障歯誌 36: ,2015 障害者歯科第 36 巻第 4 号 原 著 気管上皮細胞における Porphyromonas gingivalis 産生酵素 PepD の影響 1) 2) 菱沼光恵 田中陽子 矢口学 3) 桒原紀子 野本たかと 2) 2) 要旨 : 口腔常在菌

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1 障歯誌 36: ,2015 障害者歯科第 36 巻第 4 号 原 著 気管上皮細胞における Porphyromonas gingivalis 産生酵素 PepD の影響 1) 2) 菱沼光恵 田中陽子 矢口学 3) 桒原紀子 野本たかと 2) 2) 要旨 : 口腔常在菌が口腔疾患だけでなく全身疾患の誘発に深く関与することが明らかにされてきている. 障害児者や高齢者にとって,Porphyromonas gingivalis ( P. gingivalis) を含む口腔常在菌を起因として, 口腔機能や免疫機能の低下が相まった際に誘発される誤嚥性肺炎は, きわめて重篤な疾患となる. 糖非分解性細菌である P. gingivalis によってエネルギー獲得のために産生されたプロテアーゼは, タンパク質の代謝のみならず病原性にも関与しているとされている.P. gingivalis のゲノム解析が行われ, 菌株の間で頻繁なゲノム再構成が起こっていることが明らかにされ, 最近の研究で P. gingivalis のもつ線毛の遺伝子型 (fima) によって I から V 型に分類した場合,fimA II 型が進行性の歯周病患者に多いことが報告されている. また,P. gingivalis の産生する Aminoacyl-histidine dipeptidase (PepD) は fima II 型に多く発現するプロテアーゼであることが明らかにされている. しかしながら,PepD に焦点をあてた報告はほとんどない. そこでわれわれは fima II 型 P. gingivalis の PepD に着目し, 気管上皮細胞に対する為害性について検索した. さらに将来的な新規分子標的治療薬開発の足掛かりとして,PepD を標的とした阻害剤についても,fimA I 型 P. gingivalis の増殖抑制効果が報告されているベスタチンを中心に検討を加えた. その結果, PepD は菌自身の生存に関与するだけでなく生体為害作用をもつことが明らかにされた. さらに,PepD がベスタチンの標的酵素であることが示唆され,P. gingivalis によって誘発される慢性炎症への新規治療薬としての可能性があることが考えられた. Key words: Porphyromonas gingivalis, Aminoacyl-histidine dipeptidase, PepD, Bronchial epithelium, Bestatin 緒 主要な口腔感染症の一つである歯周病は, 口腔常在菌を起因とする内因感染症であるとともに, さまざまな因子により誘発される多因子性疾患である 1,2). さらに局所の慢性炎症性疾患である歯周病と全身疾患との関連性について多くの報告がなされ, 糖尿病, 動脈硬化症や関節リウマチの発症に関与していることなどが示されている 3~6). 口腔常在菌は, このような間接的関与だけでなく, 動脈硬化誘発部位への付着や誤嚥性肺炎の起因菌としての働きなど直接的関与も指摘されている 7,8). グラム陰性偏性嫌気性桿菌である Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) はさまざまな病原因子をもち, 歯周病の主要な原因菌であると考えられているが, さらに複数の菌株の全ゲノム解析より変異を繰り返していることが 1) 日本大学大学院松戸歯学研究科障害者歯科学専攻 2) 日本大学松戸歯学部障害者歯科学講座 3) 日本大学松戸歯学部微生物免疫学講座 ( 原稿受付日 : 平成 27 年 6 月 15 日 ) ( 原稿受理日 : 平成 27 年 8 月 31 日 ) 言 解明された 9~11).P. gingivalis の主要な病原因子の一つである線毛は, 付着因子として大きな役割を果たしている 12). 線毛には遺伝子型 fima 遺伝子によってコードされるフィブリンタンパク FimA と mfa1 遺伝子によってコードされるフィブリンタンパク Mfa1 が存在し,P. gingivalis は fima の遺伝子型によって I 型から V 型に分類されている 13,14).Amano らは, 日本人の進行性歯周炎患者の 87% から P. gingivalis が検出され, そのうちの 70% は II 型であり, 健康な歯肉保持者に検出された同菌の 80% は I 型であったと報告している 15,16). 興味深いことに,Down 症候群における重篤な歯周炎に II 型が深く関与しているとの報告もある 17). これらのことから,P. gingivalis の fima II 型が歯周病の惹起に深く関与していると推測され, 本菌の病原性を明確にすることは非常に重要であると考えられる. P. gingivalis は糖非分解性細菌であり, 自身の生存のためのエネルギー獲得に外界のアミノ酸を利用する必要があるため, 菌体表面や菌体外に強力なプロテアーゼを産生する 18~21). これらのプロテアーゼのなかで, システインプロテアーゼであるジンジパイン (Rgp および Kgp ペプチダーゼ ), セリンプロテアーゼであるジペプチジルアミノペプチダーゼ IV(DPP IV), プロリルト

