Microsoft PowerPoint - 04 池袋一典教授

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ちかこそや
4 years ago
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1 1 アプタマーのヒトゲノム情報からの探索及びコンピューター内進化東京農工大学大学院工学研究院生命機能科学部門教授池袋一典

2 研究の背景 3 叉路型アプタマー高い結合能を示すアプタマーの例 Target Library K d (nm) HIV-1 integrase RNA 10 FIV reverse transcriptase RNA 4.2 HIV-1 reverse transcriptase ssdna 2 Thrombin ssdna 25 NAR, 2000 Taq DNA polymerase ssdna 0.04 分子認識素子としてのアプタマーの利点 in vitro で探索できる未同定蛋白質に結合するアプタマーを探索できる全合成でき化学修飾が容易高温で変性しても元に戻る構造変化を設計できる

3 新規治療薬の開発 Development of new medicines 既存治療薬の選択 Choice of existing medicines 診断 Diagnosis 治療薬 Therapeutic compounds 新規診断マーカーの測定 Measurement of new markers 既知診断マーカーの測定 Measurement of exsiting markers 3

4 従来の SELEX Librar y + 精製した膜蛋白質 Cell SELEX 標的細胞には結合しないことがある Bound pool Cell-SELEX 精製した膜蛋白質標的細胞 + Cell 標的細胞精製工程が不要生理状態下で標的分子に結合するアプタマーを探索可能未同定膜蛋白質に対してもアプタマーを探索可能

5 5 従来技術とその問題点アプタマーを探索するのには通常 SELEX 法が用いられるが以下の2つの大きな問題があり高い結合能を持つアプタマーを探索することが容易ではない 1) 実験で用いるライブラリの多様性の制限 2)PCR 増幅課程における有望なアプタマーの欠落

SELEX の実験上の制限 1 30-mer の DNA ライフラリー : 10 18 配列を含む SELEX で用いる nmol の DNA ライフラリー : 10 14

6 SELEX の実験上の制限 1 30-mer の DNA ライフラリー : 配列を含む SELEX で用いる nmol の DNA ライフラリー : 配列しか存在しないわずか 1 万分の 1 のオリゴ DNA しか探索されていないアプタマーの塩基配列空間未探索空間に存在する大部分のオリゴ DNA の結合能を調べる方法の開発が必須

7 SELEX の実験上の制限 2 PCR 増幅過程において増幅されやすい配列が存在する安定な二次構造を形成するオリゴ DNA は増幅されにくい容器や担体に結合するオリゴ DNA が増幅されてしまう

8 進化模倣アルコリスムを用いたアフタマーの改良 1. SELEX によるアフタマーの探索標的分子に結合するアフタマー 2. 進化模倣アルコリスムによるアフタマーの改良 in silico maturation in vitro でのアフタマーの機能評価繰り返す in silico での次世代配列の決定

9 1 アプタマー 1 位の配列 in silico maturation 法の工程 1. 特性検討順位付け配列選択 ( 実験 ) アプタマー 2 アプタマー n 特性検討 2 位の配列 N 位の配列 1 位の配列 2. 配列操作 ( コンヒューター内 ) 交差 2 位の配列 3 位の配列変異導入点変異上位の配列が選択されやすいように比重を変更する 3. 次世代ライブラリーの合成 ( 実験 )

10 アプタマー評価結果結合能約 480 種のアプタマーを設計評価飛Streptococcus mutans 結合アフタマーの改良躍的に向上遺伝的アルゴリズムによる進化 2 シャッフリング 1 による進化 3 シャッフリング 2 による進化

11 G-quadruplex (G4) を形成するアプタマー Aptamers obtained in our laboratory G-quadruplex (G4) structure G G G G G G G G Motif : G 2+ N 1-7 G 2+ N 1-7 G 2+ N 1-7 G 2+ タンパク質のある種の β-structures に G4 構造が結合しやすいことを発見した (Anal. Chem., 2012)

Gene Huppert and Balasubramanian, Nucleic Acids Res.

12 ヒトゲノム上に存在する G4 構造 1. テロメア 2. 各遺伝子のプロモーター領域 G G G G ヒトゲノム上の遺伝子のプロモーターの40% にはG4 形成可能配列が存在する G G G G Gene Huppert and Balasubramanian, Nucleic Acids Res., (2007) 我々は蛍光 G4 リガンドと DNA マイクロアレイを用いヒトやマウスのゲノムの CpG アイランドの 2000 箇所程度に G4 が形成されている可能性があることを実験で確認した Angew. Chem. Int. Ed. (2013)

13 ヒトゲノムの塩基配列からのアプタマーの探索 G4 promoter-derived aptamer selection (G4PAS) 1. ヒトゲノム上の標的遺伝子 ( 標的タンパク質をコードする遺伝子 ) のプロモーターに存在する G4 形成可能配列の検索転写開始地点 1kb 1kb 標的遺伝子 G 2+ N 1-6 G 2+ N 1-6 G 2+ N 1-6 G 2+ Quick & easy method of aptamer screening (PLOS ONE, 2013) G-quadruplex candidate sequence (QCS) 2. 候補配列の化学合成 QCS1 GGNGGNGGGGNGG 3. SPR 等による標的タンパク質への結合評価 QCS2 QCS3 GGGNNGGNNGGGNNNGGGG GGGNGGGNGGGNGGG

