Title 3 - 末端にグルコサミン類を有するオリゴヌクレオチド誘導体の合成とその生物活性の評価 ( 本文 (Fulltext) ) Author(s) 羅, 雄 Report No.(Doctoral Degree) 博士 ( 薬科学 ) 連創博甲第 23 号 Issue Date

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1 Title 3 - 末端にグルコサミン類を有するオリゴヌクレオチド誘導体の合成とその生物活性の評価 ( 本文 (Fulltext) ) Author(s) 羅, 雄 Report No.(Doctoral Degree) 博士 ( 薬科学 ) 連創博甲第 23 号 Issue Date Type 博士論文 Version ETD URL この資料の著作権は 各資料の著者 学協会 出版社等に帰属します

2 3'- 末端にグルコサミン類を有するオリゴヌクレオチド 誘導体の合成とその生物活性の評価 Synthesis of oligonucleotides with glucosamine at the 3'-position and evaluation of their biological activities 2013 羅雄

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4 目次 第 1 章緒言 1 第 2 章研究の背景及び目的 RNA 干渉の歴史 RNA 干渉の機構 RNA 干渉の特徴 sirna の医薬品化への問題点 sirna の DDS 研究 9 第 3 章グルコサミン誘導体による sirna の 3'- 末端化学修飾 塩基部非置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 塩基部置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 '- 末端にグルコサミン誘導体を含む sirna の合成 29 第 4 章 3'- 末端にグルコサミン誘導体を含む sirna の生物学的活性評価 sirna 二本鎖熱的安定性評価 Dual luciferase reporter assay によるタンパク発現抑制評価 Snake Venom Phosphodiesterase によるヌクレアーゼ耐性評価 細胞膜透過性評価 34 第 5 章結語 37 実験の部 43 参考文献 68 謝辞 74 参考資料 75

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6 第 1 章緒言 2000 年から 2011 年までの 12 年間 世界の医薬品市場は 2 倍以上の規模に拡大しており 年平均成長スピードは約 6% で堅調に伸びている (Fig. 1-1) また 世界中における人口増 高齢化などの要因から その成長率はまだまだ保持できると予想されている Fig. 1-1 医薬品市場規模の推移 ( 販売額 ) * * 日本製薬工業協会 DATA BOOK 2013 この大きな産業の発展を推進するのは医薬品の開発 いわゆる創薬である これまでの創薬は有機合成によるランダムな化合物から新薬の可能性を調べ尽くす もしくは微生物発酵物や動植物からの抽出物の分析による新薬の成分を探すという方法であった しかし このような創薬方法は資金 労力と時間がかなりかかるため 近年バイオ医薬品を中心とした創薬事業が進んでいる バイオ医薬品の開発は特定疾患を引き起こす要因となっている遺伝子 タン - 1 -

7 パク質の解明を基に生物によって生産される物質 ( タンパク質 核酸等 ) 治療法を探索することである 利点としては 以前の大量の候補化合物からのランダムスクリーニングに対して メカニズムを解明することで 明確な創薬標的を有する新薬の創製が可能な点が挙げられる このバイオ医薬品の発展は大きく 3 つの段階に分けられ 現在すでに第三世代の核酸医薬時代に入っている (Table 1-1) Table 1-1 バイオ医薬品の発展 世代医薬品名タイプ作用 第一世代 (1980 年代から ) ホルモン サイトカイン タンパク質 ホルモンなどの投入により 生体活 性化を促進する 第二代 (1990 年代から ) 抗体医薬 タンパク質 特定の標的分子の抗原抗体結合に より がんなどの疾病を治療する 第三世代 (2000 年代から ) 核酸医薬 DNA / RNA 遺伝子レベルの調整により 疾病の 治療と予防に関与する 核酸医薬は第一 第二世代と比べ 治療のターゲットをタンパク質からさらに前の段階に遡り 遺伝子レベルに至る 主な核酸医薬品は mrna を標的とし その配列を特異的に認識し 標的タンパク質の発現を抑制する 例えば アンチセンス法 リボザイム法と sirna 法である その中で 著者は sirna 法に注目し RNA 創薬の観点で研究を行った - 2 -

8 第 2 章研究の背景及び目的 2-1 RNA 干渉の歴史 RNA 干渉 (RNA interference: RNAi) とは 二本鎖 RNA (double strand RNA : dsrna) が相補的な標的 mrna を特異的に分解し 標的タンパク質の発現を抑制する現象である この手法は 2001 年 5 月に開催された RNA 学会 (RNA Society) で初めて発表されたが 最初にこの現象が発見されたのは 1990 年の植物実験であった Rich Jorgensen 氏はペチュニアに紫色の色素合成に関与する外来遺伝子を導入することで強い紫色を発色させようとしたが 得られたのは予想に反して斑入りの花であった 1) (Fig. 2-1) この現象は 外来遺伝子が何らかの原因で外来遺伝子及び内在性の遺伝子の発現を抑制したと推察され Co-suppression と名付けられた さらに同じ時期に他の植物研究所において 植物が RNA ウイルスの感染により RNA が特異的に分解されることが発見された 2,3,4,5) それ以降 転写後遺伝子サイレンシング (post-transcriptional gene silencing; PTGS) あるいは ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング (viral-induced gene silencing; VIGS) と呼ばれた Fig. 2-1 正常なペチュニアと色素遺伝子導入後の斑入りペチュニア * * より引用 - 3 -

9 1995 年 Guo 氏と Kemphues 氏によって線虫 (C. elegans) 遺伝子発現の抑制実験により センス RNA がアンチセンス RNA と同程度に遺伝子発現を抑制することを発見した 6) 続いて 1998 年 Fire 氏らは線虫を利用し dsrna がセンス RNA やアンチセンス RNA 単独よりも 10 倍強く遺伝子発現を抑制することを明らかにした 7) この発見で 植物以外において RNAi が初めて見出された 線虫での RNAi の報告に相次いで プラナリア 8) ヒドラ 9) ショウジョウバエ 10) などの無脊椎動物 また ゼブラフィッシュ 11) のような脊椎動物においても観察されることが報告された 哺乳類では 長鎖 dsrna を導入するとインターフェロン応答が起こり 哺乳類細胞への応用はできないと考えられていたが 2001 年に Elbashir 氏らによって短い dsrna を導入することにより インターフェロン応答を回避できることを明らかにした 12) (Fig. 2-2) RNA 干渉は 医学や生物学などの研究に大きな影響を与え 2006 年のノーベル医学生理学賞の受賞対象となった 線虫 プラナリア ヒドラ ショウジョウバエゼブラフィッシュマウス胚 Fig. 2-2 RNA 干渉に研究される多種の動物 - 4 -

10 2-2 RNA 干渉の機構 RNAi は dsrna により引き起こされる配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象である 細胞内に導入された長鎖 dsrna は Dicer と呼ばれる RNase III ファミリーに属する酵素により 3'- 末端側に 2 塩基の突出 ( ダングリングエンド ) を持つ 21~23 塩基の短鎖 dsrna である sirna へと分解される その後 sirna は複数のタンパク質と RNA 誘導型サイレンシング複合体 RISC (RNA induced silencing complex) に組み込まれ RISC の組成たんぱく質 Argonaute (AGO) が持つ Slicer 活性により短鎖 dsrna のセンス鎖が切断される RISC に残ったアンチセンス鎖はガイド分子として相補的な配列を含む mrna 鎖を特異的に認識し 13) 最終的に標的 mrna が速やかに分解され タンパク質の発現を抑制する 14,15) (Fig. 2-3) Fig. 2-3 RNAi の機構 - 5 -

