別にチェックして選択 2. Run Bait Tiling を選択すると この領域情報が自動的に Bait Tiling 画面に入力されます Slide 29

30 Bait Group の作成複数の search term を入力する場合 1. Search type を選択 Gene Symbol Accession No. または CytoBand ただし CytoBand の場合は Band 全体の領域になります 3. Species を選択現時点でサポートしている生物種は限定されています p28 参照 2. Accession 番号 Cytoband または Gyne Symbol に Capture 対象のリストを入力 Option1. 画面に直接タイプする場合入力例 (Accessions) 記号で各 Accession 番号をセパレートする必要があります NM_ Q0055 NM_ Option2. テキストファイルを Upload する場合の入力例 (GeneSymbol) それぞれの GeneSymbol が異なる行に記載されている必要があります ファイルはタブ区切りテキストファイルとして保存してください カンマなどの記号は使用できません Slide 30

31 Bait Group の作成複数の search term での Search 結果 DownLoad Unfound Terms をクリックして サーチされなかった Term がないことを必ず確認してください (p.26 参照 ) 1. ベイト設計を行う領域を選択します サーチされた領域すべて (Select Entire Result) もしくはエクソンを個別にチェックして選択 2. Run Bait Tiling を選択すると この領域情報が自動的に Bait Tiling 画面に入力されます Slide 31

32 Bait Group の作成 Bait のデザイン Baits のページを選択し Bait Tiling をクリック Baits をクリック Bait Tiling をクリック Bait tailing をクリックすると Bait Group をデザインする設定画面に入る Slide 32

33 Bait Group の作成 Bait のデザイン 1. design job の名前を入れる. これが Bait Group の名前になります 2. Sequencing Technology と Design Strategy: Sequencing Technology を選択して Use Optimized Parameters をチェックするとアジレント社が現時点で最適化している条件が自動的に選択されます ( 詳細は次ページ ) パラメータを変更したいときは この選択を外します 4. Species: ターゲット領域の Enrichment の対象となるゲノムを選択します. ゲノムを選ぶと自動的に Build が決まります ( 変更できません ) 注意 ) 同じ名前でも入力できます ( 上書きされません ) 空白は使用できません 他にも使用できない記号があります 3.Strand 通常は Sense を指定します 注 ) 次ページ以降を参照 6.:Extend Interval Boundaries 3 and 5 5 の Genomic Target Interval Boundaries で入力した領域から 3 および 5 方向に延長した領域でデザインされます 5. Genomic Target Intervals: Enrich したいターゲット領域の位置情報を入れます 直接入力するか 前ページまでの方法でサーチするか 事前に作成したファイルを UpLoad します 位置 (Map 情報 ) の指定の方法は決まっています 次ページ以降の例を参照ください 7. Avoid Genomic Intervals: Repeat masked regions を除くために選択します earray7.6 から Default の設定は Windows Masker に変更になりました ( 次ページ以降参照 ) Windows Masker または RepeatMasker 以外に Bait をデザインしたくない領域があれば 位置情報を直接入力するか 事前に作成したファイルを UpLoad できます 8.Submit: 設定が終了した時点で Submit を選択します Slide 33

34 Sequencing Technology と Protocol 2011 年 7 月時点で 対応シーケンサは下記の通りです Illumina Genome Analyzer シリーズ, HiSeq シリーズ Life Technologies AB SOLiD シリーズ (5500 の PE はアーリーアクセス ) Roche 454FLX, Junior シリーズ Illumina protocol Single-End か Paired-End かで試薬が変わりますので使用する Protocol を選択してください Single-End もしくは Paired-End を選択すると Tiling Frequency は 2xtiling で Long Read(75bp+) を選択すると 1xtiling となります Long Read(75bp+) で 2xtiling を選択したい場合 次ページ以降を参照してください SOLiD protocol どちらを選択しても SureSelect 製品としては同じものとなります Roche protocol Long Read の Single End のみの対応となります Slide 34