2 606 気管上皮細胞における P. gingivalis の病原因子 表 1 Primers for PCR cloning Gene name Forward Reverse fima P-aagctttGATGAAGTTAAACAAAATGTTT P-aattcttaGAGATCAACCTCATAGGAATG mfa1 P-aagctttATGAAGTTAAACAAAATGTTT P-aattcttaGAGATCAACCTCATAGGAATG pepd P-aagctttgATGAACATTACAGATCTCAA P-aattcttaTTTGGCTGCGGGGATATG リペプチジルアミノペプチダーゼなどのペプチダーゼが同定され,P. gingivalis 自身のエネルギー獲得だけでなく, 直接的な生体組織障害性を有し病原性にも強く関与することが明らかにされている 22~26). しかしながら, これらの研究の多くは I 型 P. gingivalis( 以下 fima I 型 ) を用いたものである.Aoki ら 27) は臨床検体から分離され, 高い病原性を示す株である II 型 P. gingivalis TDC 60 株 ( 以下 fima II 型 ) を網羅的に解析し, 他株に比べきわめて発現量の多いタンパクが Aminoacylhistidine dipeptidase の PepD(EC ;PepD, 別名 Xaa-His ジペプチダーゼもしくはカルノシナーゼ ) であることを見いだしている.Aminoacyl-histidine dipeptidase は, 一般的にペプチドのアミノ酸鎖を N 末端から段階的に加水分解し, アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素であり, 菌や生体のさまざまな部位に存在し, それぞれ少しずつ異なる機能を示す.Aoki ら 27) は fima II 型の PepD はメタロペプチダーゼ 20(M20) ファミリーに属し, 遷移金属存在下, カルノシン (β-alanyl-l-histidine) を基質としβ-alanine と L-histidine への代謝活性を有したカルノシナーゼにきわめて相同性が高いと報告している. 口腔機能の低下が起きやすい障害児者や高齢者にとって, 免疫機能の低下もしくは異常が相まった際に誘発される口腔常在菌による誤嚥性肺炎は, 死に直面するきわめて重篤な疾患となるが,P. gingivalis もその要因となりうることが報告されている 28~30). しかしながら,P. gingivalis によって産生されるプロテアーゼに着目した報告は,Rgp の生体細胞障害性への間接的関与の可能性を示唆したものだけである 31,32). そこでわれわれは fima II 型の PepD に着目し, 気管上皮細胞に対する為害性について検索した. さらに将来的な新規分子標的治療薬開発の足掛かりとして,PepD を標的とした阻害剤についても,fimA I 型の増殖抑制を誘発すると報告されている 33,34) ベスタチンを中心に検討を加えた. 材料ならびに方法 1. 供試菌株および培養 Escherichia coli(e.coli)dh5αおよび BL21 を 37 好気下で LB 培地 (BD,USA) にて培養し, リコンビ ナントタンパク作成時のコンピテントセルとして用いた.P. gingivalis ATCC 株 (fima I 型 ;ATCC TM ) および TDC 60 株 (fima II 型 ; 東京歯科大学より譲渡 ) を phytone peptone(5 mg/ml),nacl(5 mg/ml), システイン (0.1%), ヘミン (5 mg/ml) およびビタミンK1(0.01 %) 含有 trypticase soy 培地 (BD,USA) にて,37 嫌気下 (80 % N 2,10 % H 2, 10% CO 2 ) で培養し, リコンビナントタンパク作成時の DNA 抽出および菌増殖能の確認実験に fima II 型を, Lipopolysaccharide(LPS) の抽出に fima I 型および II 型を用いた. 2. 細胞培養ヒト気管上皮細胞である BEAS-2B 細胞 ( ATCC CRL TM ) を 10% ウシ胎児血清 (Fetal bovine serum; FBS) および抗菌薬 (50 units/ml penicillin, 50μg/ml streptomycin;gibco, USA) を含む Dulbecco s modified Eagle s medium(d-mem;sigma, USA) にて 37,95% air,5% CO 2 の条件下にて培養し, 実験に供した. 3.P. gingivalis 由来 LPS の抽出 fima I 型および fima II 型から Hot phenol 法 35) にて LPS を抽出した. 4. 遺伝子組み換えタンパク ( リコンビナントタンパク ) の作成および精製 fima II 型由来タンパクである FimA,Mfa1 および PepD のリコンビナントタンパク (rfima,rmfa1, rpepd) の作成は,Aoki ら 27) の方法に従い,Profinity exact cloning kit(bio-rad, USA) を用いて行った. まず,fimA II 型より調整した染色体 DNA を鋳型として, それぞれの遺伝子を増幅させるため polymerase chain reaction;pcr を行った. プライマーの設計は,NCBI データベースから P. gingivalis TDC 60 株 (GenBank: AP ) のゲノム情報を得た後, プライマー 3 ( primer3plus.cgi) を用いて行った. 本実験に供したプライマーは表 1 に示したとおりである. 得られた PCR 産物を,1% アガロースゲルによる電気泳動後のゲルから