11 2-3 RNA 干渉の特徴 RNAi の高効率性 Elbashir 氏らは dsrna による遺伝子抑制に関する研究において dsrna 濃度が 25 nmol/l と 100 nmol/l の場合はサイレンシング効果はほぼ変わらなかったと報告している また dsrna 濃度を 1.5 nmol/l まで下げても 変化も殆どなく サイレンシング効果が完全に消えるのは 0.05 nmol/l の低濃度であった 16) Holen 氏らも dsrna が 1~100 nmol/l の濃度下 遺伝子サイレンシング効果が一致することを明らかにした 17) つまり アンチセンス法による遺伝子サイレンシングと異なり dsrna を介して RNAi は化学量論的ではなく 遺伝子サイレンシング現象が触媒的に高効率で進行することを示している RNAi の特異性 Elbashir 氏らと Brummel Kamp 氏らにより 21~23 塩基の sirna 配列の中に標的 mrna と 1~2 塩基の mismatch が存在する場合 その mrna の分解効果が著しく減少することが報告された RNAi により遺伝子サイレンシング現象は sirna の相補的な配列を含む標的 mrna を特異的に分解し タンパク質の発現を抑制することが明らかになった RNAi の位置効果 Holen 氏らはヒト組織因子 (Tissue Factor: TF) 発現の抑制効果実験で配列の違う位置を標的とする 4 種類の dsrna (htf167i htf372i htf478i htf562i) を用意したが その中で最も活性高いのは htf167i と htf372i で 約 85%~90% の遺伝子発現を抑制した 一方 htf478i の活性は殆どなかった 18) また htf167i を中心として三塩基づつ左右へずらし 新たに用意した dsrna の活性もかなり減少した すなわち RNAi の位置効果が存在し 配列に少しでも - 6 -

12 位置のずれが生じた場合 sirna の遺伝子サイレンシング効果に大きな影響を 与える RNAi の競合性 Holen 氏らによる 10 nmol/l 及び 30 nmol/l の htf167i による TF 発現の抑制効果には差が殆どなかったが 10 nmol/l の htf167i と 20 nmol/l の低い抑制活性 PSK314i を混合した後では htf167i の抑制効果も大きく減少することが報告された これは RNAi の競合性とも言える RNAi の伝播性 Feinberg 氏と Hunter 氏は線虫に SID-1 という膜貫通タンパクを発見した このタンパクを介して細胞内に導入された dsrna を細胞外へ転送すると 線虫の全身まで拡散できる 19) しかし ショウジョウバエに SID-1 の同源タンパクが発見されなく ショウジョウバエにおいては RNAi の伝播ができないという報告もあった RNAi の ATP 依存性 RNAi 現象は ATP を除去した環境で起こらないことにより RNAi は少なくとも二つの段階で ATP 依存的であることが明らかになった 一つ目は Dicer により切断された短鎖 dsrna が RISC に取り込まれ ATP 依存的に Dicer 側から巻き戻しを受け一本鎖化する段階と 二つ目は RISC 複合体に切断された mrna が ATP 依存的に RISC から追い出される段階である 20) - 7 -

13 2-4 sirna の医薬品化への問題点 RNAi 現象を引き起こす要因の一つである sirna は 特異的な遺伝子抑制効果を有するため 生物学及び医薬分野の基礎研究に応用されているとともに 臨床への応用も期待されている しかし 今まで一般的な sirna は効果的に RNA 干渉機能 ( ノックダウン効果 ) を発揮させるには充分ではなく RNA 創薬の実現には以下に示すような幾つかの大きな問題点を抱えている オフターゲット効果 sirna のオフターゲット効果 (off-target effect) とは 導入された sirna が標的とする遺伝子以外の遺伝子の発現も同時に抑制してしまう現象である このオフターゲット効果は大きく 2 種類に分けられる 21) 一つ目は sirna 配列の選択性が弱く 他の遺伝子に配列相同性を示す場合に起こる 二つ目は 免疫系防御機構によるサイトカイン分泌に起因する免疫反応である (Fig. 2-4) Fig. 2-4 sirna のオフターゲット効果 参考文献 21 より一部改変 - 8 -

14 酵素的安定性 sirna は DNA 分子と同様に化学的に比較的安定であるが 生体内でのリボ ヌクレアーゼ (RNase) などにより分解され 短時間に腎臓から排出される 作用点への送達 sirna は生体内に投与した後 RNase などの酵素による分解される他に 投与部位から標的とする目的細胞に到達するまでに多くの障壁がある 例えば タンパク質への吸着 腎臓の他肝臓や脾臓での取り込みによる分解 静脈投与での血管壁の透過 目的細胞膜の透過など さまざまな障壁を越えなければならない 作用の持続性 sirna による治療ではアンチセンス法やアプタマー法などと異なり sirna/risc 複合体で標的 mrna を持続的に分解できるため その作用は一回投与すると一週間程度に維持することが可能である しかし 一回投与で一ヶ月間以上の長期効果を持続することは未だ困難である 上記四つの問題点が存在するため sirna などのオリゴ核酸の医薬品化まで まだ多くの研究が必要である 現在最も注目されている研究分野の一つが sirna の薬物送達システム (Drug Delivery System: DDS) である すなわち 問題点 2, 3, 4 の解決を目指している - 9 -

15 2-5 sirna の DDS 研究 先ほどのように RNAi 特に sirna を有用な遺伝子機能解析法や遺伝子治療薬への応用を実現するため さまざまな工夫を行う必要がある 現在 その研究は大きく二つに分けられている 一つは sirna 自体の化学修飾 ( 糖部 リン酸部 塩基部 ) (Fig. 2-5) もう一つは sirna キャリヤの探索 ( ウイルスベクター 非ウイルスベクターなど ) である また この二つの方法を同時に行う sirna の DDS 研究もある sirna の化学修飾 Fig. 2-5 sirna の化学修飾 糖部修飾 sirna の化学修飾に関して 最も多く報告されていたのは糖部の修飾法である 22-29) (Fig. 2-6) sirna 糖部の 2 -OH の有無は RNAi パスウェイに入ることに必要がない 30) ため 遺伝子抑制活性に影響を与えないと考えられ 2 位の修飾が多く報告されている 2 -OH をメチル化した 2 -O-Me 修飾により 相補鎖

16 との結合親和力やヌクレアーゼ耐性が向上し 化学的に安定な二本鎖構造を保持できる さらなる高いヌクレアーゼ耐性を有し 効果的な遺伝子抑制活性を維持するためには 2 -O-Me 修飾のアナログ体の導入数を制限し また導入部位の選択が必要となる 2 -OH をデオキシ化した 2 -H の DNA 型も RNA アナログと考えられる 最初の 3 - 末端のダングリングエンド部位に DNA 型を導入すること 22) から 現在 DNA 型の導入数と導入部位を制限すれば sirna に応用できることまで発展してきた また Ui-Tei 氏らにより sirna の 5 - 末端側から幾つかの塩基を DNA 型に置換すると オフターゲット効果が減少することが報告されている 31) Fig. 2-6 sirna 糖部の化学修飾

17 アニオン性の sirna は 細胞膜に透過することが困難であるため 細胞膜との親和性や電荷の中和などを考慮し アミノ基を導入することにより プロトン化されたアミノ基の正電荷が隣接するリン酸ジエステルの負電荷を中和し 細胞膜の透過性が向上できると考えられる 2 - 位にアミノエチル (2 -O-AE) 基を初め より炭素鎖の長いアミノプロピル (2 -O-AP) 基や複数のアミノ基を有するグアニジノエチル (2 -O-GE) 基は より高い安定性が得られている 23-25) また 2 -OH をフッ素及びアジド基に置換した 2 -F-RNA と 2 -N 3 -RNA のような糖部修飾型ヌクレオシドも報告されている 26, 27) これらの修飾により 二本鎖の結合親和力や血中での安定性が増強することが報告されている 天然型核酸リボースのパッカリングにより N 型と S 型の 2 種類の構造をとり得るため 化学構造上形の自由度が大きい そこで リボース環の 2 - 位と 4 - 位をメチレンで架橋することによって 自由度が制限された LNA (Locked Nucleic Acid) の修飾法も研究が進められている 完全に N 型に固定される LNA は二本鎖の安定性が大幅に向上することにより 血中滞留時間及びヌクレアーゼ耐性の向上 さらにオフターゲット効果の減少が期待される 28, 29) 一方 リボース環の酸素原子を硫黄原子に置換した 4 -S-RNA も報告された 32) 熱力学的に安定な二本鎖を形成し 高いヌクレアーゼ耐性も保持できると 共に 標的分子との相互作用 三次構造の多様性 及び触媒活性の向上などの 利点がある リン酸部修飾 sirna の構造変化を最小限に抑え ヌクレアーゼなどの酵素に耐性を上げるため リン酸部 ( リン酸ジエステル ) の修飾もよく研究されている (Fig. 2-7) ただし 修飾を施すのに伴い リン原子にキラリティが発生し 立体異性体が生じてしまうことに注意が必要である その中に最も有名な修飾法は リン酸