35 Bait Group の作成 Design Strategy 1. Change the parameters: Use Optimized Parameters オプションの選択を外すと パラメータを変更できます 2. Centered versus Justified: ( 次ページ参照 ) Centered: まずターゲット領域の中央に Bait を置き そこからターゲット領域全体に等間隔になるように Bait をタイリングします ターゲット領域の末端では 通常 Bait が少しはみ出た状態になります Why use this? このデザインがもっともよくテストされています Justified: Bait はターゲットの末端からデザインされます ターゲット領域にきっちりおさまらない場合は 両末端をそろえた状態で すべての Bait の位置が少しずつシフトします ターゲット領域から Bait がはみ出すことはありません Why use this? ターゲット領域以外に Bait をデザインしたくない時に利用します 5. Allowed overlap into avoid regions: Centered baits を選択すると はみ出した Bait がターゲット以外の領域とオーバーラップします この場合 もしターゲットが Repeat Masked Region と隣り合っていたら ここで設定した長さのオーバーラップは許容されます オーバーラップを許容したくないときは 1bp を入力します 6. Strand: Sense 鎖を選択するとベイトは Sense 鎖でデザインされ 製品であるビオチン化 crna ベイトは antisense シーケンスとなります この crna ベイトが Sense 鎖の gdna をキャプチャしますが 最終的には PCR の過程がはいるため 両鎖がシーケンスされます 基本的には Sense 鎖を選択してください 3. Bait Length: 現時点では 120 bp が 唯一設定できる Bait の長さです 4. Bait Tiling Frequency: ( 次々ページ参照 ) 1X, 2X, 3X, 4X, and 5X は Bait 同士のオーバーラップの設定です ターゲットの末端では. この設定は適用されていません Default の推奨は 2xtiling です 1xtiling より 2xtilling の方がより高いキャプチャ効率が得られるデータがありますが 2xtiling 以上の頻度ではそれほど変化はありません ただし タイリング頻度を上げると より狭い もしくは小さなターゲットに対して カバー率を上げる可能性があります Slide 35

36 Bait Group の作成 Centered と Justified の違い Centered (Default で推奨 ) Justified (a) 大きなターゲット領域の場合 ( 2x tilingの例 ) target region baits Centered では bait はターゲット領域を超えて等間隔にデザイン Justified では bait はターゲット領域に末端を合わせてデザイン 一部タイリング頻度が設定と異なる部分ができる (b) ターゲット領域が Bait の長さのちょうど 2 倍の場合 Centered と Justified で同じ Bait がデザインされる (c) ターゲット領域が Bait より短い場合 Centered と Justified で同じ Bait がデザインされる

37 Bait Group の作成 Bait Tiling Frequency 1x tiling overlap: なし target region 2x tiling overlap: 60bp target region 3x tiling overlap: 40bp target region baits baits baits ベイトの重なりがないため 同じベイト数でターゲットをより広い領域で設定できる イルミナでは 75bp 以上の長さで読むことが必要 1xtiling よりもキャプチャ効率が上がるため Default の設定として推奨 これより高い Tiling Frequency ではキャプチャ効率はさほど変わらない 4x tiling overlap: 30bp target region 5x tiling overlap: 24bp target region baits baits

38 Bait Group の作成 Sequencing Technology と Bait Tiling Frequency Sequencing Technology Sequencing Protocol Bait Tiling Frequency - default setting Bait Tiling Frequency (Option) illumina Single-End 2x 2x, 3x, 4x, 5x illumina Paired-End 2x 2x, 3x, 4x, 5x illumina Single-End Long Read (75bp+) 1x 1x, 2x, 3x, 4x, 5x illumina Paired-End Long Read (75bp+) 1x 1x, 2x, 3x, 4x, 5x SOLiD end-sequencing 2x 1x, 2x, 3x, 4x, 5x SOLiD Paired-End 2x 1x, 2x, 3x, 4x, 5x Roche Single-End 2x 2x, 3x, 4x, 5x SOLiD の Paired-End シーケンスについては ベイト設計 アダプタ付き DNA の調製と SureSelect による キャプチャのプロセスはフラグメントシーケンス (end-sequencing) と全く同一です Slide 38

39 Bait Group の作成インデックスカスタムキットの Bait Tiling Frequency 3Mb 未満の領域をキャプチャするインデックスキットでは Tiling frequency を 1 x tiling にする必要がありません (1 x tiling は通常 2 x tiling の 1ELID でのキャプチャ上限を超えた 3.4Mb 以上の広い領域をキャプチャするために設定します ) 3Mb 以下のサイズのインデックスキットでは 2 x tiling の設定を推奨します illumina の Long Read(75bp+) を使用する場合でも より高いキャプチャ効率を重視する場合は 2xtiling を推奨します Slide 39