3 障害者歯科第 36 巻第 4 号 精製し,pEXACT 発現ベクター (Bio-Rad, USA) を用いてライゲーションした.E.coli DH5αに形質転換後, ミニプレップ (Invitrogen TM, Life technology, USA) にて精製しプラスミドを構築した. 構築したプラスミドを制限酵素 Hind III(NIPPON GENE Co., Japan) および EcoR I(NIPPON GENE Co., Japan) にて切断後 1% アガロースゲルにて電気泳動し DNA をゲルから切り出した. 切り出したゲルを Nucleospin(Invitrogen TM, Life technology, USA) にて精製し,pEXACT 発現ベクターを用いてライゲーションした. 次にタンパク発現用に E.coli BL21 に形質転換し Ampicillin 含有 LB 寒天培地にて播種後, 得られたシングルコロニーから目的の遺伝子が導入されたものを選択した. 選択したコロニーを LB 液体培地にて 18 時間培養した後, 新しい LB 液体培地に播種し,O.D. 600 nm で 0.8 に達するまで培養した. さらに,Isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG ;TaKaRa, Japan) を最終濃度 1 mm で添加し 5 時間の培養を行った.E. coli を Bacterial Protein Extraction Reagent(B-PER;PIERCE, USA) で懸濁し,Multi- Beads Shocker(Yasui Kikai Co., Japan) を用いて破砕処理した. 遠心上清を回収し Profina Protein Purification System(Bio-Rad, USA) にて精製を行った. 5.リコンビナント hemin binding protein(rhbp35) の作成および精製菌外膜タンパク質である HBP35 のリコンビナントタンパク rhbp35 は Kawamoto ら 36) の方法に従い作成した後,Q-セファロースカラムおよび Toyopearl Butyl- 650M カラム (Tosoh Bioscience, Japan) にて精製し, 実験に供した. 6.BEAS-2B 細胞における Interleukin-8(IL-8) 産生量の測定 BEAS-2B 細胞を24 well 培養プレート (Corning, USA) に 細胞 /well になるよう播種し,18 時間培養後,FBS および抗菌薬を含まない D-MEM(2% FBS 含有 ) にて rmfa1(0.5 mg/ml),rfima(0.1 mg/ ml),rpepd(0.1 mg/ml),rhbp35(5.5 mg/ml) および fima II 型由来 LPS(0.1 mg/ml) の添加 24 時間後に培養上清を回収し,ELISA Kit(Affymetrix, USA) を用い吸光度 450 nm にて IL-8 産生量を測定した. それぞれのリコンビナントタンパク濃度はタンパク量を均一にし, 細胞に添加した予備実験により決定した. また fima I 型および II 型由来 LPS における影響の違いを確認するため, 同様に培養した BEAS-2B 細胞にそれぞれの菌株から抽出した LPS を,0.01,0.1,0.5,1μg/ml の濃度で添加し 24 時間後の培養上清中の IL-8 産生量を ELISA kit(affymetrix, USA) を用いて測定した. 7.rPepD 添加の BEAS-2B 細胞における Interleukin-6(IL-6) および IL-8 産生量の測定 rpepd による経時的な影響を確認するため, 方法 6 と同様に培養した BEAS-2B 細胞に 1μg/ml のrPepD を添加し,4,8 および 24 時間後の培養上清を回収し, ELISA Kit(Affymetrix, USA) を用い, 吸光度 450 nm にて IL-6 および IL-8 産生量を測定した. 8.fimA II 型の増殖に対するベスタチンの影響 fima II 型を方法 1 に示した条件下にて 48 時間嫌気培養した後,Grenier ら 34) の報告に従い,2 v/v% になるように新鮮な培地に播種した. ベスタチンを 0.1,0.5, 2.5 および 12.5μg/ml の濃度で添加し,56 時間連続培養を行い, 経時的に O.D. 600 nm における濁度を測定した. 9. アミノペプチダーゼ阻害剤添加による rpepd 活性の測定アミノペプチダーゼ阻害剤として Phebestin,Amastatin,Leuhistin,ArphamenineB およびベスタチンを使用し,Aoki ら 27) およびWang ら 37) の方法に従い rpepd の活性を測定した. まず,50 mm Tris-HCl buffer(ph 7.4) に,rPepD(0.5 mg/ml), 各アミノペプチダーゼ阻害剤 (1μM) を添加し,2 mm カルノシン (βalanyl-histidine;β-ala-his) あるいはα-alanyl-histidine (α-ala-his) を基質として加え, 反応を開始させた. 37 で 1 時間経過した後,1% trichloroacetic acid を加えて室温で 30 分間静置し反応を停止させた. 