18 ジエステル結合の非結合性酸素原子を硫黄原子に置換したチオリン酸エステル (PS) 結合である この修飾法で合成された RNA は加水分解酵素に強い耐性をもつことで 血清中での安定性が向上することが報告されている 33) sirna 鎖の末端に PS 結合の導入型と未修飾型は遺伝子抑制能が同等であったが 鎖全体に PS 結合を導入すると抑制能低下と細胞毒性上昇という問題点も引き起こされる Fig. 2-7 sirna リン酸部の化学修飾 また ヌクレアーゼ耐性と安定性を向上するため 硫黄原子以外にリン酸ジ エステル結合の非結合性酸素原子をボラン (-BH 3 ) メチル基 (-CH 3 ) 及びア

19 ミノ基 (-NH 2 ) などの官能基に置換される修飾法も報告されている 34) さらに リン酸ジエステル結合の非結合酸素原子だけの置換ではなく リン酸ジエステル自体をアミド結合に変更した sirna の修飾も報告されている 未修飾型と比べ 3 - 位により安定な構造をとるため 相補鎖 RNA とより安定な二本鎖を形成する 35) その他に 3,5 - 位のリン酸ジエステル結合を 2,5 - 位間の結合へ変化させた sirna 修飾法が報告されている 天然型より 2,5 - 結合型 sirna は核酸分解に耐性が強くなるが 二本鎖 sirna 中に センス鎖のみに容認でき アンチセンス鎖が容認できないという問題点もある 36) 塩基部修飾 sirna 塩基部分の修飾に関する報告例は少なくないが 遺伝子抑制能の低下を伴うため 多くの場合実用に至っていない (Fig. 2-8) 代表的なものとして 5-ブロモウリジン 5-ヨードウリジン 及びアデニン誘導体である 2,6-ジアミノプリンの塩基部修飾体は A-U 塩基対を安定化させることにより sirna への導入が実施されている しかし これらの修飾体が導入された sirna は いずれも未修飾型 sirna より 遺伝子抑制能が大幅に低下する傾向にあった その他に 2-チオウリジン シチジンと塩基対を形成するシュードウリジンの修飾は 二本鎖の熱力学的安定性 遺伝子抑制ならびにターゲット特異性を向上させた 37) 一方 5- 位にプロピニルを導入されウリジン置換 sirna 修飾体は二本鎖の熱力学的安定性の向上を伴い 遺伝子抑制能を低下することも報告されている 38)

20 Fig. 2-8 sirna 塩基部の化学修飾 sirna キャリア 直接に sirna の糖部 リン酸部及び塩基部を化学的に修飾する以外に sirna キャリアを利用し 低分子 sirna の分子量を多くすることにより 血中滞留時間の増加を目指す手法もある それは ウイルスキャリアと非ウイルスキャリヤの大きく 2 種類に分けられている ウイルスベクターにヘアピン構造をコードする遺伝子 (shrna or mirna) が導入され 宿主細胞内に RNA 分子を発現し 最終的に sirna へ分解されることが報告された 39) ウイルスキャリアの DDS は一回の投与が比較的長時間 sirna の発現が保持でき かつ 一般的にデリバリー困難とされる神経細胞まで届くことも可能という利点がある すなわち 慢性疾患である HIV 感染症や神経変性病であるハンチントン病 アルツハイマー病などの治療に向いていると考えられる 40, 41) 現在 ウイルスキャリアの DDS は in vivo での応用も多 数報告されている 42, 43) が 強い免疫反応のリスク 肝臓毒性 44) 及び弱いベク ター安定性といった欠点はウイルスキャリヤの実用化に障壁となっている 45) 一方 非ウイルスキャリヤの場合は 免疫反応などの安全性面に優れている

21 ことが明らかになった 46) 近年 ナノ技術を活用し さまざまなカチオン性物質と複合体を形成させた sirna の DDS 報告例が多くなってきた 48-52) (Fig. 2-9) カチオン性脂質はアニオン性 sirna と自発的に結合し また細胞膜との親和性も良く 代表的な非ウイルスキャリアとして 多く研究が実施されてきた また ポリエチレン グリコール (PEG) でのコーティング化により 毒性を抑制することも可能である 53) さらに 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) 54) は in vivo での実験で sirna の DDS による腫瘍壊死因子 (Tumor Necrosis Factor: TNF) と血管内皮細胞増殖因子 (Vascular Epithelial Growth Factor: VEGF) の発現を抑制することが報告された 55, 56) Fig. 2-9 sirna のカチオン性脂質キャリア 参考文献 47 より一部改変

22 カチオン性脂質以外に ポリマーを sirna の DDS へ応用する研究もよく知られている (Fig. 2-10) カチオン性ポリマーと sirna のアニオン性リン酸エステルの自己集合 (Fig. 2-11) により ゲル状粒子を形成し sirna を効率的に移送することができる Fig sirna のポリマーキャリア 参考文献 47 より一部改変 Fig sirna とポリカチオン性物質の自己集合 参考文献 57 より一部改変

23 また 最近の研究は負電荷密度の低い単量体 sirna 分子はカチオン性ポリマーとの自己集合が弱いため sirna 分子がナノ粒子ポリプレックスの表面に浮きやすく 生体内にヌクレアーゼなどによる分解されるリスクが高い この問題点を解決するため 低分子 sirna から ハイブリダイゼーション sirna 59) や重合体 sirna 60-64) への開発が挙げられている これらの手法により sirna 分子の負電荷密度を増やし カチオン性ポリマーとの自己集合を安定させることと共に そのポリプレックスの直径を 100 nm 程度 (200 nm 以上になると 速やかに肝臓及び脾臓の細網内皮系 RES による排出される 65) ) に維持し 排出作用も抑制できる (Fig. 2-12) Fig 単量体 sirna 分子及び重合体 sirna 分子の自己集合 参考文献 58 より一部改変 カチオン性ポリマーは 細胞膜透過性を高めるため直径 100nm 以下のナノ粒子になるが デンドリマーのような巨大分子を利用することも可能である (Fig. 2-13) デンドリマーとは ポリアミドアミン (Polyamidoamine: PAMAM)

24 に代表される規則的な分岐構造をもつ樹状高分子を母核に 末端にはアミノ基などの分子と結合しやすい側鎖を有する構造を基本骨格とするものである 同一構造の分子が集合し 親和力を増強するクラスター効果が得られるという利点が注目されている 66) Fig sirna のデンドリマーキャリア 参考文献 47 より一部改変 一方 ペプチドの細胞取り込みを増進する特徴を利用した sirna の DDS 応 用も進められている (Fig. 2-14) その中に 細胞透過性ペプチド (CPP : Cell

25 Penetrating Peptides) というカチオン性ペプチドはデリバリーキャリアとして 複合体の形で目標分子を細胞内へ容易に運ぶことがよく知られている 例えば HIV-1 由来の TAT 67) 及びインフルエンザウイルス由来の INF-1 と INF-7 68) はウイルスタンパク質由来の CPP である また CPP の sirna デリバリへの応用は 2 種類に分けられている 一つ目は CPP と sirna が共有結合で連結したものである ( 主にジスルフィド結合及びチオエーテルリンカー ) 二つ目は 静電作用によって CPP と sirna を複合体にしたものである 細胞内への輸送効率が高いため 現在 共有結合法は多く利用されているが 遺伝子抑制能の低下も問題点となる 69) これは共有結合が強すぎ RISC への取り込みを阻害すると考えられる ただし ペプチドの共有結合法で sirna の遺伝子抑制能を保持できるとの報告もある 70) GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGC (INF-1) GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG (INF-7) GALFLGFLGAAGSTMGA-WSQP-KKKRKV (MPG) Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV-Cya (MPGα) PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR (Protamine) WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA (GALA) GRKKKRRQRRRPPQ (TAT) IRQRRRR (IRQ) RQIKIWFQNRRMKWKK (Penetratin-ABT) Fig sirna のペプチドキャリア 参考文献 47 より一部改変