40 Bait Group の作成 Tiling Frequency が Coverage に与える影響 Genome Biology 2009, 10:R116 (doi: /gb r116) Slide 40

41 Bait Group の作成インデックスカスタムキットの Bait Tiling Frequency 変更 3Mb 未満の領域のキャプチャで イルミナの Paired-End Long Read を選択した場合 Use Optimized Parameter のチェックを外します Bait Tiling Frequency を 2x に変更します Slide 41

42 Bait Group の作成 Strand gdnaのキャプチャの場合 通常はSenseを選択します Senseを選択すると Sense 側のStrandをキャプチャするための crna Baitが製造されます キャプチャ後のPCRにより キャプチャされたsense 側のDNAは2 本鎖となり 両鎖がシーケンスされます Slide 42

43 Bait Group の作成 Target Intervals の入力フォーマット Option 2: ターゲットの位置情報 (the genomic interval) を含んだファイルを Upload : Upload する場合のフォーマットは下記の例を参照 Option 1. 直接この画面にタイプもしくは Copy&Paste で入力入力フォーマットは下記の例を参照してください chrx: chrx: chrx: chrx: chrx: 前述のサーチ機能を用いた場合 位置情報は自動入力されます それぞれの interval は 記号でセパレートされている必要があります カンマなどの記号は使用できません Interval の数が多いようなら Option2 の利用をお勧めします Option 3. ここをクリックすると 入力した interval から 3 方向または 5 方向にキャプチャ領域を拡張することができます ( 次ページ参照 ) それぞれの Interval は 異なる行に記載されている必要があります ファイルはテキストファイルとして保存してください カンマなどの記号は使用できません まず Upload をクリックし, 続けて Browse をクリックして Upload File を選択します. Slide 43

44 Bait Group の作成 Target Intervals 領域の拡張 ここをクリックすると 入力した interval から 3 方向または 5 方向にキャプチャ領域を拡張することができます 拡張するサイズは 3 側と 5 側で異なる値 (bp) を入力することができます Slide 44

45 Bait Group の作成 Repeat Masked Regions の選択 earray7.6 から新たな機能として追加 従来の Repeat Mask Repeat Masker と Window Masker の Intersection 領域で もっとも緩やかな Mask となります (Union ではないので 注意ください ) Repear Masker は UCSC RepeatMasker track の領域です Windows Masker の詳細は下記の文献をご参照ください WindowMasker による Repeat Mask は NCBI の Windows Masker tool の default parameters により行われます 実験の目的に応じて どちらか適切な方の Repeat Mask 機能を使用してください 判断に迷う場合は 従来から使用していた Repeat Masker 機能の使用を推奨します Slide 45

46 Bait Group の作成 Bait Group の Status の確認 Submit した Bait Group の Status は Home ページ ( 左図 ) の Pending Jobs か もしくは Baits ページ ( 右図 ) の下に表示され 確認できます さらに次の Step には Baits ページから進みます Slide 46

47 Bait Group の作成 View Design Details (I) Bait Group のデザインのサマリを見るには Baits ページの View Design をクリックします Slide 47

48 Bait Group の作成 View Design Details (II) Design Summary, Design Details, Target Fate, Fate Details File, Bed File のタブを切り替えて Bait のデザインを確認できます ( それぞれ最初の 100 行のみが表示されます ). Slide 48

49 Bait Group の作成 Download the Design (I) Baits ページの Download をクリックし Bait のデザインファイルをダウンロードします Slide 49

50 Bait Group の作成 Download the Design (II) downloaded zip には 以下の 5 種類のファイルが含まれます : Example of a Summary file: Example of a Fate file: Example of a FateDetails file: Example of a BED file: Example of a TDT (tab delimited table) file: Slide 50

51 Bait Group のチェック Bait がデザインされなかった Target の確認 MS-Excel で BaitTiling_fate ファイルをオープン Status でソートし Status が failed になっているか Pass していないターゲット領域を確認 Failed のターゲット領域は Genome build に正しくアサインできなかったもので 位置情報が 誤っている可能性があります Baits Generated でソートし bait がデザインできなかったターゲット領域を確認 例 BaitTiling_sum ( 左図 ): = 342 のターゲット領域に対し Bait がデザイン できなかった 具体的にどの領域に対して Bait がデザインできなかったかを BaitTiling_fate ( 右図 ) で確認 Slide 51