次に,1 mg/ml の O-phthaldialdehyde(OPA) を反応溶液に加え, 暗所にて 37 で 15 分間誘導体化反応を行った. OPA により誘導体化された L-histidine は Fluoroskan Ascent FL(Thermo Scientific, USA) にて励起波長 355 nm および蛍光波長 450 nm により検出した. 10. 統計分析実験結果は, 平均値 ± 標準偏差 (mean±sd) で示し, 2 群間の比較には Student s t-test を用いた. 結果 1.rFimA,rMfa1, rhbp35,lps(fima II 型 ) および rpepd の BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量への影響 P. gingivalis 構成成分および産生成分の違いによる BEAS-2B 細胞の応答性を確認するために, 各リコンビナントタンパクを添加することによって培養上清中に分

4 608 気管上皮細胞における P. gingivalis の病原因子 図 1 fima II 型 P. gingivalis の構成成分および産生成分の違いによる BEAS-2B 細胞の IL-8 産生量への影響 BEAS-2B 細胞に rmfa1,rfima,rpepd, rhbp35,lps を 24 時間添加した後, 回収した培養上清中における IL-8 産生量を ELISA 法にて測定した.rMfa1,rFimA,rPepD,LPS の添加によって IL-8 産生量は有意に増大し,rHBP35 添加ではコントロールと比較して有意な差を認めなかった ( * p< 0.05). 泌された IL-8 産生量を測定した. 添加したリコンビナントタンパクによって IL-8 産生量は異なり, コントロールと比較して,rMfa1,rFimA,LPS および rpepd では有意に高く,rHBP35 では変化が認められなかった. 特に, コントロールの産生量が 80 pg/ml(sd 0.01) であったのに対し rmfa1,rfima,rpepd による産生量は, それぞれ325 pg/ml(sd 0.05),346 pg/ml(sd 0.06),335 pg/ml(sd 0.07) であり,LPS による産生量の 105 pg/ml(sd 0.03) と比較してもきわめて高い値であった ( 図 1). 2.LPS による BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量への影響 fima 遺伝子型の違いによる LPS 応答性を確認するために,fimA I 型およびII 型から抽出したLPS を BEAS-2B 細胞に添加した.fimA I 型および fima II 型由来の LPS ともに濃度依存的に BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量を増大させた. さらに,LPS 濃度が 0.01 μg /ml においては有意な差を認めなかったものの 0.1, 0.5,1μg/ml においては BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量は,fimA II 型由来 LPS よりも fima I 型由来 LPS によるほうが有意に高かった (p<0.05)( 図 2). 図 2 fima I 型および II 型由来 LPS 添加による BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量への影響 BEAS-2B 細胞に fima I 型および II 型由来 LPS を 24 時間添加した後, 回収した培養上清中における IL-8 産生量を ELISA 法にて測定した.fimA I 型, II 型由来 LPS はともにBEAS-2B 細胞における IL-8 産生量を濃度依存的に増大させた. さらに, LPS 濃度 0.1~1μg /ml においては,fimA I 型由来 LPS のほうが,fimA II 型由来 LPS よりも有意に BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量を増大させた ( * p<0.05). 内斜線 :Control, :fima I 型 LPS (ATCC33277), :fima II 型 LPS ( TDC 60 株 ) 3.rPepD による BEAS-2B 細胞における IL-6 および IL-8 産生量への影響 rpepd による BEAS-2B 細胞における経時的な炎症応答性を確認するために,BEAS-2B 細胞に rpepd を添加し培養上清中における IL-6 および IL-8 産生量を測定した.rPepD を添加した BEAS-2B 細胞培養上清中における IL-6 および IL-8 の産生量は, すべての作用時間においてコントロールに比べて有意に増大した (p< 0.05). また,IL-6 および IL-8 産生量ともに 8 時間までは時間依存的に増大し,24 時間で減少した ( 図 3A, B). 4.fimA II 型の増殖能におけるベスタチンの影響アミノペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンによる fima II 型の増殖能への影響を確認するために, さまざまな濃度のベスタチン添加下で fima II 型の増殖実験を行ったところ, ベスタチン濃度 0.1μg/ml および 0.5μg/ ml では対数増殖期における増殖は抑制され, 濃度 2.5 μg /ml および 12.5μg/ml では対数増殖期を認めなかった ( 図 4).