26 第 3 章グルコサミン誘導体による sirna の 3'- 末端化学修飾 著者が所属する研究室では sirna の 3'- 末端のダングリングエンド部位の 化学修飾に着目し さまざまな高機能性 RNA 分子の開発研究を行っている 71-73) (Fig. 3-1) Fig. 3-1 sirna の 3'- 末端のダングリングエンドに導入される化合物 その様な過程で 著者はカチオン性ポリマーであるキトサンを注目し sirna の 3'- 末端修飾を行った キトサンは生分解能を有しており その分解過程で生産されるグルコサミンは 人体重要な構成成分である糖タンパクに多く存在するため 他のカチオン性物質と比べ 低い毒性 高い生体適合性という利点が示されている また 細胞膜親和性 抗菌性及び親水性などの特徴も有している 3'- 末端の化学修飾には高分子のキトサンを直接利用するのが困難であるため 構成糖のグルコサミンを選択し 導入することにした 最初に開発したグルコサミンモノマー誘導体の合成法は Scheme 3-1 に示している まず グルコサミン塩酸塩 1 から水酸基を O-アセチル基で保護 アミノ基をフタルイミド基で保護してから 1'- 位に SPh 基に置換させ 化合物 3 を得た 次に 1'- 位にリンカーを導入してから 3'-, 4'-, 6'- 位を脱保護し 化合物 5 を得た そして 1 級と 2 級の水酸基の活性差を利用し TBDMS 基とベ

27 ンゾイル基でそれぞれ 6'- 位と 3'-, 4'- 位を保護し 化合物 7 を得た 最後に リンカー末端のベンジル基を DMTr に置換させ 6'- 位を脱保護してから スクシニル化 CPG 樹脂と結合 合わせて全 10 ステップで CPG 樹脂体 11 まで合成できた Scheme 3-1 グルコサミンモノマー誘導体の合成法 Reagents and conditions: (a) (i) MeONa, MeOH, rt; (ii) Phthalic anhydride, MeOH, rt; (iii) Acetic anhydride, pyridine, rt, 68%; (b) PhSH, Et 2 O BF 3, CH 2 Cl 2, rt, 93%; (c) benzyloxyethanol, NIS, TfOH, CH 2 Cl 2, 4Å MS, rt, 60%; (d) MeONa, MeOH, rt, 85%; (e) TBDMSCl, pyridine, rt, 97%; (f) BzCl, pyridine, rt, 95%; (g) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, 95%; (h) DMTrCl, pyridine, rt, 88 %; (i) TBAF, THF, 0ºC, 35%; (j) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 28 μmol/g

28 しかし この合成法では DNA/RNA 自動合成機により オリゴ核酸に導入した後 グルコサミンの保護基を完全に外すこと及びオリゴ核酸の精製が困難であった 具体的には アンモニア処理の時に 長時間処理によるオリゴ核酸の分解を回避するため 12 時間と定められていたが グルコサミン 2'- 位のフタルイミド基は 100% で脱保護ができず 脱保護が不完全な sirna の存在が MALDI-TOF/MS で確認された (Fig. 3-2) 続いてのアッセイ試験でも新規に合成された sirna の純度の影響で正確な結果が得られなかった ( 未発表 ) Fig. 3-2 従来法による合成された sirna の混合物 そこで 本研究ではその合成法を改善し グルコサミン 6'- 位に塩基部非置 換型 又は塩基部置換型 2 種類のモノマー誘導型 CPG 樹脂を用意した 3-1 塩基部非置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 先ほど述べた合成法の問題点が 2'- 位のフタルイミド基の脱保護であるが 最初から無水フタル酸での保護ステップをとばし アミノ基がフリーのままで合成されると 1'- 位のアノマー炭素が α 型と β 型の混合物になってしまうため 合成中に別の段階でフタルイミド基を変えるしかないと考えられる (Scheme 3-2)

29 Scheme 3-2 塩基部非置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 Reagents and conditions: (a) (i) MeONa, MeOH, rt; (ii) Phthalic anhydride, MeOH, rt; (iii) Acetic anhydride, pyridine, rt, 68%; (b) PhSH, Et 2 O BF 3, CH 2 Cl 2, rt, 93%; (c) Ethylenediamine, MeCN, reflux, 60%; (d) TIPSCl, pyridine, rt, 86%; (e) (CF 3 CO) 2 O, pyridine, rt, 79%; (f) BzCl, pyridine, rt, 83%; (g) benzyloxyethanol, NIS, TfOH, CH 2 Cl 2, 4Å MS, rt, 78%; (h) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, 89%; (i) DMTrCl, pyridine, rt, 98%; (j) TBAF, THF, rt, 68%; (k) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 19 μmol/g. そこで グルコサミン塩酸塩 1 を出発原料として MeOH に溶解し MeONa を加え 2'- 位に遊離のアミノ基にした後 無水フタル酸にて保護した 2'- 位のアミノ基が消えたことを TLC で確認した上 溶媒を減圧留去し 一晩乾燥させた MeOH を完全に除去してから 乾燥ピリジン中 無水酢酸と反応させ 1'-, 3'-, 4'-, 6'- 位の水酸基を全保護した化合物 2 が 68% 収率で得られた 続いて 1'- 位アセトキシ基をルイス酸で容易に脱離可能なチオフェニル基に変換することとした 化合物 2 は Et 2 O BF 3 存在下で PhSH を作用させ 93% 収

30 率で β 型のみのチオフェニル体 3 を得た 次に 従来法と異なり エチレンジアミンの強い塩基性条件下に高温還流させ 一気に化合物 3 の 2'- 位のフタルイミド基と 3'-, 4'-, 6'- 位のアセチル基を外し 全脱保護のチオフェニル体 12 が 60% 収率で得られた この化合物は極性が高いため 一般のクロロホルム-メタノール系とヘキサン- 酢酸エチルエステル系の展開溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーでは困難であり 酢酸エチル : メタノール : 水 = 8 : 1.5 : 1 を用いて精製した 化合物 12 から 一連の水酸基とアミノ基の保護反応を行い 化合物 15 まで進んだ まずは 6'- 位に TIPSCl にてシリル基で保護 86% 収率で化合物 13 が得られた そして フタルイミド基及びアセチル基と比較し塩基性条件下容易に脱離するトリフルオロアセチル基を無水トリフルオロ酢酸にて 2'- 位アミノ基を保護し 79% 収率で化合物 14 を得た 続いて 3'-, 4'- 位の水酸基を従来法と同様に BzCl で保護し 83% 収率で化合物 15 を得た その後 固相担体 CPG 樹脂と結合するため 介するリンカーを導入した 4Å のモレキューラシーブの存在下で 化合物 15 にベンジルオキシエタノール NIS 及びルイス酸 TfOH を順に加え 反応させた 化合物 16 を 78% 収率で得た リンカー末端のベンジル基をトリチル基に変更するため まず接触水素化反応を行い THF 溶媒中に Pd(OH) 2 /C を触媒として 化合物 16 は水素にて 化合物 17 に還元され 89% 収率で反応を終えた そして DMTrCl でリンカー末端の水酸基にトリチル基を導入し 98% 収率で化合物 18 が得られた この段階から トリチル基の脱離を防ぐため シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製ステップは 溶媒に少量のピリジンを加え 弱塩基性環境を保持する必要がある 次に 6 位の TIPS 基を TBAF で脱保護し 68% 収率で化合物 19 を得た 最後に ピリジン中に DMAP の存在下 無水コハク酸と反応させ 定量的

31 にスクシニル体を導いた この段階は シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製は行わず 抽出のみを行った後 完全に乾燥させ DMF 中に CPG 樹脂及び EDC-HCl を加え 樹脂体 20 を得た CPG 樹脂 1g に結合しているグルコサミンモノマーの量 (μmol/g) (CPG 樹脂の活性 ) は 樹脂体 20 を過塩素酸 : エタノール = 3 : 2 溶液で脱保護し そのろ液の波長 498 nm でのトリチル基の吸光度から算出し 樹脂体 20 の活性は 19.3 μmol/g であった この樹脂体 20 は 先に合成した樹脂体 11 と比べ 2'- 位のフタルイミド基をより容易に脱離するトリフルオロアセチル基に変更した したがって 核酸オリゴマーの合成後のアンモニア処理による保護基の脱離が効率的に進むことが期待される 3-2 塩基部置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 sirna の 3'- 末端ダングリングエンドへ導入されるグルコサミン分子は化学修飾の観点から見ると 糖部とその架橋部の修飾とも言える つまり リボースからグルコサミンへ また リン酸ジエステルからリンカーへの変更である しかし この化学修飾は 塩基部がない 糖部のみの変更なので 塩基部が存在するグルコサミンモノマー誘導体の合成も行った まずは 保護した塩基の用意が必要となる 今回選択した塩基はチミン 保護基はベンゾイル基であった (Scheme 3-3) Scheme 3-3 塩基の保護 Reagents and conditions: (a) BzCl, pyridine, MeCN; (b) K 2 CO 3, Dioxane, H 2 O

