ISOPLANT　マニュアル第10版

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ひでたつにばし
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1 植物酵母細菌からの DNA 抽出キット ISOPLANT マニュアル ( 第 10 版 ) Code No Code No 回用 20 回用 NIPPON GENE CO., LTD.

2 目次 Ⅰ 製品説明 p.2 Ⅱ 内容 p.2 Ⅲ 保存 p.2 Ⅳ 使用上の注意 p.3 Ⅴ プロトコール p.4 Ⅵ トラブルシューティング p.6 Ⅶ Q&A p.6 Ⅷ データ集 p.7 1. 植物からの DNA 抽出 p.7 2. 細菌からの DNA 抽出 p.8 3. 酵母からの DNA 抽出 p.9 4. 放線菌及びカビからの DNA 抽出 p.9 Ⅸ 参考文献 p

3 Ⅰ 製品説明 ISOPLANT( アイソプラント ) は植物酵母細菌 ( カビ等を含む ) から短時間に DNA を抽出するためのキットである SolutionⅡの主成分である塩化ベンジルによって細胞壁細胞膜及び核膜等が破壊され界面活性剤の存在下で可溶化するため特に植物の場合 grind することなく DNA を抽出することができる従って多数のサンプルを処理する際には大変便利である双子葉植物はもちろん単子葉植物からも前処理なしで DNA を抽出でき得られた DNA はそのまま PCR や制限酵素反応に使用することができる Ⅱ 内容 (100 回用 ) (20 回用 ) SolutionⅠ : Extraction Buffer* 30 ml 6 ml SolutionⅡ : Lysis Buffer 15 ml 3 ml SolutionⅢ : Sodium Acetate (ph5.2) 15 ml 3 ml TE(pH8.0) : 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 10 ml 2 ml RNase A : 1 mg/ml 100μl 20μl * SolutionⅠ 中に白い沈殿が現れることがありますが品質に問題はありませんこのような場合には 37 程度の湯浴にて結晶を完全に溶解させてから使用してくださいまた SolutionⅠにはタンパク質変性剤等が含まれているので取扱いに注意してください目に入ったり皮膚に付着した場合には直ちに多量の水で十分洗い流してください Ⅲ 保存冷蔵保存 ( 2~10 ) RNase A 以外は室温での保存も可能ですまた長期間ご使用にならない場合は RNase A を冷凍保存 (-20 ) してください - 2 -

4 Ⅳ 使用上の注意本品は試験研究用試薬ですので医薬品その他の目的にはご使用になれませんまた試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい本品に含まれる SolutionⅡ の主成分は塩化ベンシルです塩化ベンジルは医薬用外毒物ですので取扱いの際にはご注意くださいご使用の際には適切な保護具 ( 手袋眼鏡等 ) を着用してください蒸気を吸入しないようにし換気を十分に行ってください目に入ったり皮膚に付着したりした場合は大量の水で少なくとも 15 分間は洗い流し医師の診察を受けてください本品の取扱いはマニュアル記載内容通りに行ってくださいマニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては弊社では責任を負いかねます安全性データシート (SDS) につきましてはニッポンジーン WEB ページ ( にてご覧になれます - 3 -

5 Ⅴ プロトコール Sample* 1) SolutionⅠ 300μl* 2 ) ボルテックス, 1~2 秒 SolutionⅡ 150μl* 3 ) ボルテックス, 5~6 秒 * 4) インキュベーション, 50, 15 分 * 5 ) SolutionⅢ 150μl* 6 ) ボルテックス, 1~2 秒氷上, 15 分 * 7 ) 12,000 g, 4, 15 分水相 * 8 ) 2 ~ 2.5 倍量エタノール * 9 ) 混合 12,000 g, 4, 10 分沈殿 * 10 ) 70% エタノール洗浄乾燥 * 11 ) TE(pH8.0) 50μl DNA 溶液 * 12 ) - 4 -