5 障害者歯科第 36 巻第 4 号 図 3 rpepd 添加による BEAS-2B 細胞における IL-6 および IL-8 産生量への影響 BEAS-2B 細胞に rpepd を 4,8,24 時間添加した後, 培養上清中の IL-6 産生量 (A) および IL-8 産生量 (B) を ELISA 法にて測定した.BEAS-2B 細胞における IL-6 および IL-8 産生量ともに,rPepD 添加によりすべての添加時間でコントロールと比較し有意に増大した ( * p<0.05). また,BEAS-2B 細胞における IL-6 および IL-8 産生量ともに 8 時間まで時間依存的に増大し,24 時間添加で減少した. :Control, :rpepd 図 4 ベスタチンによる fima II 型 P. gingivalis TDC 60 株の増殖能への影響ベスタチン添加濃度が 0.1μg/ml,0.5μg/ml では,fimA II 型 P. gingivalis TDC 60 株は対数増殖期において増殖が抑制され,2.5μg/ml,12.5μg/ml では対数増殖期が認められなかった. 5. アミノペプチダーゼ阻害剤による rpepd 活性への影響ベスタチンによる fima II 型の増殖抑制の原因と, さらに新規治療薬の標的としての PepD の阻害剤を検索するために, ベスタチンを含めたアミノペプチダーゼ阻害剤を添加し rpepd 活性を測定した.rPepD の活性は, α-alanyl-histidine を基質とした場合,Leuhistin およびベスタチンではコントロール群と比較して高い値を示し,Phebestin,Amastatin,ArphamenineB でコントロール群と比較して低い値を示した. いずれにおいても著しい阻害は認められなかった ( 図 5A). 一方,PepD の特異的基質として報告がある 27) カルノシン (β-alanylhistidine) を基質とした場合, ベスタチン添加で rpepd の活性は著しく阻害された (p<0.01)( 図 5B). 考 察 われわれは進行性歯周病患者から多く検出される fima II 型 P. gingivalis から産生されるペプチダーゼである PepD の気管上皮細胞に対する影響を調べるために,BEAS-2B 細胞を用いてその為害性を検討するとともに,PepD をターゲットとした分子標的治療薬開発への足掛かりとして, その阻害剤の検索を行った. これまでに PepD による生体細胞への為害性についての研究報告はみられないため, まず P. gingivalis の病原因子と比較することとした. その結果,rFimA,rMfa1,LPS (fima II 型 ) および rpepd の添加によって BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量は増大し,rHBP35 作用では増大しなかった. 線毛である FimA および Mfa1 は, 付着, バイオフィルムの形成, 他の菌種との共凝集に深く関与するうえ, 宿主の免疫系統へも影響を及ぼすとされている 38~40).Nakagawa ら 41) は,fimA II 型の線毛は他の型に比べて歯肉上皮細胞への付着能力が高く, それが fima II 型の示す強い病原性に深く関与していると報告している. 本実験において,BEAS-2B 細胞に対し線毛である rfima,rmfa1 は IL-8 産生量を増大させており,fimA II 型の線毛は歯肉上皮細胞のみならず, 気管上皮細胞に対しても高い付着能力をもち, 慢性炎症を誘発する可能性があることが示唆された. 一方, 細胞外膜に存在しヘミン結合性を有する

6 610 気管上皮細胞における P. gingivalis の病原因子 図 5 アミノペプチダーゼ阻害剤による rpepd 活性への影響酵素活性はα-Ala-His もしくはβ-Ala-His の基質と 50 mm Tris-HCl バッファー (ph 7.4) の存在下で 0.5 mg/ ml の rpepd に 1μM のそれぞれのアミノペプチダーゼ阻害剤を添加し 1 時間インキュベートした後に測定した. rpepd の酵素活性はα-Ala-His 基質下ではどのアミノペプチダーゼ阻害剤も顕著な阻害は認められなかった (A). 一方,β-Ala-His( カルノシン ) 基質下ではベスタチンによってきわめて顕著に低下した ( ** p<0.01)( B). rhbp35 による BEAS-2B 細胞への影響は認められなかった.HBP35 は, 線毛による生体組織への付着 定着 侵入に関与したり, ジンジパインなどのプロテアーゼの細胞表層への移送に関与したりとマルチ機能をもつといわれており,HBP35 欠損株では多くの病原性が失われていたとの報告もある 42,43). したがって BEAS-2B 細胞において,HBP35 は単独ではなく他因子との相互作用により細胞為害性を示す可能性はあると考えられ, より深い検索が必要である. さらに本実験結果で興味深いのは,LPS の BEAS-2B 細胞に対する影響である. グラム陰性菌の外膜に存在する LPS は, その病原性について多くの報告があるため 44~46), われわれは進行性歯周病患者から多く検出される fima II 型由来 LPS の病原性は非常に高いと予測していた. しかしながら, 本実験では,rFimA,rMfa1 および rpepd に比べ IL-8 産生量は低いものであった. 原因の一つとして, 過去の研究の多くが fima I 型由来もしくは E. coli 由来の LPS であるのに対し, 本実験では fima II 型由来のものであったことが考えられた. そこで,fimA I 型とfimA II 型から抽出したLPS を BEAS-2B 細胞に作用させたところ,BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量は,fimA II 型由来の LPS に比べて fima I 型由来の LPS のほうが有意に高かった ( 図 2). このことは,fimA II 型が示している病原性は LPS によるのではなく,FimA,Mfa1 および PepD などの他因 子の影響が大きいと考えられた. 