32 Pyridine の存在下 チミンを直接 1.0 当量の BzCl とベンジル化した際 N 1 -Bz-Thymine N 3 -Bz-Thymine また N 1,N 3 -Bz-Thymine 多種の生成物ができてしまい 収率は低く 精製も困難であったため 2 段階反応に変更した Thymine を過剰量のベンゾイルクロリド (BzCl) (3.0 当量 ) と反応させ すべて N 1,N 3 -Bz-Thymine にした後 選択的に 1- 位を脱保護し N 3 -Bz-Thymine を 45% 収率で結晶として得た 本研究では グルコサミンモノマー誘導体合成の従来法を改善すると共に 6'- 位にチミン置換型グルコサミンモノマー誘導体も合成した (Scheme 3-4) Scheme 3-4 塩基部置換型グルコサミンモノマー誘導体の合成 Reagents and conditions: (a) Benzyloxyethanol, Me 2 O BF 3, MeCN, reflux, 67%; (b) MeONa, MeOH, rt, 88%; (c) N 3 -Benzoyl-thymine, PPh 3, DEAD, THF, rt, 84%; (d) Ethylenediamine, EtOH, reflux, 87%; (e) (CF 3 CO) 2 O, pyridine, rt, 90%; (f) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, quant; (g) DMTrCl, Pyridine, rt, 79%; (h) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 37 umol/g

33 3-1 で合成された化合物 2 を原料として Me 2 O BF 3 の存在下 リンカーのベンジルオキシエタノールと MeCN 中に高温還流させ チオフェニル化ステップを省略し リンカーを 1'- 位に直接導入した 化合物 21 は 67% 収率で得られた そして 3-1 のように同時に 2'- 位のフタルイミド基と 3'-, 4'-, 6'- 位のアセチル基を外すことなく MeONa の比較的に弱い条件で 2'- 位のフタルイミド基を残したまま 3'-, 4'-, 6'- 位のアセチル基を除去し 88% 収率で化合物 22 を得た この段階で 2'- 位のフタルイミド基も除去した場合は 次の Mitsunobu 反応による 6'- 位に塩基の導入は副生成物ができ 精製困難であるため 収率も下がることになった (Fig. 3-3) Fig '- 位フリーのアミノ基での Mitsunobu 反応の生成物と副生成物 続いて Mitsunobu 反応を行い 化合物 22 は PPh 3 と DEAD 存在下 THF 中に N 3 -Benzoyl-thymine と反応させたところ 副生成物が生じることなく 84% 収率で化合物 23 を得た ここから 3-1 での合成法とほぼ同様に エチレンジアミンでフタルイミド基を外し トリフルオロアセチル基に変えたところ 各々 87% 90% 収率で化合物 24 と 25 を得た 次に リンカー末端ベンジル基をトリチル基に変更する反応も 3-1 のように行い 化合物 26 は定量的に また 化合物 27 は 79% 収率で得られた 最後に 3'-, 4'- 位に無水コハク酸にてスクシニル化し CPG 樹脂と結合し 固相担体 28 が得られ その活性は 36.7 μmol/g であった

34 3-3 3'- 末端にグルコサミン誘導体を含む sirna の合成 今回は Renilla luciferase の配列を選択し 合成した塩基部非置換型 及び塩基部置換型 2 種類のグルコサミンモノマー誘導体の固相担体 20 と 28 を用いて それぞれ DNA/RNA 自動合成機にかけ 3 - 末端に X, tx, ttx, Y, ty, tty を有する sirna を合成した (Fig. 3-4) また 天然型である 3 - 末端に tt チミジン-チミジン骨格を有する sirna も比較用として用意した Renilla sense strand: Renilla antisense strand: 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUG-3' 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAG-3' Fig. 3-4 合成された sirna の 3 - 末端構造 合成終了後 常法に従い 合成カラムから樹脂体を取り出し 28 % アンモニア水溶液 : エタノール = 3 : 1 混合溶液にて室温で 12 時間反応させ sirna の CPG 樹脂からの切り出し及び脱保護を行った そして 1M TBAF/THF 溶液にて室温で 12 時間にシリル基の脱保護をした後 反応を 0.1M の TEAA バッファ (ph 7.0) で終結させ Sep-Pak C18 逆相カラムクロマトグラフィーを用い脱塩を行った 得られた sirna は 20% PAGE 電気泳動により粗精製した ま

35 た 逆相高速液体クロマトグラフ (HPLC: high performance liquid chromatograph) を用いてさらに精製し MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) により 3'- 末端にグルコサミンモノマーを有する sirna 誘導体の分子量を確認した (Table 3-1) (Fig. 3-5) Table 3-1 合成した sirna の配列の確認 No. of sirna No. of ON sequence MS (Obs.) MS (Cal.) error sirna 29 sirna 30 sirna 31 sirna 32 sirna 33 sirna 34 sirna ON 36 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGtt-3' ON 37 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtt-3' ON 38 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGX-3' ON 39 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGX-3' ON 40 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGY-3' ON 41 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGY-3' ON 42 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGtX-3' ON 43 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtX-3' ON 44 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGtY-3' ON 45 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtY-3' ON 46 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGttX-3' ON 47 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGttX-3' ON 48 5'-CUUCUUCGUCGAGACCAUGttY-3' ON 49 5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGttY-3' ON 50 F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtt-3' ON 51 F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtX-3' ON 52 F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtY-3' Error = MS (Obs) MS (Cal) Fig. 3-5 合成された sirna 中 F X Y の構造

36 第 4 章 3'- 末端にグルコサミン誘導体を含む sirna の生物学的活性評価 4-1 sirna 二本鎖の熱的安定性評価 合成した sirna オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ 600 pmol を混合させ 測定用緩衝液 (200 μl) に溶解し アニーリングにより 二本鎖を形成させた 各二本鎖 sirna の 50% 融解温度 (Tm) を測定することにより 二本鎖熱的安定性を評価した (Fig. 4-1) (Table 4-1) Fig. 4-1 アニーリングされた sirna の温度 / 吸光度変化図 Table 4-1 sirna の Tm 値 No. of sirna Tm ( C) Tm ( C) sirna sirna sirna sirna sirna sirna sirna Tm = Tm (modified sirna) -Tm (sirna

37 control 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm 0.1 nm 1 nm 10 nm RL / FL ( % of control) 3'- 末端ダングリングエンド部位が tt の天然型 sirna 29 の Tm 値は 76.1 C そして 今回合成した 3'- 末端にグルコサミンモノマーを有する sirna 30 ~ 35 はいずれもほぼ同等の値を示しており 大きな差は見られなかった ( Tm は最大 -2.1 C である ) すなわち sirna に修飾したグルコサミンは二本鎖熱的安定性に殊んど影響を与えないものと考えられる 4-2 Dual-Luciferase reporter assay によるタンパク発現抑制評価 ヒト子宮頸癌由来の HeLa 細胞を用い 3'- 末端にダングリングエンドを持つ sirna 29 ~ 35 のタンパク発現抑制能を Dual-Luciferase reporter assay 法で評価した 本手法は発光タンパクである Firefly Luciferase と Renilla Luciferase の生物発光反応を識別している なお 今回合成した sirna は Renilla Luciferase を標的とした配列であるため Renilla Luciferase の発現抑制効果を Firefly ルシフェラーゼの発光量と比較し タンパク抑制能を評価できる また sirna をトランスフェクションしていない状態を control とし 100% とした (Fig. 4-2) sirna 29 sirna 30 sirna 31 sirna 32 sirna 33 sirna 34 sirna 35 Fig. 4-2 Dual-Luciferase reporter assay

38 結果としては 0.1 nm の低濃度で天然型の sirna 29 はグルコサミンモノマーで修飾した sirna 30 から sirna 35 のいずれよりもタンパク質発現抑制能が優れていた 1 nm の場合は sirna 31 と sirna 33 また 10 nm の場合は sirna 30 と sirna 32 はほぼ同程度の抑制能を示していた また Y 修飾型 sirna は X 修飾型より優れた (sirna 31 > sirna 30 sirna 33 > sirna 32 sirna 35 > sirna 34) しかし sirna 34 と sirna 35 では抑制能が減少したことが分かった 4-3 Snake Venom Phosphodiesterase によるヌクレアーゼ耐性評価 天然型の tt ダングリングエンドと同じ長さの tx と ty を選び 5'- 末端に蛍光色素であるフルオレセインを有する ON 50 ON 51 および ON 52 を合成した エキソヌクレアーゼの一つであるヘビ毒ホスホジエステラーゼ (SVPD) を用い 3'-エキソヌクレアーゼに対する耐性を評価した ON 50 ON 51 及び ON 52 をそれぞれ一本鎖状態で SVPD にて処理した RNA の経時変化を 電気泳動を行い解析した (Fig. 4-3) 天然型 sirna は SVPD により 3 分間で 95% 以上分解されてしまった 一方 グルコサミンモノマー修飾型 (tx ty) のいずれも 60% 以上残っており 5 分間経っても 30% 程度残存できることが確認され 修飾型 sirna (tx ty) は天然型 sirna (tt) と比べ はるかに高いヌクレアーゼ耐性を示した