52 Bait Group のチェック UCSC Browser 上での Bait Design の確認 2010 年 4 月までにデザインされた SureSelect の bait は NCBI の Build36, hg18 のシーケンスに対してデザインされています 2010 年 5 月からデザインされた SureSelect の bait は GRCh の Build37, hg19 のシーケンスに対してデザインされています UCSC Browser を使用する場合 Build が一致していることを確認してください Add custom tracks ボタンを押します Slide 52

53 Bait Group のチェック UCSC Browser 上での Bait Design の確認 Browse で bed ファイルを選択し Submit を押します Bed ファイルが読み込まれるので Go to genome browser を選択します Slide 53

54 Bait Group のチェック UCSC Browser 上での Bait Design の確認 BED ファイルはカスタムトラックとして UCSC ブラウザに Upload され ターゲット領域に対して どのように Bait がデザインされたかを確認できます chrx のある領域のエクソンに対してデザインされた Bait の確認 Baits Genes RepeatMasker ひとつのエクソンに対してデザインされた Bait を Zoom して確認 Baits Genes RepeatMasker Slide 54

55 Bait Group のチェック Re-Tiling できる可能性のある Target 領域の確認 1. Fate ファイルの中で bait が作成されていない Target を選択 2. BED ファイルを UCSC browser で表示させ ターゲット上で zoom すると bait がデザインできない理由が確認できます 3. この例では 右側のエクソンは RepeatMasker track と重なっているため repeats として同定されています Repeat Masker が Bait をデサインしない領域 (Avoid) として設定されているので Bait の数が 0 となります Baits Genes RepeatMasker Bait がデザインされなかったターゲットに対して どうしても Bait を設計したい場合は そのターゲット領域に対しリピート領域との重なりを許容するよう設定を変更して 新しい Bait Group を作成することができます 両方の Bait Group を 1 つの Library に入れることができます ただし リピート配列との重なりを許容すると キャプチャ効率に影響を与えます Slide 55

56 Bait Group の作成 Create Bait Group Bait Group のデザインに問題がなければ, Create Bait Group をクリック Home ページの Pending Jobs で Bait Group creation の Status が確認できます ひとつの Bait Group の Creation を待つ間 必要に応じて別の Bait Group をデザインすることが可能です Create bait Group をしなかったサーチ結果は 2 週間後に自動的に削除されます Slide 56

57 すべての Bait Group のデザインの完了 ライブラリの作成に入る前に ひとつのライブラリに入れる予定のすべての Bait Group のデザインを完了させます 複数の Bait Group をひとつのライブラリに入れるケースとしては : 異なるターゲット領域に対して 異なるデザイン条件を設定した場合 自分がすでにデザインしていた Bait Group を 新規の Bait Group に加えたい場合 ターゲット領域のタイプの違いに合わせて それぞれ独立した Bait Group を作成したい場合 例えば ChrX の exon 領域とキナーゼに関与する領域など Slide 57

58 Library の作成 Library に入れる Bait Group の選択 1. Bait Groups のページをクリック, Browse BaitGroup か Search をクリックして目的の BaitGroup を表示 2. ひとつのライブラリの中に入れる Bait Group にチェックマークを入れて選択 ベイトの合計数が を超えると ライブラリ数が増えて 価格も変わります 3. Create Library をクリック Slide 58

59 Library の作成 Species の選択 1. 生物種 (species) を選択 現時点では生物種の選択による違いはありません すべてアジレント社内部 QC 用のコントロールが追加されます 将来の Upgrade に向けた設定です 2. Next をクリック Slide 59

60 Library の作成ベイトの数が 1ELID 分を超過した場合 上記のメッセージが画面に現れます このメッセージが出ると ベイト数に応じた 2~5 までの ELID 数の製品に変わります 価格も変わりますので ご注意ください 1ELID 製品をデザインしたい場合は ターゲットサイズ ベイトの Tiling Frequency Replicate 数を見直して ベイトの数を 57,680 以下に減らすようにしてください Slide 60

61 Library の作成 Library の定義付け 1. ライブラリの名前を設定 利用可能なうち何 % を使用しているかわかります 後述 3. 必要に応じて Description, Keywords, と Comments を入力 2. Bait の長さを選択 ( 現在は 120bp のみ ) 5. ベイトが 57,680 を超えた場合 ライブラリ数がここに表示されます 4. Library の Statistics を確認ここではあといくつの Bait をライブラリに入れることができるかがわかります 6. ベイトの Boosting を選択 ( 次ページ参照 ) Slide 61

