1 抗体に代るペプチドを用いた分子認識材料 ( ペプチドアプタマー ) の迅速な創製 埼玉大学 大学院理工学研究科物質科学部門 准教授根本直人

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1 1 抗体に代るペプチドを用いた分子認識材料 ( ペプチドアプタマー ) の迅速な創製 埼玉大学 大学院理工学研究科物質科学部門 准教授根本直人

2 2 ペプチドアプタマーとは その利点 優位性

3 ペプチドアプタマーとは 3 抗体 ペプチドアプタマー 分子種分子サイズ新規認識分子取得法合成修飾 改変 ポリペプチド ( 一部に糖 ) ~150 kd 生物学的 ( 培養 ) 分子取得法と一体 抗体作製後 酵素等を用いて修飾することは可能 ペプチド 1~6 kd 試験管内 (in vitro) 有機合成 有機合成の際 多様な修飾が容易に可能 大規模化 機械化困難 ( 特に飼育 / 細胞培養過程 ) 容易 ( 固相 / 液相合成共に ) コスト高 (10) 低 (1) 耐環境性 ( 安定性 ) 生物素子特有の課題として 環境要因による変性を受けやすい 抗体と同様だが アシル化やメチル化などの修飾により 高い耐環境性を付与することが可能

4 ペプチドと抗体との比較 免疫グロブリン G (IgG) 分子モデリングにより作製されたペプチド 本技術を用いて作製されたペプチドアプタマー U.S. National Library of Medicine Feng J, Li Y, Shen B. The design of antagonist peptide of hil-6 based on the binding epitope of hil-6 by computer-aided molecular modeling. Peptides Jul;25(7): scys4-2a 分子量 150 kda 1.54 kda (IgGの1/100) K d 12 nm ND IC nm nm (0.18 µg/ml) (15 µg/ml) 3.5 kda (IgGの1/35) 50 nm nm ( µg/ml) K d : 解離定数 IC 50 : 細胞成長 50% 阻害濃度 4

5 5 ペプチドを用いることのメリット バイオ医薬における新たな選択肢として 抗体 低分子化合物と比較して 多くの利点が考えられる 例えば 標的に対する高特異性 低毒性 低生産コスト ) 抗体並みの強い結合 特異性を有したペプチド創出 ペプチド 抗体 分子量 取得方法 小さい (1~10 kda) In vitro selection 大きい (150 kda) 免疫システム 大量合成 化学合成 ( 容易 ) 培養細胞 ( コスト高 ) 安定性 高い 低い 化学修飾 容易 診断薬として 特異的修飾は困難 融合タンパク質化 容易 極めて有利 困難 標的分子 ( 抗原 ) の種類 広範囲 糖鎖に対する抗体は作製しにくい

6 6 ペプチドアプタマー取得のためのツールとして 1) 独自の強力なペプチドスクリーニング技術 -cdna ディスプレイ法 - cdna とペプチドを共有結合した形でディスプレイ 従来技術に比べ極めて短時間で候補ペプチドを取得可能 S-S 結合を持つ多様なライブラリも提示可能 2) 様々な用途に応じた機能ペプチド創出用ライブラリ 化学合成が可能なペプチドサイズ 取得したペプチドは 抗体に匹敵する特異性と親和性を有する アンタゴニスト アゴニストの取得可能

7 cdna ディスプレイ法の概要 7

8 8 cdna ディスプレイ法とは 遺伝子型 / 表現型対応付け分子のライブラリーから目的ペプチドを効率的に取得する技術 mrna ペプチド ピューロマイシンリンカー 要素技術 cdna 1. 新規リンカーによる cdna ディスプレイの構築技術 2. 特徴のあるライブラリデザイン 3. スクリーニング方法の最適化

9 遺伝子型 - 表現型対応付け技術の重要性 ファージディスプレイ リボゾームディスプレイ mrna mrna ディスプレイ mrna 表現型 遺伝型 シークエンス 標的分子 同定 増幅 選択 9

10 10 従来技術の問題点 : ファージディスプレイ法 大腸菌 細胞毒性のあるペプチド 膜透過 融合タンパク質として提示 fd ファージ M13 等 ライブラリサイズが細胞の数に限定 (1つの大腸菌には1 種類のファージしか感染できない ) 細胞毒性 膜透過 融合タンパク質として提示できるものに限られる 多様性が縮小