39 Intact ONs (%) ON 50 ON 51 ON 52 F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtt-3' F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtX-3' F-5'-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtY-3' ON 50: tt ON 51: tx ON 52: ty Incubation time (min) Fig. 4-3 SVPD によるヌクレアーゼ耐性評価 4-4 細胞膜透過性評価 74) 天然型の tt または tx 及び ty ダングリングエンドをもつ sirna のセンス鎖 (ON 36 ON 42 ON 44) と 5'- 末端に蛍光色素であるフルオレセインを有するアンチセンス鎖 (ON 50 ON 51 ON 52) をそれぞれ二本鎖にしトランスフェクション試薬を混合し HeLa 細胞と 4 時間の培養した後共焦点レーザースキャン顕微鏡の観察により 細胞膜透過性を評価した (Fig. 4-4)

40 Red (Mito Tracker) Green (Fluorescein) Merge Control 3'-tt sirna 3'-tX sirna 3'-tY sirna Fig 時間インキュベーション後 Hela 細胞の共焦点顕微鏡画像 赤色蛍光 (Mito Traker) は染色されたミトコンドリア 緑色蛍光は導入さ れた sirna を示している トランスフェクション効率は付属ソフト Zen2012 により 緑色蛍光面積対赤色蛍光面積の比で評価した (Table 4-2)

41 Table 4-2 sirna のトランスフェクション効率 赤 (A) 蛍光面積 (μm²) 緑 (B) トランスフェクション効率 B / A * 100 (%) control tt (ON 36 / ON 50) tx (ON 42 / ON 51) ty (ON 44 / ON 52) 天然型 sirna (3'-tt 末端 ) と比べ 3'-tY 末端を有する sirna のトランスフ ェクション効率は約 1.7 倍に向上した 一方 3'-tX 末端を有する sirna は天 然型 sirna の半分程度しかなかったことが明らかになった

42 第 5 章結語 RNA 干渉は 発見されてから僅か十数年の短い間に 生物学や医学の研究に大きなインパクトを与え 核酸医薬の新星として世界中で注目されている しかし 血中滞留時間が短い 細胞膜透過性が低い および生体内のヌクレアーゼによって分解されやすいなどの問題があり in vitro 実験が成功しても in vivo 実験 また臨床上の応用まで至らなかった例が多い 著者が所属する研究室では sirna の 3 - 末端ダングリングエンド部位の化学修飾に着目している オフターゲット効果の回避とヌクレアーゼ耐性の向上を目指し ヌクレオシドの糖部あるいはヌクレオシド全体を芳香族化合物に置換したもの もしくは塩基部欠損型ヌクレオシドなど さまざまなアナログを sirna の 3 - 末端に導入しその機能結果を検証した (Fig. 5-1) 多くの修飾型 sirna は天然型 sirna より優れたヌクレアーゼ耐性と遺伝子抑制能をもつことが確認されたが いずれも細胞膜透過性などの sirna の DDS の検証には十分に触れていなかった 71-74) Fig. 5-1 これまでの sirna の 3 - 末端ダングリングエンド部位の化学修飾 カチオン性物質キトサンの構成糖であるグルコサミンは 人体に低毒性 高

43 細胞膜透過性などの利点を有するため 本研究では sirna の機能向上 かつ DDS への応用を目指し 天然型グルコサミン X ( 塩基なし ) また修飾型グルコサミン誘導体 Y ( 塩基あり ) を sirna の 3 - 末端への導入 それらの化学的 生物学的機能の検証を行った (Fig. 5-2) 以下 得られた知見を要約する Fig. 5-2 本研究の sirna の 3 - 末端ダングリングエンド部位の化学修飾 これまでに 著者の研究室ではグルコサミンモノマーとダイマーを sirna の 3 - 末端へ導入する試みがあったが 従来法で保護されたグルコサミン誘導体を DNA/RNA 自動合成機によってオリゴ核酸合成した場合 アンモニア処理による脱保護基ステップが効率的に進まず 3 - 末端に導入されたグルコサミンの保護基はさまざまな構造に変化していた 著者はグルコサミン 2 -アミノ基の保護基を塩基性条件下で容易に除去できるトリフルオロアセチル基に変更したところ 後処理の際に副生成物を生じず 効率的にグルコサミン部分の脱保護が可能となった ( 第 3 章 3-1) また グルコサミンをヌクレオシドの糖部と見なし 塩基を導入することで 塩基を有するグルコサミン誘導体の合成法を開発した Mitsunobu 反応により 1 級水酸基と 2 級水酸基の活性差を利用し 部分的に修飾された塩基を

44 グルコサミンの 6- 位に導入した ( 第 3 章 3-2) この合成法はチミン以外に すべての天然型塩基あるいは人工修飾塩基にも適用可能で 今後さまざまな塩 基を有するグルコサミン誘導体が合成できることを示唆した (Fig. 5-3) Fig. 5-3 塩基部置換型グルコサミン誘導体合成法の確立 ダングリングエンド部位は RISC の構成タンパク Argonaute の PAZ ドメインに存在する疎水性ポケットに入り込み 認識されることがすでに解明された 今回 3 - 末端ダングリングエンド部位に X と Y を導入した sirna (X Y tx ty ttx tty) は 天然型 sirna (tt) と比べ 遺伝子抑制能の向上が見られなかったが いずれも濃度依存的にタンパク質の発現を抑制できる 遺伝子抑制能が非常に劣っているのはダングリングエンド部位に三塩基突出の ttx 型と tty 型であることも分かった また 1 nm の濃度で塩基部置換型のグルコサミンタイプは塩基部非置換型のグルコサミンタイプより 優れた遺伝子抑制能を示した (Y>X ty>tx tty>ttx) これらの結果から グルコサミン誘導体の導入は PAZ ドメインの疎水性ポケットへの認識に障害となり 天然型より比較的に入り込みにくい 特に天然型の二塩基突出よりダングリングエンドが長くなる三塩基の場合 (ttx tty) は ダングリングエンドの大きさがさらに PAZ ドメインへの入り込みに阻害し RNA 干渉効果が劣化すると考えら

45 れる (Fig. 5-4) また 塩基部置換型のグルコサミンタイプは塩基部非置換型タイプと比べ 天然型のヌクレオシドと構造的に近いため PAZ ドメインに比較的に入り込みやすい すなわち グルコサミン修飾型 sirna にとって 塩基の存在は RISC の PAZ ドメインとの認識に関与すると考えられる ( 第 4 章 4-2) Fig. 5-4 (a) RISC の PAZ ドメインへ 3 - 末端 tt 型 sirna の入り込み Fig. 5-4 (b) RISC の PAZ ドメインへ 3 - 末端 ty 型 sirna の入り込み

46 Fig. 5-4 (c) RISC の PAZ ドメインへ 3 - 末端 tty 型 sirna の入り込み 次に 3 - 末端ダングリングエンド部位に X と Y の導入にも関わらず tt 末端の天然型 sirna と比べ 高いヌクレアーゼ耐性をもっていた この結果から 3'-エキソヌクレアーゼである蛇毒ホスホジエステラーゼ (SVPD) は 3'- 末端にグルコサミン誘導体を導入することにより 天然型核酸塩基を優先的に認識し オリゴヌクレオチドを切断することが示唆された また 塩基部置換型の Y 修飾体は塩基部非置換型の X 修飾体より若干優れたヌクレアーゼ耐性をもつことも確認できた つまり 塩基部置換型グルコサミン誘導体を sirna の 3'- 末端に導入すると 更なる SVPD との認識を阻害することが明らかとなった ( 第 4 章 4-3) 細胞膜透過性については ダングリングエンド部位に塩基部非置換型グルコサミンでの修飾 (3 -tx 末端 ) は向上が見られなかったが 塩基部置換型グルコサミンでの修飾 (3 -ty 末端 ) は天然型より優れたことが確認された この結果から 細胞膜の電荷中和などを考慮するカチオン性分子で修飾しても 誘導体塩基部の欠損は細胞膜透過性に影響を与えることを示した 今回の細胞膜透過性結果は RNAi 効果の結果 (ty>tx) と一致した すなわち 細胞膜透過性の