62 Agilent Recommended Boosting Maximize performance キャプチャ効率が最大になるように earray が相対的なベイト濃度を自動的に調製します ベイト濃度が自動的に調製されるため 複数のベイトグル プを使って Library を作製するときに ベイトグループごとに Replicate Number を入力することができません 通常は この機能を使用することを推奨しています Maximize capacity - 複数のベイトグループを使って Library を作製するときに 入力した Replicate Number に基づいて 利用できる最大数までベイト数を増やす機能です Slide 62

63 Library の作成 % Occupied before auto replication % Occupied before auto replication デザインした Bait とアジレント既定のコントロール Bait の数が 設計可能な全 Bait に占める割合例 ) デザインした Bait の数が 12,000 の場合 コントロールベイト 70 を含んだ全 Bait 数が 57,750 なので 12,000 / 57,750 = 20.8 % 特に繰り返し回数を指定しないときには 最大 Bait 数まで自動的に Replication されます Slide 63

64 Library の作成ライブラリの詳細を確認 1. Base Coverage の確認 Calculate ボタンをクリックして ライブラリのターゲットサイズを計算し 確認します ターゲットサイズにより 製品型番と価格が変わりますのでご注意ください MP1: <200 kb, MP2: kb, MP3: 500kb-1.49 Mb, MP4: Mb MP0: Mb 2. Library(ELID) の数を確認ベイト数が 57,680 を超えると Library(ELID) の数が増えていきます Library 数が増えると キットの型番と価格も変わりますので ご注意ください 必要に応じて 目的の Library 数になるように変更します Calculate ボタンをクリックすると下記のようにターゲットサイズが計算されて表示されます Option. Maximize Capacity を選択している場合 Replicate の数を入力必要であれば Bait Group の繰り返し回数を変更 ( 通常は 1) Slide 64

65 Library の作成ライブラリの詳細を確認 < 重要 > Library(ELID) の数を確認ベイト数が 57,680 を超えて Library(ELID) の数が 2 になった例です Library 数が増えると キットの型番と価格も変わりますので ご注意ください 必要に応じて 目的の Library 数になるように変更します Slide 65

66 Library の作成ライブラリの詳細を確認した後 Save 1. Library の Status を変更ライブラリを Submit したい場合は Complete を選択. まだ変更する可能性がある場合は Draft か Review を選択 Draft:Save 後作成者が変更可能です Review: ワークグループメンバーは このライブラリの Version を作成できます Complete:save 後の変更は不可能ですが Submit はされていない状態です 2. Save をクリック Slide 66

67 Library の作成ライブラリの Submit 1. Library の Status を変更ライブラリを Submit したい場合は Complete を選択して Save します 2. Save をクリック Slide 67

68 Library の作成 Library の Submit の実行 1. 必要なコメントを入力し Yes をクリック 2. 必要なコメントを入力し Design check list をクリック 3. ライブラリデザインにあたっての重要な注意事項がまとめられています 必ず全文をチェックし OK ならチェックマークを入れて Done をクリック 次ページ参照 4. ここで Yes をクリックすると ライブラリ作成が完了し submit されます Submit したライブラリを実際にオーダーするためには 次の見積もり請求 (quote) に進みます. Submit しただけでは Library をオーダーしたことにはなりません 必ず次の quote のステップが必要です Slide 68

69 Library の作成 Design にあたっての注意事項 現時点では コントロールを設定しても Bait の設計には影響を与えません 将来の Update のためにコントロールとして区別したい Bait Group についてコントロールの設定をします 現時点では Bait 長は 120mer で固定でありタイリングは設定に合わせて自動的に行われます 使用を予定しているシーケンスの機種とプロトコルが設定されていることを確認してください Bait Group に Replicate Number を設定したときには 適切な繰り返し回数を設定しているかどうか再度確認ください Maximize Performance を選択した場合 Bait の相対的な濃度は自動的に調節されます Slide 69

70 Quote の作成見積もり依頼する Library の選択 1. Libraries のページをクリック Search Library をクリック 2. Library Name( 一部でも OK) または ELID で見積もり依頼したい Library をサーチ < 注意 > キットの種類によっては Order Library もしくは Order XT Library のどちらかしか選択できないものがあります 2. 見積もり依頼するライブラリを選択 チェックマークを入れて Order Library もしくは Order XT Library をクリック XT については P6 を参照ください Slide 70