11 従来技術の問題点 : リボゾームディスプレイと mrna ディスプレイ 11 Nemoto, N., et al. (1997) FEBS lett. 414, リボゾームディスプレイではリボゾームの解離と mrna の分解を回避するため 4 でのスクリーニング mrna ディスプレイでは室温でスクリーニング可能 ただし mrna の分解に関する課題が残る

12 12 新規ピューロマイシン リンカー 精製用ビオチン 切断部位付リンカー

13 本技術のよるスクリーニングの例 DNA ライブラリ (10 14 ) ライブラリサイズ :10 12 種類 1 2 Start 新規ピューロマイシン リンカー 3 4 変異を導入 9 PCR 5 cdna ディスプレイ分子合成 結合ヘ フ チト の濃縮 選択 カラムやビーズを適宜使い分ける ( ノウハウ有り ) 翻訳後の迅速な DNA 化 13

14 14 既存のディスプレイ技術の比較 本技術 ファージディスプレイ リボゾームディスプレイ mrna ディスプレイ cdna ディスプレイ タンパク質発現 細胞内 ( 大腸菌 ) 無細胞 無細胞 無細胞 ライブラリサイズ 10 8 /ml /ml /ml /ml 1 サイクル ( 日数 ) 安定性 細胞毒性のあるペプチド 4-5 日 2-3 日 2-3 日 安定 不安定 (mrna) 不安定 (mrna) 不可可可 1-2 日 安定 (cdna) 可 対応付けの方法 ファージ リボゾーム ( 非共有結合 ) ピューロマイシン ( 共有結合 ) ピューロマイシン ( 共有結合 ) 固相化 ( フォールディング向上 翻訳後修飾 ) 不可不可不可可

15 具体例 : 実際に用いたランダムペプチドライブラリと標的分子 15 MGCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGSHHHHHH ランダム 35 aa 慢性関節リウマチ : アクテムラ ( 一般名 : トシリズマブ ) の標的分子 IL-6 IL-6R IL-6 gp13 0

16 12 ラウンド後の淘汰配列 After 12 th Round Cysteine Random region (35 a.a.) His-tag MGCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGSHHHHHH X = (NNK) 35= 105 bases N= Equimolar mixture of A, T, G, C K= Equimolar mixture of T, C Size of Diversity=10 45 (Green) Constant Region (Yellow) Point Mutation (Gray) Diversification (Pink) Silent Mutation 16

17 ジスルフィド結合形成促進処理後に出現した配列 17 R1 R2 R3 5.6% Mutagenesis R4 R5 R6 R7 Sequencing Each 6 clones Treatment for Disulfide bond None GSSG/ GSH GSSG/GSH + Protein Disulfide Isomerase Sequences selected after 7 th round with Mutagenesis DD DD

18 18 取得したペプチドアプタマーと IL-6R の親和性 Competitive ELISA IL-6 Cys2 + DTT Cys2 1, 2

19 19 Cys4 の S-S 架橋パターンと IL-6R に対する親和性 Yamaguchi, et al., NAR, 37, e108 (2009)

20 20 IL-6 依存増殖細胞 (DS-1) を用いた Cys4 の阻害効果 The lymphoblast cell line: DS-1 Cys4-2A Cys4-2B

21 想定される用途 21 医療 : バイオマーカー検出 リード分子探査 リード分子モデリング 環境 : 環境ホルモン BOD( 水質検査 ) 食品 : 食中毒菌 アレルゲン検出 セキュリティ : 新興感染症 対バイオテロ

22 22 本技術に関する知的財産権 発明の名称 :cdna/mrna-タンパク質連結体の効率的合成法 出願番号 : 特願 出願人 : 埼玉大学 発明者 : 根本直人 望月祐樹 西垣功一 発明の名称 : mrna/cdna- タンパク質連結体作製用リンカーとそれによるヌクレ オチド - タンパク質連結体の精製方法 出願番号 : 特願 出願人 : 埼玉大学 発明者 : 根本直人 上野真吾

23 産学連携の経歴 23 すでにいくつかの企業様と共同研究をさせていただいておりま すが 私どもの基本的なポリシーとして企業様のお名前は非公表とさせていただいております また 企業に在籍していた経験から企業の立場に立った開発を心がけております

24 24 お問い合わせ先 埼玉大学地域オープンイノベーションセンター産学官連携推進部門 TEL; FAX;

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