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めぐのさくもと
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1 LC-MS MS LC-MS MS LC-MS MS D-DIGE IMAC D-DIGE p MAP BAG p MAPKAPK Wang D-DIGE D-DIGE ERK MAP

２３２０年２月 IMAC と２D-DIGE の併用に加えてエストロゲン受容体バーの消失や細胞運動性の上昇が促されることを明らかにとの融合によるキナーゼ活性の操作系とリン酸化モチーフした７一方で一部のヌクレオポリンが有する FG リピー抗体を取り入れた新たなリン酸化プロテオーム解析法を開ト領域疎水的なフェニルアラニングリシン配列の繰り６発した図そして新規 ERK

2 ２３２０年２月 IMAC と２D-DIGE の併用に加えてエストロゲン受容体バーの消失や細胞運動性の上昇が促されることを明らかにとの融合によるキナーゼ活性の操作系とリン酸化モチーフした７一方で一部のヌクレオポリンが有する FG リピー抗体を取り入れた新たなリン酸化プロテオーム解析法を開ト領域疎水的なフェニルアラニングリシン配列の繰り６発した図そして新規 ERK 基質を３種類同定し返しと親水性アミノ酸に富むリンカー配列からなるフレキその中に含まれていたアクチン架橋タンパク質 EPLIN とシブルな領域が ERK によってリン酸化されると輸送核膜孔複合体構成因子ヌクレオポリンに注目して機能運搬体である importin-β ファミリーとの疎水的な相互作用解析を行ったその結果 ERK によるリン酸化によってが抑制されることを見出した６核膜孔を介した核細胞質 EPLIN のアクチンとの親和性が低下しストレスファイ間の選択的輸送は核膜を有する真核生物にとってほぼ全図２D-DIGE を用いたリン酸化プロテオミクスによる ERK MAP キナーゼ基質候補の大規模同定まず活性型 B-Raf をエストロゲン受容体との融合タンパク質として安定に発現するマウス繊維芽細胞に対し MEK 阻害剤 U０２６またはエストロゲン受容体アンタゴニスト４-HT 処理によって Raf-MEK-ERK 経路を選択的に阻害または活性化したそして細胞抽出液を調製し IMAC によってリン酸化タンパク質を精製したそれぞれのリン酸化タンパク質画分を異なる蛍光色素で標識した後混合して同一ゲル上で二次元電気泳動して蛍光パターンを検出比較する２D-DIGE を行ったその結果 ERK 経路の活性化によってリン酸化されたと思われる変動スポットを多数検出することができた白矢頭などこれらの変動スポットの幾つかは ERK がリン酸化するコンセンサス配列を認識するリン酸化モチーフ抗体と反応したため ERK の直接的な基質と考えられた質量分析計を用いた解析により４９個の変動スポットから３８種類のタンパク質を同定することに成功した６みにれびゆう

3 DNA LC-MS MS LC-MS MS IMAC MOC LC-MS MS MS MS MS Ahn MS MS PO B-Raf-MEK-ERK ERK Fam b Fam b in vivo SILAC stable isotope labeling by amino acids in cell culture in vitro itraq isobaric tags for relative and absolute quantitation TMT tandem mass tagsmann SILAC stoichiometry Cdk Cell Signaling Technology Akt RSK p S SILAC PDGF LC-MS MS Phos-tag Phos-tag SDS-PAGE A Phos-tag B LC-MS MS ScanSite, NetPhos PhosphoSitePlus Phospho.ELM