47 高い sirna はより多く細胞内に入り込み RISC 複合体と結合し RNAi 効果を現すことに繋がる また 3 - 末端ダングリングエンド部位に塩基部置換型グルコサミンモノマーでなく ダイマーでの修飾 (YY) は細胞膜透過性がさらに向上することが期待できる ( 第 4 章 4-4) 本研究は 五炭糖のリボースおよび芳香環置換に基づく sirna の一般糖部修飾法の他に 同じく生体内に存在する六炭糖のグルコサミンに着目し sirna の 3'- 末端ダングリングエンド部位に化学修飾を行った 修飾型二本鎖 sirna の熱的安定性が天然型と同程度に保持したまま 遺伝子抑制能の上昇が見られなかったが ヌクレアーゼ耐性および細胞膜透過性が予想通り向上した また 塩基置換型グルコサミン誘導体の合成法は 6'- 位にさまざまな塩基が導入できることを示した そこで sirna の 3'- 末端ダングリングエンド部位への導入のみならず リボースの代わりに グルコサミンを母核としてグリコシル反応による sirna 分子全鎖をグルコサミンまたはその誘導体で高機能化することにより 塩基配列の自由に選択できる新規人工核酸の合成も可能となり ヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性の更なる向上が期待できる さらに グルコサミン誘導体は人体に毒性が低いと期待されるため グルコサミン修飾を用いる DDS 化された sirna 分子は RNA 創薬に繋がる可能性が非常に高く 今後臨床的にも意義のある研究テーマであると考えられる

48 実験の部 略語 APS BF 3 OEt 2 BF 3 OMe 2 Boc 2 O BzCl CPG DEAD DMAP DMF DMSO DMTrCl EDC-HCl HPLC MALDI-TOF/MS ammonium peroxodisulfate boron trifluoride - ethyl ether complex boron trifluoride - methyl ether complex di-tert-butyl dicarbonate benzoyl chloride controlled pore glass diethyl azodicarboxylate 4-dimethylaminopyridine N,N-dimethylformamide dimethyl sulfoxide 4,4 -dimethoxytrityl chloride 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride high performance liquid chromatograph matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry MS 4Å NIS NMR PPh 3 SDS-PAGE SVPD TBAF molecular sieves 4Å N-iodosuccinimide nuclear magnetic resonance triphenylphosphine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis snake venom phosphodiesterase tetrabutylammonium fluoride

49 TBDMSCl TEA TEAA TEMED TfOH TIPSCl THF TLC TMSCl Tris tertbutyldimethylsilyl chloride triethylamine triethylammonium acetate N,N,N,N -tetramethylethylenediamine trifluoromethanesulfonic acid triisopropylsilyl chloride tetrahydrofuran thin-layer chromatography trimethylchlorosilane tris(hydroxymethyl)aminomethane 使用機器 1) 測定機器 核酸自動合成機 Applied Biosystems Model 3400 NTS H-6 GC/MS DART/MS MALDI/TOF-MS NMR スペクトル T m 測定機ルミノ イメージアナライザー吸光度計共焦点レーザースキャン顕微鏡 SHIMADZU GCMS-QP 2010A JEOL The AccuTOF Lc-plusJMS-T100LP SHIMADZU AXIMA-CFR plus JEOL JNM-AL400 SHIMADZU UV2400 FUJIFILM LAS4000 HITACHI U-2001 spectrophotometer Carl Zeiss LSM710 2) 各種クロマトグラフィー担体

50 TLC Silicagel 60 F 254 plate (Merck, Art 5715) 中性シリカゲル Silicagel 60 N (spherical, neutral) ( 関東化学 ; mesh) Sep-Pak C18 HPLC 用逆相カラム Waters Corporation YMC J sphere ODS-M80 3) 各種フィルター 水系 ADVANTEC DISMIC-13JP (PTFE 0.5μm) MILLIPORE MILLEX -HV 有機系 PALL Acrodisc Syringe Filter 0.2μm HT Tuffryn Membrane 水系 有機系 MILLIPORE MILLEX -LH 4) 使用試薬 有機合成用試薬及び溶媒 Aldrich 20% Pd(OH) 2 /C, DMTrCl, 1.0M TBAF/THF, Thymine, PPh 3 関東化学 THF ( 脱水 安定剤無添加 ) 東京化成 TIPSCl, BzCl, TfOH, NIS, DMAP, EDC-HCl ナカライテスク Celite, Na 2 S 2 O 3, THF, TEA, AcOH, DMF* 2 和光純薬 MeONa (28% in MeOH), Phthalic anhydride, Thiophenol, BF 3 OEt 2, BF 3 OMe 2, DEAD, Acetic anhydride, 2-Benzyloxy ethanol, Ethylenediamine, Trifluoroacetic anhydride, DMTrCl, Succinic anhydride, CPG resin, EDC-HCl, Pyridine* 1, 脱水溶媒 (MeCN, MeOH, EtOH)

51 * 1 ピリジンは水素化カルシウムにより蒸留を行い モレキュラーシーブ 4 Å 共存下保存したものを用いた * 2 DMF はモレキュラーシーブ 4 Å 共存下で保存したものを用いた NMR 用重溶媒 和光純薬 CD 3 OD, DMSO-d 6 Cambridge Isotope Laboratories CDCl 3 (TMS 含有 ) オリゴヌクレオチドの合成及び精製 Aldrich 1.0M TBAF/THF キシダ化学 Trichloroacetic acid Glen research 各種アミダイト (ra,rg,rc,ru), Fluorescein, Chemical Phosphorylation reagent ナカライテスク 28% Ammonia water, EtOH (99.5%), AcOH, N,N'-Methylene-bisacrylamide, TEA, Urea, acrylamide 和光純薬 1 H-Tetrazole, MeCN ( 核酸合成用 合成 用脱水溶媒 ), CH 2 Cl 2 ( ペプチド合成用 ), ホルムアミド ( 脱イオン処理済み ), APS, TEMED, EDTA-4Na, ホウ酸 生物系実験 promega psi-check -2 vector, Dual-Glo Luciferase Assay System, TransFast Transfection Reagent

52 Wako D-MEM (high glucose) Invitrogen Trypsin-EDTA MitoTraker Red CMXRos, OPTI-MEM 実験方法 Scheme 1 Initial synthesis route of 6'-abasic glucosamine monomer unit. Reagents and conditions: (a) (i) MeONa, MeOH, rt; (ii) Phthalic anhydride, MeOH, rt; (iii) Acetic anhydride, pyridine, rt, 68%; (b) PhSH, Et 2 O BF 3, CH 2 Cl 2, rt, 93%; (c) benzyloxyethanol, NIS, TfOH, CH 2 Cl 2, 4Å MS, rt, 60%; (d) MeONa, MeOH, rt, 85%; (e) TBDMSCl, pyridine, rt, 97%; (f) BzCl, pyridine, rt, 95%; (g) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, 95%; (h) DMTrCl, pyridine, rt, 88 %; (i) TBAF, THF, 0ºC, 35%; (j) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 28 μmol/g

53 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-N-phthalimido-β-D-glucopyranoside (4) 3 (100 mg, μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 CH 2 Cl 2 (2 ml) に溶解し MS 4Å (100 mg) NIS (87 mg, μmol) TfOH (2 μl) を加えアルゴン雰囲気下室温で 2 時間攪拌した 反応終了後 MS 4Å をセライトでろ過した ろ液を CHCl 3 (10 ml) にて抽出し 有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液 (10 ml) 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (10 ml) 飽和食塩水 (10 ml) で洗浄し 無水硫酸ナトリウムで乾燥後 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1) で分離精製し 白色固体 4 (65 mg, 60%) を得た 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-N-phthalimido-β-D-glucopyranoside (5) 4 (1.00 g, 1.76 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 MeOH (30 ml) に溶解し MeONa (28% in MeOH) (10.0 ml, 48.9 mmol) を加え室温で 30 分間攪拌した 反応終了後 AcOH を加え反応を中和し 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( クロロホルム : メタノール = 15 : 1 8 : 1) で分離精製し 白色固体 5 (662 mg, 85%) を得た 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-6-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxy-2-N-phthalimido-β- D-glucopyranoside (6) 5 (400 mg, 902 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (10 ml) に溶解し TBDMSCl (273 mg, 1.81 mmol) を 0 C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で 5 時間攪拌した 反応終了後 0 C で MeOH (25 ml) を加え反応を終結させ さらに 1 時間室温で攪拌した 溶媒を減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( クロロホルム : メタノール = 15 : 1) で分離精製し 無色油状 6 (492 mg, 97%) を得た