6 *1) *2) *3) *4) *5) *6) *7) *8) *9) *10) *11) *12) 植物の場合 0.01~0.1 g をはさみで 3~5 mm 角に切って使用する植物の種類によって体積が異なるが SolutionⅡ を入れた際下層 (SolutionⅡ) に試料が完全に浸るようにした方が良いまたできるだけ新鮮な試料を用いるようにする凍結保存でも長時間にわたる場合には DNA の回収率が低下することがある酵母細菌等の場合には 1.5 ml culture を遠心して得られた沈殿 (~0.03 g) を用いる SolutionⅠ には SDS が含まれているので低温で保存すると白い結晶が現れることがあるこのような場合には 37 程度の湯浴にて完全に溶解させてから使用する本品に含まれる SolutionⅡ の主成分は塩化ベンジルである塩化ベンジルは医薬用外毒物であるため取扱いの際には注意が必要である ( 詳細は p.3 Ⅳ 使用上の注意を参照 ) ボルテックスすることにより白濁が起こる SolutionⅡ の主成分である塩化ベンジルによって細胞壁細胞膜核膜等が破壊され DNA が水相 ( 界面活性剤を含んでいる SolutionⅠ) に溶け出す植物試料の場合には通常形態の変化は目で確認できない SolutionⅢ を入れることにより白濁が起こる氷冷することにより白濁がすすむ有機相の塩化ベンジルや遠心後に認められる白い固形物等水相以外の物質ができるだけ混入しないようにする水相以外の物質が混入してしまった場合には再度遠心を行い水相のみを採取する DNA の物理的切断を防ぐためピペットチップの先端はカットして使用する PCR や制限酵素反応がうまくいかない場合にはエタノール沈殿を 2 回行うと改善されることがあるエタノール沈殿を行う際には -20 に冷却したエタノールを使用し添加後ただちに遠心する -20 での静置を長時間行った場合夾雑物が沈殿する原因となる DNA の沈殿は目に見えないことがある試料の種類により DNA 以外の沈殿が生じることがある例えばイネの場合には茶色の沈殿ホウレンソウの場合には DNA と異なる白い結晶状の沈殿が生じることがある沈殿を完全に乾燥すると非常に溶解しにくくなるので乾燥しすぎないように注意する DNA 以外の沈殿があった場合 (*10) 参照 ) DNA とともに TE に溶解させて使用する溶解しない場合には氷上にてしばらく静置して DNA を溶解させた後軽く遠心して上清を使用するなお沈殿に茶色い着色が認められる場合には p.6 Ⅵ トラブルシューティングを参照する DNA 溶液中の RNA を除く場合は添付の RNase A を 1μl( 終濃度 10~20 μg/ml になるように ) 加えて 37 にて 30 分反応させる必要があれば反応終了後フェノール / クロロホルム処理を行う - 5 -

7 Ⅵ トラブルシューティングトラブル SolutionⅠに白い結晶が現れるエタノール沈殿後の遠心で DNAが茶色く着色している PCR に対する影響はあるかマメ科に植物のような糖を多く含む試料を用いた場合ゼラチン状 ( 透明 ) の DNA 沈殿が得られた収量が少ない得られた DNA 溶液に多量の RNA が混入している得られた DNAを鋳型として PCR を行ったが増幅が見られない対策 37 程度の湯浴にて完全に溶解してから使用する沈殿物に茶色い着色が認められる場合には植物に多く含まれるポリフェノールが混入していることが考えられるこの物質は PCR を阻害するが予め SolutionⅠに 2-Mercaptoethanol を終濃度 2% になるよう加えることで緩和されることがあるゼラチン状の DNAを TEまたは H2Oにて溶解するこの溶解液の 1/2 容量の high-salt precipitation solution* を添加してよく攪拌した後 high-salt precipitation solution と同量のイソプロパノールを添加後攪拌してイソプロパノール沈殿を行う添加するイソプロパノールは冷却の必要はない添加後直ちに 10k g,15 分遠心して DNA 沈殿を得る *high-salt precipitation solution 組成 :1.2M NaCl, 0.8M Sodium citrate できるだけ新鮮な試料を使用する試料を細かく刻む (3 mm 角よりも小さくする ) スケールアップする 50 のインキュベーション中に数回転倒混和する得られた DNA 溶液に添付の RNase A を 1μl( 終濃度 10~20μg/ml になるように ) 加え 37 にて 30 分反応させるエタノール沈殿を 2 回行うと改善されることがあるこの際には -20 にて冷却したエタノールを使用し直ちに遠心する Ⅶ Q&A Q1. 植物試料の場合 SolutionⅡ を加えても試料の形態が変化しないのですが A1. 通常のプロトコール通りに処理を行った場合変化は目で確認できないが SolutionⅡ に浸して長時間放置しておくと形態が変化してくるしかしこの状態まで処理を行った場合最終的に得られる DNA 溶液中に夾雑物が多くなる可能性がある Q2. 果樹などの固い葉の場合通常のプロトコールでは DNA の収量が少ないのですが A2. 試料を予め液体窒素で凍結粉砕しておくと抽出できる場合がある Q3. 動物の組織細胞からも DNA 単離はできますか A3. 適していないがエビからは抽出できることが確認されている現在本キットを用いて DNA を抽出することが確認されているのは植物酵母細菌カビ等である (p.7 Ⅷ データ集を参照 ) - 6 -