71 Quote の作成 Library 見積もり依頼の詳細を設定 ( 必ずライブラリ設計者による設定が必要 ) 1. 注文するライブラリのキットの個数を設定 2. デザインしたカスタムキットの Bait 数とキャプチャターゲットサイズを確認します ターゲットサイズによりキットの種類と価格が決まるので 変更したい場合はライブラリを作成しなおします 3. 1 キットあたりの反応数 ( サンプル数 ) を選択 : Reaction size の 100 とは 1 つのライブラリを 100 サンプルの Capture に使用することを意味します 4. シーケンステクノロジの選択 ( 現在はイルミナ GA と SOLiD と Roche に対応 ) 5. シーケンスプロトコールの選択作成するキットの種類により選択できるプロトコルが表示されます 6. Next をクリック Slide 71

72 Quote の作成 Library キット見積もり依頼の review と Submit 前画面の入力により キットの型番が自動的に決定されます また Library Detail に記載されている ELID が ライブラリキットの ID 番号となります 大変重要な情報ですので 必ずこの画面の Print を行い 保管ください 注文する Library の内容を再確認して Request a Quote をクリック Slide 72

73 Quote の作成 Library キット見積もり依頼の review と Submit ベイトの数が多く ELID 数が上限の 5 つとなった例です この例では S がキット全体の ELID となり , , , , が内訳の 5 つの ELID となります 必ず Print をクリックして 画面のプリントを保管ください 注文する Library の内容を再確認して Request a Quote をクリック Slide 73

74 アジレント社担当営業もしくは取り扱い販売店から見積もり金額の提示 発注へ 標準納期は発注後約 6~8 週間です Page 74

75 RNA キャプチャキット 画面右上の Switch Application Type をクリックして SureSelect RNA Enrichment のメニューに切り替えます Slide 75

76 earray がサポートしている Database 2011 年 7 月時点 77 生物種 15 th September 2010 時点の UniGene database をベースにしています Slide 76

77 earray の SureSelect RNA キャプチャアプリケーションで行うこと Target Type を選択します Transcript targets もしくは Genomic Interval Transcript Target の場合 Upload した GeneBank の ID リストまたは FASTA のシーケンスをもとに 指定した tiling frequency で ベイトがデザインされます UniGene に登録されている転写産物をキャプチャしたい場合に用います Genomic Interval の場合 UniGeneに登録されていない配列をキャプチャするために gdnaの位置情報を指定する場合に用います Non-codingRNAキャプチャ gdna 上でキャプチャしたい領域設定 Bait Slide 77

78 Bait Group の作成 Bait のデザイン Baits のページを選択し Bait Tiling をクリック Baits をクリック Bait Tiling をクリック Bait Tiling をクリックすると Bait をデザインする画面に入る Slide 78

79 Bait Group の作成 Bait のデザイン 1. Library Category が RNA Capture になっているのを確認します 2. Job Name を入れる. これが Bait Group の名前になります 次ページ以降参照 3. Sequence Technology を選択します ilumina もしくは AB (SOLiD) Protocol は自動的に決定されます 4. Bait Tiling Frequency を入力します Default は 2xtiling です Slide 79

80 Bait Group の作成 Bait Tiling Frequency 1x tiling overlap: なし target region 2x tiling overlap: 60bp target region 3x tiling overlap: 40bp target region baits baits baits ベイトの重なりがないため 同じベイト数でターゲットをより広い領域で設定できる イルミナでは 75bp 以上の長さで読むことが必要 1xtiling よりもキャプチャ効率が上がるため Default の設定として推奨 Tiling Frequency を大きくするとターゲット領域のサイズは減少します 4x tiling overlap: 30bp target region baits 5x tiling overlap: 24bp target region baits

81 Bait Group の作成 Bait のデザイン 5. 生物種を選択 ここに目的の生物種がない場合 NA を選択し Transcriptome File とシーケンスを Upload してデザインできます 6. ターゲットを入力 GenBanck の Accession 番号のリストを入力するか ターゲットの配列を FASTA フォーマットで Upload します ファイルは ziip ファイルの形式であることが必要ですので注意ください GeneSymbol は使用できません 8.eArray でサポートしていない生物種に対してデザインする場合 Transcriptome ファイルを Upload します FASTA フォーマットを zip 化して Upload ください 7.Transcriptome Details の入力 5 で選択したものと同じ生物種を選択します Zip 化 Slide 81