次に病原因子としての PepD の可能性を確認するために,BEAS-2B 細胞に rpepd を添加し, 炎症応答の目安となる IL-6 および IL-8 の培養上清中の産生量を測定したところ,IL-6,IL-8 ともに増大した ( 図 3).PepD と同様に P. gingivalis 生存のために働くプロテアーゼであるジンジパインや DPP IV は, エネルギー獲得だけでなく生体細胞に対し直接的もしくは間接的に病原性を示すことが指摘されている 19~25). ジンジパインはトリプシン様活性を示し 22,47),DPP IV はゼラチナーゼ様活性を示す 48~50) と報告されている. 作用は異なるものの, これらのプロテアーゼによって生体細胞は細胞膜を壊され障害を受けることになる. 一方,PepD はカルノシナーゼ様活性を示す 27) が, カルノシナーゼが直接的に細胞障害性を示す報告はない. しかしながら本実験で rpepd によって BEAS-2B 細胞における IL-6 および IL-8 の産生量が増大したのは事実であり, 今後検討が必要であるものの PepD はプロテーゼであるがゆえに, 細胞表層のタンパクを分解した可能性が考えられた. PepD も他のプロテアーゼ同様に P. gingivalis による生体細胞障害性において,P. gingivalis の生存を助けることで間接的に関与するとともに, 細胞表層タンパクの分解によることで直接的にも関与することが示唆された. また炎症応答は生体細胞にとって異物を認識することで誘発されることから, 本実験における IL-6 および IL-8

7 障害者歯科第 36 巻第 4 号 産生量の増大は,rPepD が BEAS-2B 細胞において病原因子として認識されたことを示していると考えられる. 特に,IL-8 は好中球の遊走と活性化を誘導し, 呼吸器感染において好中球を局所に浸潤させることが知られており 51~53), 本実験の PepD による BEAS-2B 細胞における IL-8 産生量の増大は, 免疫能力が低下している場合には症状を増悪させる可能性があることを示していると考えられた. しかしながら,PepD の直接的な細胞障害性を明らかにするためには, 今後 PepD の生体への付着や侵入能力を確認するなどのさらなる検討が必要であると思われた. Aoki ら 27) によれば fima II 型の PepD は,M20 ファミリーに属するカルノシナーゼと相同性が高く,β-alanine と L-Histidine で構成される L-Carnosine(β-alanyl-l- Histidine) の合成, 分解を制御する. ヒト生体におけるカルノシンは脳, 筋を中心にさまざまな臓器に存在し, 加齢, 神経変性疾患, 精神疾患などの抑制に関与する 54~56).L-Carnosine はヒト胎児肺線維芽細胞において細胞の寿命を決定づけるテロメアの短縮を抑制することで細胞の老化を防ぐこと 57) や,LPS によって炎症や酸化ストレス障害を誘発させたマウス神経膠細胞においてカルノシン添加により障害性が軽減されることが報告されている 58). カルノシナーゼは, このように生体において細胞老化の抑制や細胞障害の治癒など, 細胞の機能維持に重要な役割を果たす存在であるカルノシンを分解するため創薬研究のターゲットとなりえ, 最近の研究では, 幅広い基質特異性をもち合わせるカルノシナーゼを阻害することでの抗菌物質や抗がん剤としての有用性も報告されている 59,60). 一方, カルノシナーゼ欠損によって代謝異常が生じ, 緊張低下, 神経発達遅延, 知的障害などを誘発する報告もある 61,62). 生体にとって酵素は生理機能の恒常性を維持するため, そのバランスが重要となってくる. しかしながら, 現在までに有用性と為害性のどちらの観点からも生体産生のカルノシナーゼが生体細胞に直接的に働く報告はない.PepD と同様の酵素である Lactobacillus brueckii の PepV は生体に感染した際にカルノシンを分解することで菌による生体組織破壊能力を増大させ, 結果的に病的影響力を出すと報告されている 63). 今回 BEAS-2B 細胞はfimA II 型 PepD が添加されることで, 恒常性のバランスが崩れ, 細胞が破壊された可能性も考えられる. つまり気管上皮細胞において, 恒常性のバランスが崩れた場合,PepD によって細胞の保護に働くカルノシンの機能が阻害され細胞障害性を示す可能性があることも考えられる. Aoki ら 27) によると fima II 型の PepD は,Vibrio alginolyticus(v. alginolyticus) の PepD とタンパク構造上の相同性が高い.V. alginolyticus の PepD が直接的に 細胞障害性を示すとした報告はないが, バイオフィルムの形成に関与すると考えられている 36,64,65). ジンジパインや DPP IV は, バイオフィルムの形成や線毛による付着 定着 侵入に関与するだけでなく, 直接的な細胞障害性を有するといわれている 19~25).PepD も同様に BE- AS-2B 細胞に対して間接的および直接的に組織障害性に関与した可能性があると考えられた. また PepD による分解産物は L-Histidine とβ-alanine であり, いずれも抗炎症作用をもつことで知られており 66), ヒスチジン脱炭酸酵素によって合成されるヒスタミンはさまざまな臓器に存在し, 生理機能を担うとされている 67,68). しかしながら, ヒスタミンは過剰に分泌されるとアレルギー疾患の原因となる 69). これらのことから, 気管上皮細胞においても PepD による分解産物が炎症応答誘発に関与する可能性が考えられる. 口腔常在菌である P. gingivalis が生体へ付着 定着 侵入し病原性を発揮するためには, さまざまな因子との相互作用が不可欠である. 今回着目した PepD が菌と生体との協調関係のバランスを崩すことで, 結果的に単体では弱小であった反応が大きな反応を誘発していく可能性があると考えられる 年代から薬剤開発の一助として微生物による代謝産物が注目されているが, その一つであるベスタチンは放線菌の代謝産物として発見され, アミノペプチダーゼ B およびロイシンアミノペプチダーゼを阻害する 70). ベスタチンが fima I 型の増殖抑制をしていることが明らかにされている 33,34) が, 本実験で fima II 型もベスタチンによって濃度依存的に増殖を抑制されることが明らかになった. 