14 結合評価結果 Without heparin-binding domain VEGFA 1 /1 bound (Vascular Endotherial Growth factor) PDGF-AA 1 /1 bound (Platlet-derived Growth Factor - subunit) PDGF-BB 8 /8 bound (Platlet-derived Growth Factor - subunit) HGF 3 /9 bound (Hepatocyte growth factor ) HB-EGF 2 /14 bound (Heparin-binding EGF-like growth factor) With heparin-binding domain afgf (Acidic fibroblast growth factor) bfgf (Basic fibroblast growth factor) Annexin 2 (Annexin A2) ApoE4 7 /7 bound 1 /8 bound (Apolipoprotein E4) CS protein (Circumsporozoite protein) PLGF (Placenta growth factor) TNF- (Tumor necrosis factors )

15 G4PAS の結果まとめ 19 個のタンパク質に対して G4PAS による VEGF 1 /1 sequences bound (Vascular Endotherial Growth factor) PDGF-AA 1 /1 sequences bound (Platlet-derived Growth Factor - subunit) PDGF-BB 8 /8 sequences bound (Platlet-derived Growth Factor - subunit) HGF 3 /9 sequences bound (hepatocyte growth factor ) HBEGF2 /14 sequences bound (Heparin-binding EGF-like growth factor) afgf (acidic fibroblast growth factor) bfgf (basic fibroblast growth factor) Annexin 2 (Annexin A2) ApoE4 1 /8 sequences bound (Apolipoprotein E4) CS protein (Circumsporozoite protein) PLGF (Placenta growth factor) TNF- (Tumor necrosis factors ) DNA アプタマー探索をし 8 個について得ることができたヘパリン結合部位を持つもの : 1 /7 ヘパリン結合部位を持つもの : 7 /12 K d 値は M 程度

16 VEGF プロモーター変異 DNA の結合能解析 Name Sequence (5' to 3') VEGFA G4 aptamer GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut1 GTTGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut2 GGGGCGTGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut3 GGGGCGGGCCGTTTGCGGGGTCCCGGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut4 GGGGCGGGCCGGGGGCGTTGTCCCGGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut5 GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCTGCGGGGCGG VEGFA G4 Mut6 GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGTTGCGG VEGFA G4 Mut7 GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGT Mutant DNA conc. : 10 nm~1000 nm 10 nm 50 nm 100 nm 500 nm 1000 nm

17 In silico maturation によるアプタマーの結合特異性の改良 Crossover Mutation Pairing 3 rounds (Repeat 3 times) Replication Identified HGF aptamers by G4PAS Name Sp (HGF) HGFap1 1.9 HGFap2 2.6 HGFap3 2.8 Specificity index: Sp (HGF) =K a(hgf) / K a(hbegf) Evaluation of specificity in vitro SPR measurement & calculation of Sp (HGF) Selection of evolved sequences Aptamer with high specificity

18 In silico maturation による結合特異性の向上

19 新技術の特徴従来技術との比較コンピューターを用いてアプタマーの塩基配列を組み換える in silico maturation 法によりアプタマーの探索領域を拡大し注目しているアプタマーの機能を 10 倍以上改良することに成功したヒトゲノム上に存在する G-quadruplex 構造形成可能塩基配列に着目し標的蛋白質に結合するアプタマーを探索する方法を開発し時間と労力を圧倒的に削減することに成功した上記 2 つの方法を組み合わせて結合特異性が優れたアプタマーを短期間に開発できる 19

20 想定される用途疾病や健康状態の新規な指標と考えられる蛋白質やペプチドに対し DNAアプタマーを獲得することができその簡易検出システムを構築することができる簡易検出に要求されるアプタマーの各種の特性 ( 結合特異性等 ) を 10 倍以上改良できる本手法は治療薬としてのアプタマーの開発煮も応用できかつ本手法でアプタマーの修飾の種類や部位等最適化できる 20

21 21 実用化に向けた課題現在手法論についてはほぼ確立できたと考えられる今後具体的な標的分子への適用を重ねる必要がある開発者らは今後の新規マーカータンパク質について具体的な情報及びその解析法を持っていない実用化に向けてアプタマーの修飾及び非天然核酸塩基の導入は効果的と考えられるがそのノウハウを持たない

22 22 企業への期待具体的な新規マーカータンパク質とその特性解析方法を有する企業との共同研究を希望核酸の修飾及びオリゴ DNA への非天然核酸の導入方法及びこれらの生体内での効果に関する知見を有する企業との共同研究を希望

23 23 本技術に関する知的財産権発明の名称 : アプタマーの製造方法出願番号 :PCT/JP2013/ (WO2014/010640) 出願人発明者 : 国立大学法人東京農工大学 : 池袋一典吉田亘

24 24 お問い合わせ先東京農工大学先端産学連携研究推進センター TEL FAX

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析論文題目腸管分化に関わる microrna の探索とその発現制御解析氏名日野公洋 1. 序論 microrna(mirna) とは細胞内在性の 21 塩基程度の機能性 RNA のことであり部分的相補的な塩基認識を介して標的 RNA の翻訳抑制や不安定化を引き起こすことが知られている mirna は細胞分化や増殖ガン化やアポトーシスなどに関与していることが報告されておりこれら以外にも様々な細胞諸現象に関与していると考えられている

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