82 Bait Group の作成 View Design Details (I) Bait Group のデザインのサマリを見るには Baits ページの View Design をクリックします Slide 82

83 RNAEnrichment_tdt ファイルの確認 BaitScoreの意味 1. Not masked and unique in genome. 2. Not masked but may hit other regions/transcripts of the genome. 3. Masked but unique 4. Masked and not unique RNAEnrichment_tdtファイルをOpenし 必ず BaitScore を確認します BaitScore が 4 の Bait があれば リピート 配列である可能性が高いので デザイン から除外することを推奨します ( 次ページ参照 ) 2 および 3 の Score をライブラリに含めるか どうかは 実験の目的に応じて決定します Slide 83

84 BaitScore4 を除外して再デザイン 1. RNAEnrichment_tdt をExcelで開き BaitScore4を除外したファイルを作成します 2. さらに BaitIDとSequenceのカラムを残し その他のカラムは削除します 3. BaitIDをSequenceのカラムのファイルをタブ区切りテキストとして保存します Slide 84

85 作製したベイトシーケンスファイルの Upload Baits Upload をクリック Species を入力 Create New Bait Group を選択し名前を入力 作製したタブ区切りテキストファイルを選択 デザインに使用した Tiling Frequency を入力 File Format は MINIMAL,Type は TDT を選択 Slide 85

86 作製したベイトシーケンスファイルの Upload Upload したテキストファイルの先頭行に Header がある場合は ここをクリック Upload をクリック この後の作業は DNA キャプチャと同様です Library の作成 p56~ Quote の作成 p66~ をご参考ください Slide 86

87 カタログキット ( ライブラリ ) に追加するライブラリの作成 -Human All Exon シリーズプラスカスタムキット -Human Kinome プラスカスタムキット Slide 87

88 カタログキット ( ライブラリ ) に追加するライブラリの作成 カタログキット ( ライブラリ ) に追加するカスタムライブラリは 1ELID のサイズであればこれまで作製した既存のライブラリでも Supplemental ライブラリでも どちらも追加できるようになりました Supplemental ライブラリを新たに作る場合は 既存のベイトグループや Upload したベイトグループからも作製できるようになりました 2011 年 7 月現在 カスタムライブラリを追加できる元のライブラリは以下のものになります Human All Exon 50Mb キット (XT タイプ ) Human All Exon v2 キット (XT タイプ ) Human Kinome キット (XT タイプ ) Human All Exon キット (Non-XT タイプ ) RNA キャプチャキットは対応していません 追加するライブラリのデザインは Default 設定となります 設定の変更はできません Slide 88

89 カタログキット ( ライブラリ ) に追加する Supplemental ライブラリの作成 Home を選択します Create Library from Bait Upload, Create Library from Existing Bait Groups(s), Create Library by Bait Tiling のいずれかを選択して Next をクリック ( ここでは Existing Bait Groups からの例を説明 ) Slide 89

90 Supplemental Library の作成 Species の選択 Species を選択して Next をクリック Slide 90

91 Supplemental Library の作成 Base Library の選択 1. Library Type として Supplemental を選択します 2. Base Library をを選択しますここに記載のないキットは選択できません 3. Base Library とオーバーラップするベイトをデザインに入れるか 入れないかを選択します 入れたくない場合はここにチェックします

92 Supplemental Library の作成追加する Bait Group(s) の選択 1. Add をクリックします 2. 目的のベイトグループを名前でサーチしてリスト表示させ追加するグループを選択して Add をクリック 3. Done をクリックします Slide 92

93 Supplemental Library の作成ライブラリ作製条件の設定 Option. Maximize Capacity を選択している場合 Replicate の数を入力必要であれば Bait Group の繰り返し回数を変更 ( 通常は 1) ベイトの Boosting を選択 (61-62 ページ参照 ) Slide 93

94 Supplemental Library の作成 Library の Save まだ修正する可能性がある場合は Complete を選択します Supplemental Library のデザインを終了し Submitted を選択します その前に Design Checklist をチェックする必要があります Save します Slide 94