現在までに Kgp がベスタチンの標的酵素とした報告はあるが, 活性抑制は低く,Rgp および DPP IV については活性抑制が認められず, ベスタチンの明確な標的酵素は不明である 71). 本実験でベスタチンによって PepD 酵素活性が著しく低下した. つまり, ベスタチンの標的酵素が PepD であることが示された. ベスタチンは, マクロファージや T 細胞などの表層に存在するこれらの酵素に働きかけることで免疫調節物質としての機能をもつことが明らかにされており, その機能を利用して急性骨髄性白血病をはじめとした癌治療において臨床的にも応用されている 72,73). また生体組織への毒性を示さず, 臨床的にも副作用は少ないとされている. 以上のことからベスタチンは口腔のみならず気管上皮細胞における P. gingivalis によって誘発される炎症性疾患における PepD をターゲットとした分子標的治療薬として有用性が高いことが考えられた. 近年疾患の多くが慢性的経過を示し, ヒトの生命活動において QOL の維持は重要な課題となっている. 以前の網羅的な治療よりも病原因子のみを標的とした治療は

8 612 気管上皮細胞における P. gingivalis の病原因子 この課題を解決していくうえで重要な役割を担うと考えられる. 全身においては癌治療をはじめとして多くの疾患で分子標的薬による治療へとシフトしている. 今回の実験の結果からも明らかなように,fimA II 型の産生する PepD が気管上皮細胞である BEAS-2B 細胞において IL-6 ならびに IL-8 産生量の増大を誘発しており, 口腔常在菌のコントロールは全身の健康を維持する意味でも非常に重要である. 特に重度, 軽度を問わず障害を有する場合, 遺伝的背景や環境因子によって口腔機能と全身機能の相関性は高いものと考えられる. 今後, 口腔領域からのアプローチにおいても分子標的による治療へのシフトが必要不可欠であると考えられる. さらに PepD のみならず他のペプチダーゼについても検討を続けていくことで, 障害児者, 高齢者の全身の健康にフィードバックすることが可能になるのではないかと考えている. 結論 P. gingivalis におけるエネルギー獲得に関与する PepD は気管上皮細胞である BEAS-2B 細胞において IL-6 および IL-8 の産生を誘発させ, 慢性炎症に関与することが考えられた. さらに P. gingivalis の増殖を抑制するベスタチンの標的酵素が PepD であることが示され, ベスタチンには, 口腔だけでなく全身において,P. gingivalis によって誘発される慢性炎症に対する分子標的治療薬としての可能性があると考えられた. これらを明確にするためには, さらなる研究によって科学的根拠を探求する必要がある. 謝辞本研究は日本大学松戸歯学部研究推進費により遂行された. また, 本研究に多大なるご指導を賜り,P. gingivalis TDC 60 株における PepD タンパクの機能に着眼しつつも, 研究遂行半ばにご逝去されました元日本大学松戸歯学部生化学 分子生物学講座柴田恭子先生に深い感謝と追悼の意を表します. 文献 1)Socransky, S.S., Haffajee, A.D., et al.:microbial complexes in subgingival plaque. J. Clin. Periodontol., 25: , ) Dzink, J.L., Socransky, S.S., et al.:the predominant cultivable microbiota of active and inactive lesions of destructive periodontal diseases. J. Clin. Periodontol., 15: , )Hussain, M., Stover, C.M., et al.:p. gingivalis in periodontal disease and atherosclerosis Scenes of action for antimicrobial peptides and complement. Front. Immunol., 6:45, ) Beck, J., Garcia, R., et al.:periodontal disease and cardiovascular disease. J. Periodontol., 67: , ) Casanova, L., Hughes, F.J., et al.:diabetes and periodontal disease:a two-way relationship. Br. Dent. J., 217: , ) Koziel, J., Mydel, P., et al.:the link between periodontal disease and rheumatoid arthritis:an updated review. Curr. Rheumatol. Rep., 16:408, ) Cavrini, F., Sambri, V., et al.:molecular detection of Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis in carotid and aortic atheromatous plaques by FISH: report of two cases. J. Med. Microbiol., 54:93-96, ) Kimizuka, R., Kato, T., et al.:mixed infections with Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola cause excessive inflammatory responses in a mouse pneumonia model compared with monoinfections. Microbes. Infect., 5: , ) Nelson, K.E., Fleischmann, R.D., et al.:complete genome sequence of the oral pathogenic acterium Porphyromonas gingivalis strain W83. J. Bacteriol., 185: , ) Watanabe, T., Maruyama, F., et al.:complete genome sequence of