Ⅷ データ集植物からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 ISOPLANT CTAB* 法 yield (μg/g) A260/280 yield (μg/g) A260/280 Arabidopsis thaliana 100-120 1.8 15-30 1.8 spinach 80-120 1.8 30-50 1.8 tobacco 4-20 1.

8 Ⅷ データ集植物からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 ISOPLANT CTAB* 法 yield (μg/g) A260/280 yield (μg/g) A260/280 Arabidopsis thaliana spinach tobacco tulip rice *CTAB 法 :cetyltrimethylammonium bromide 抽出 DNA の制限酵素反応抽出 DNA は制限酵素 (EcoRⅠ 及び HindⅢ) で切断できることを確認した M a b c a b c a b c a b c M lane 1 spinach 2 Arabidopsis thaliana 3 tobacco 4 rice a :intact b :EcoRⅠ digest c :HindⅢ digest M :Marker6(λ/StyⅠdigest) 抽出 DNA の PCR 抽出 DNA を鋳型として tobacco ribulose-1,5-diphosphate carboxylase large subunit gene を増幅するプライマーを用いた PCR にて特異的なバンドを増幅できることを確認した M lane 1 spinach 2 Arabidopsis thaliana 3 tobacco 4 tulip 5 rice M : Marker6(λ/StyⅠdigest) - 7 -

細菌からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 Anabaena variabilis Bacillus amyloiquefaciens Bacillus subtillis Escherichia coli Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Staphylococus aureus Thermus aquaticus

9 細菌からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 Anabaena variabilis Bacillus amyloiquefaciens Bacillus subtillis Escherichia coli Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Staphylococus aureus Thermus aquaticus Xanthomonas holcicola ISOPLANT phenol/chloroform 法 yield (μg/g) A260/280 yield (μg/g) A260/ 抽出 DNA の制限酵素反応抽出 DNA は制限酵素 (EcoRⅠ 及び HindⅢ) で切断できることを確認した M a b c a b c a b c lane 1 Escherichia coli JM109 2 Staphylococus aureus 3A 3 Pseudomonas aeruginosa a :intact b :EcoRⅠ digest c :HindⅢ digest M :Marker6 (λ/styⅠ digest) 抽出 DNA の PCR 抽出 DNA を鋳型とした PCR にて特異的なバンドを増幅できることを確認した M lane 1 Escherichia coli JM109 2 Bacillus amyloiquefaciens 3 Bacillus subtillis 4 Staphylococus aureus 3A M :Marker6 (λ/styⅠ digest) - 8 -

酵母からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 Saccharomyces cerevisiae Shizosaccharomyces pombe Phichia pastoris yield(μg/ mg ) A260/280 0.504 1.83 0.348 1.79 2.523 1.

10 酵母からの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 Saccharomyces cerevisiae Shizosaccharomyces pombe Phichia pastoris yield(μg/ mg ) A260/ M lane 1 Saccharomyces cerevisiae 2 Shizosaccharomyces pombe 3 Phichia pastoris M:Marker6 (λ/styⅠdigest) 放線菌及びカビからの DNA 抽出抽出 DNA の収量と純度 Mycrobacterium phlei Nocardia asteroides Streptomyces albus Streptomyces sp.2-1 Streptomyces sp.my-31 Neurospora sitophila Rhizopus nigricans Penicillius chrysogenum Q176 Aspergillus awamori Aspergillus japonicus Aspergillus niger Aspergillus oryzae yield (μg/g) A260/

11 Ⅸ 参考文献 1) Anil K.Jhingan,Methods in Molecular and Cellular Biology,3,15(1992) 2) Heng Zho,Nucleic Acids Research,21(22),5279(1993)

12 マニュアル記載内容や製品仕様価格に関しては予告なしに変更する場合がありますお問い合わせ先株式会社ニッポンジーン研究試薬部学術営業課 TEL お問い合わせはお電話もしくは WEB フォームより承っております

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