95 Supplemental Library の作成 Design にあたっての注意事項 現時点では コントロールを設定しても ベイトの設計には影響を与えません 将来の Update のためにコントロールとして区別したい Bait Group についてコントロールの設定をします 現時点では ベイト長は 120mer で固定でありタイリングは設定に合わせて自動的に行われます 適切なベイトグループで ライブラリの空き領域が埋められているかを確認してください 使用を予定しているシーケンスの機種とプロトコルが設定されていることを確認してください Slide 95

96 Supplemental Library の作成 Supplemental Library を Submit して Save すると表記のメッセージが画面に現れます Slide 96

97 Supplemental Library の作成確認 これは Supplemental Library の ELID となります この時点ではまだ Base Library と統合されたキットになっていませんので注意ください Slide 97

98 Base Library と追加する Library の統合 カタログキットに追加するライブラリは 1ELID までのサイズであれば Supplemental Library ではない既存のライブラリでも追加できるようになりました 1ELID までの Library と Base Library を統合した Library ( カタログプラスカスタムキット ) を作製します Combine Libraries をクリックします Slide 98

99 Base Library と追加したい Library の統合統合 Library Name の入力と Base Library Name の指定 1. カタログプラスカスタムキットの Library 名を付けます 2. Base Library を選択します 3. Next をクリックします Slide 99

100 Base Library と Supplemental Library の統合追加する Library の指定 追加したいライブラリをサーチし 追加するものを選択して Next をクリック Slide 100

101 Base Library と追加したい Library の統合 ELID の確認 Base Library と追加したい Library のそれぞれの ELID が表示されますので間違いがないことを確認して Next をクリックします Slide 101

102 Base Library と追加する Library の統合統合 Library の Save まだ修正する可能性がある場合は Complete を選択します Base と追加する Library を統合したカタログプラスカスタムキットのデザインを終了し 見積もりが必要な時には Submitted を選択します その前に Design Checklist をチェックする必要があります Slide 102

103 Base Library と Supplemental Library の統合 Combined Library を Submit して Save すると表記のメッセージが画面に現れます Slide 103

104 統合 Library の作成確認 統合された Library の ELID となります Base Library と追加した Library を統合した Library の ELID は頭文字に C が付きます Slide 104

105 カタログプラスカスタムキット ( 統合ライブラリ ) の Quote Library のタブをクリックし Library Name もしくは ELID で 完成した統合 Library をサーチします オーダーしたい統合ライブラリ (Library Type が Combined になっているのを確認してください ) を選択して Order します XT Library を選択すると SureSelect 試薬の他にライブラリ調製用の試薬も含まれたキットになります Slide 105

106 カタログプラスカスタムキット ( 統合ライブラリ ) の Quote この後の Quote 作製手順は通常のカスタムキットと同じですので P67-68 を参照ください Slide 106

107 アジレント社担当営業もしくは取り扱い販売店から見積もり金額の提示 発注へ 標準納期は発注後約 6~8 週間です April 2009 Page 107

108 SureSelect データ解析時の Build に関する注意点 次世代シーケンサによるキャプチャ DNA のシーケンシングデータを Reference Genome sequence に Mapping する際は 使用する Reference Genome Sequence の Build と アジレントが提供するキャプチャターゲットの位置情報を示す BED ファイルの Build が一致するように注意してください earray でサポートしている Genome の Build 情報は Page 6 を参照してください 特に Human の場合 earray では 2010 年 5 月 1 日の時点で hg18 から hg19 に Build が切り替わっています 5 月 1 日以降にデザインした もしくは入手した BED ファイル用いる場合 Mapping には hg19 の Build をお使いください ライブラリをいつ作成したかわからない場合は 次ページの方法で確認できます Slide 108

109 ライブラリ作成日の確認確認したいライブラリの Search Home のタブで Library の Search を選択し サーチしたいライブラリの名前か ELID を入力します ELID は先頭の 0 も入力する必要があります Search をクリック Slide 109

110 ライブラリ作成日の確認ライブラリの View 内容を確認したい Library の View をクリックします Slide 110

111 ライブラリ作成日の確認 Create Date を確認します Human の場合 2010 年 4 月 30 日以前なら hg 年 5 月 1 日以降なら hg19 Slide 111

112 お問い合わせ先 earray に関するサポートお問い合わせ窓口 TEL: _japan@agilent.com SureSelect の earray に関する質問と明示ください 価格 納期等のご質問は 担当営業にご連絡ください Slide 112