the bacterium Porphyromonas gingivalis TDC60, which causes periodontal disease. J. Bacteriol., 193: , ) Naito, M., Hirakawa, H., et al.:determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res., 5: , )Nagano, K., Abiko, Y., et al.:porphyromonas gingivalis FimA fimbriae:roles of the fim gene cluster in the fimbrial assembly and antigenic heterogeneity among fima genotypes. J. Oral Biosci., 54: , )Morten, E., Nakano, K., et al.:porphyromonas gingivalis fimbriae. J. Oral Microbiol., 5: , )Hua, X., Whasun, O.C., et al.:regulation of the Porphyromonas gingivalis fima(fimbrillin)gene. Infect. Immun., 68: , )Amano, A., Nakagawa, I., et al.:distribution of Porphyromonas gingivalis strains with fima genotypes in periodontitis patients. J. Clin. Microbiol., 37: , ) 天野敦雄 :Porphyromonas gingivalis 線毛の付着能と遺伝子多型の歯周病原性との関連. 日歯周誌,45: , ) Amano, A., Kishima, T., et al.:relationship of periodontopathic bacteria with early-onset periodontitis in

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11 JJSDH 36: ,2015 障害者歯科第 36 巻第 4 号 The Effect of Proteolytic Enzyme PepD from Porphyromonas gingivalis on Bronchial Epithelium HISHINUMA Mitsue 1), TANAKA Yoko 2), YAGUCHI Manabu 2), KUWAHARA Noriko 3) and NOMOTO Takato 2) 1) Nihon University Graduate School of Dentistry at Matsudo 2) Department of Special Needs Dentistry, Nihon University School of Dentistry at Matsudo 3) Department of Microbiology, Nihon University School of Dentistry at Matsudo Oral bacteria are implicated in certain systemic diseases such as coronary heart disease, stroke, diabetes mellitus, atherosclerosis and aspiration pneumonia. Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)is strongly associated with severity of aspiration pneumonia for immunocompromised hosts and the elderly with oral dysfunction. P. gingivalis is an asaccharolytic bacterium that relies on fermentation of amino acids for the production of metabolic energy. Various proteinases produced by P. gingivalis play a role in the growth and virulence of P. gingivalis. According to a previous study, P. gingivalis fima genotype II was detected at the highest frequency in patients with severe periodontal disease. In addition, aminoacyl-histidine dipeptidase (PepD)was strongly expressed in P. gingivalis fima genotype II. However, there are few reports that focused on PepD of P. gingivalis fima genotype II. Therefore, we studied the effectiveness of PepD on bronchial epithelial cells, BEAS-2B cells, and the usefulness of Bestatin, an aminopeptidase inhibitor, as antibacterial therapy. The production of IL-6 and IL-8 from BEAS-2B cells was enhanced by PepD. Furthermore, PepD was a target enzyme of Bestatin. These results suggested that PepD plays a role in not only the metabolism but also the virulence of P. gingivalis and may represent a target for molecular targeted therapy.