4 Phos-tag A HeLa U U TPA Mn -Phos-tag SDS-PAGE FG Nup ERK B WTS A Nup Halo T Halo Phos-tag Halo Nup

5 D-DIGE SILAC itraq TMT D-DIGE SILAC itraq TMT X X SAXS kinome Kosako, H. & Nagano, K.Expert Rev. Proteomics,,. Kondo, T. & Hirohashi, S.Nat. Protoc.,,. Ueda, K., Kosako, H., Fukui, Y., & Hattori, S.J. Biol. Chem.,,. Tang, W., Kim, T.W., Oses-Prieto, J.A., Sun, Y., Deng, Z., Zhu, S., Wang, R., Burlingame, A.L., & Wang, Z.Y. Science,,. Morales, M.A., Watanabe, R., Dacher, M., Chafey, P., Osorio y Fortéa, J., Scott, D.A., Beverley, S.M., Ommen, G., Clos, J., Hem, S., Lenormand, P., Rousselle, J.-C., Namane, A., & Späth, G.F.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,,. Kosako, H., Yamaguchi, N., Aranami, C., Ushiyama, M., Kose, S., Imamoto, N., Taniguchi, H., Nishida, E., & Hattori, S. Nat. Struct. Mol. Biol.,,. Han, M.-Y., Kosako, H., Watanabe, T., & Hattori, S. Mol. Cell. Biol.,,. Kodiha, M., Crampton, N., Shrivastava, S., Umar, R., & Stochaj, U.Nucleus,,. Old, W.M., Shabb, J.B., Houel, S., Wang, H., Couts, K.L., Yen, C.-Y., Litman, E.S., Croy, C.H., Meyer-Arendt, K., Miranda, J.G., Brown, R.A., Witze, E.S., Schweppe, R.E., Resing, K.A., & Ahn, N.G.Mol. Cell,,. Olsen, J.V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M.L., Jensen, L.J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T.S., Nigg, E.A., Brunak, S., & Mann, M.Sci. Signal.,, ra. Moritz, A., Li, Y., Guo, A., Villén, J., Wang, Y., MacNeill, J., Kornhauser, J., Sprott, K., Zhou, J., Possemato, A., Ren, J.M., Hornbeck, P., Cantley, L.C., Gygi, S.P., Rush, J., & Comb, M. J.Sci. Signal.,, ra. Kinoshita, E. & Kinoshita-Kikuta, E.Proteomics,,. Kosako, H.Nat. Protoc., doi:. nprot... Huttlin, E.L., Jedrychowski, M.P., Elias, J.E., Goswami, T., Rad, R., Beausoleil, S.A., Villén, J., Haas, W., Sowa, M.E., & Gygi, S.P.Cell,,. Landry, C.R., Levy, E.D., & Michnick, S.W.Trends Genet.,,.

6 Rigbolt, K.T.G., Prokhorova, T.A., Akimov, V., Henningsen, J., Johansen, P.T., Kratchmarova, I., Kassem, M., Mann, M., Olsen, J.V., & Blagoev, B.Sci. Signal.,, rs. Global analysis of protein kinase substrates using phosphoproteomic techniques Hidetaka Kosako Division of Disease Proteomics, Institute for Enzyme Research, The University of Tokushima, Kuramoto-cho, Tokushima, Japan ROCO LRRK EGFR ROCO LRRK leucine-rich repeat kinase Ras GTPase MAPKK LRRK LRRK Park ROCO LRRK LRRK LRRK LRRK LRRKepidermal growth factor receptor, EGFR Grb growth factor receptor binding protein LRRK Grb EGFR EGFR LRRK EGFR EGFR EGFR MAP EGFR multivesicular body MVB ESCRT endosomal sorting complex required for transport ESCRT ESCRT- I II III EGFR MVB sorting EGFR ESCRT MVB EGFR LRRK EGFR EGFR EGFR LRRK LRRK Grb EGF Grb EGFR LRRK EGFR LRRK sirna LRRK EGFR MVB LRRK LRRK EGFR MVB LRRK EGFR MVB LRRK EGFR MVB EGFR MVB MVB EGFR

【ＰＤＦ作成用】平成23年度共同研究成果報告書.ren

【ＰＤＦ作成用】平成23年度共同研究成果報告書.ren / HAMMOC 90,000 10 HeLa HAMMOC nano-lc-ms 4,358 90 (MS) HAMMOC hydroxy acid-modi ed metal oxide chromatography 30 9 SILAC (stable isotope labeling by amino acids) HAMMOC 10 HeLa 13 C 15 N Arg 2 H Lys HeLa