54 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-3,4-di-O-benzoyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxy- 2-N-phthalimido-β-D-glucopyranoside (7) 6 (380 mg, 681 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (10 ml) に溶解し BzCl (4.62 ml, 39.8 mmol) を 0 C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で 6 時間攪拌した 反応終了後 0 C で MeOH (25 ml) を加え反応を終結させた 溶媒を減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 1 : 1) で分離精製し 無色油状 7 (495 mg, 95%) を得た 3,4-Di-O-benzoyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxy-1-O-(2-hydroxyethyl)- 2-N-phthalimido-β-D-glucopyranoside (8) 7 (506 mg, 661 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 THF (20 ml) に溶解し 20% Pd(OH) 2 /C (152 mg, 30 wt %) を加え H 2 雰囲気下室温で 20 分間攪拌した 反応終了後 Pd(OH) 2 /C をセライトでろ過した ろ液をを減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( クロロホルム : メタノール = 30 : 1 25 : 1) で分離精製し 無色油状 8 (425 mg, 95%) を得た 3,4-Di-O-benzoyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxy- 1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-2-N-phthalimido-β-D-glucopyranose (9) 8 (251 mg, 371 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (10 ml) に溶解し DMTrCl (160 mg, 475 μmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 6 時間攪拌した 反応終了後 MeOH (10 ml) を加え反応を終結させ 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 数滴ピリジンを有するヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 1 : 1) で分離精製し 淡黄色油状 9 (318 mg, 88%) を得た

55 3,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]- 2-N-phthalimido-β-D-glucopyranose (10) 9 (476 mg, 487 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 THF (25 ml) に溶解し TBAF (625 μg, 625 μmol) を加えアルゴン雰囲気下 0 C で 3 時間攪拌した 反応終了後 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 数滴ピリジンを有するヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 1 : 1) で分離精製し 淡黄色油状 10 (145 mg, 35%) を得た Solid support (11) 10 (213 mg, 247 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (4 ml) に溶解し 無水コハク酸 (128 mg, 1.28 mmol) DMAP (3 mg, 25 μmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 36 時間攪拌した 反応終了後 反応液を酢酸エチルと水にて抽出し 有機層を減圧除去した後 精製せず 一晩乾燥した その後 アルゴン雰囲気下粗生成物を DMF (6.2 ml) に溶解し CPG 樹脂 (522 mg, 62 μmol) を加え樹脂がなじむように軽くナスフラスコを振とうさせ EDC (48 mg, 247 μmol) を加え 室温で 3 日間振とうした カップリング反応終了後 ガラスフィルターで溶媒を減圧除去し ピリジンで樹脂を洗浄した 樹脂を集めたナスフラスコに 0.1 M DMAP 溶液 ( ピリジン 13.5 ml 無水酢酸 1.5 ml DMAP 183 mg) を加え アルゴン雰囲気下 さらに室温で 2 日間振とうした キャッピング反応終了後 ガラスフィルターで溶媒を減圧除去しピリジン EtOH MeCN で洗浄しデシケーターで乾燥し CPG 樹脂固層担体 11 (455 mg) を得た 11 (6 mg) を測り取り 過塩素酸溶液 (HClO 4 : EtOH = 3 : 2) で脱保護し その溶液が示す波長 498 nm でのトリチル基の吸光度から 以下の式を用いて算出した その結果 CPG 樹脂固層担体 11 の活性は 28.4 μmol/g であった

56 CPG activity = Absorbance (498 nm) Volume (HClO 4 ) 14.3 (ε value of DMTr) Weight (CPG resin) Scheme 2. Synthesis route of 6'-abasic glucosamine monomer unit. Reagents and conditions: (a) (i) MeONa, MeOH, rt; (ii) Phthalic anhydride, MeOH, rt; (iii) Acetic anhydride, pyridine, rt, 68%; (b) PhSH, Et 2 O BF 3, CH 2 Cl 2, rt, 93%; (c) Ethylenediamine, MeCN, reflux, 60%; (d) TIPSCl, pyridine, rt, 86%; (e) (CF 3 CO) 2 O, pyridine, rt, 79%; (f) BzCl, pyridine, rt, 83%; (g) benzyloxyethanol, NIS, TfOH, CH 2 Cl 2, 4Å MS, rt, 78%; (h) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, 89%; (i) DMTrCl, pyridine, rt, 98%; (j) TBAF, THF, rt, 68%; (k) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 19 μmol/g

57 2-Deoxy-2-phthalimino-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside 76) (2) 1 (10.0 g, 46.4 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 MeOH (500 ml) に溶解し MeONa (28% in MeOH) (11.4 ml, 55.7 mmol) を加え室温で 3 時間攪拌した その後 無水フタル酸 (13.7 g, 92.8 mmol) を加え さらに室温で 3 時間攪拌した 反応終了後 溶媒を減圧留去し 残留物を一晩乾燥した 翌朝粗生成物をピリジン (400 ml) に溶解し 無水酢酸 (65.8 ml, 696 mmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 12 時間攪拌した 反応終了後 0 C で MeOH (200 ml) をゆっくり加え溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 5 : 2) で分離精製し 無色固体 2 (15.1 g, 68%) を得た Phenyl 2-deoxy-2-phthalimino-3,4,6-tri-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranoside 77) (3) 2 (6.01 g, 12.6 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 CH 2 Cl 2 (60 ml) に溶解し thiophenol (1.32 ml 12.6 mmol) BF 3 OEt 2 (10.0 ml, 37.8 mmol) を加えアルゴン 雰囲気下室温で 20 時間攪拌した 反応終了後 TEA を加え反応を中和し CHCl 3 (50 ml) と飽和食塩水 (50 ml) にて抽出した その後 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 5 : 2 3 : 1) で分離精製し 無色固体 3 (6.20 g, 93%) を得た Phenyl 2-amino-2-deoxy-1-thio-β-D-glucopyranoside 78) (12) 3 (1.16 g, 2.20 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 MeCN (10 ml) に溶解し エチレンジアミン (8.90 ml, 132 mmol) を加えアルゴン雰囲気下 90 C で 22 時間還流した 反応終了後 反応温度を室温まで戻し 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 酢酸エチル : メタノール :

58 水 = 8 : 1.5 : 1) で分離精製し 無色固体 12 (398 mg, 60%) を得た Phenyl 2-amino-2-deoxy-1-thio-6-O-(triisopropylsilyl)-β-D-glucopyranoside (13) 12 (3.98 g, 14.7 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (25 ml) に溶解し TIPSCl (4.25 ml, 19.1 mmol) を 0 C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で 22 時間攪拌した 反応終了後 0 C で MeOH (25 ml) を加え反応を終結させ さらに 1 時間室温で攪拌した 溶媒を減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 酢酸エチル : メタノール = 1 : 0 10 : 1) で分離精製し 淡黄色油状 13 (5.43 g, 86%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 7.65 (m, 5H), 4.98 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.72 (m, 1H), (m, 1H), 2.97 (m, 1H), (m, 21H); 13 C NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ 133.5, 132.8, 130.0, 129.3, 84.9, 82.5, 75.3, 71.1, 64.1, 56.3, 18.6, 13.0; MS (DRAT) m/z 428 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 21 H 38 NO 4 SSi [M+H] + : Found: Phenyl 2-deoxy-1-thio-2-trifluoroacetylamino-6-O-triisopropylsilyl-β-D-gluco- pyranoside (14) 13 (5.40 g, 12.6 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (20 ml) に溶解し 無水トリフルオロ酢酸 (3.57 ml, 25.2 mmol) を0 C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で1 時間攪拌した 反応終了後 0 CでMeOH (10 ml) を加え反応を終結させた 溶媒を減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( クロロホルム : メタノール = 30 : 1 20 : 1) で分離精製し 淡黄色油状 14 (5.21 g, 79%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 5H), 4.75 (d, J = 10.4 Hz, 1H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 1H), (m, 1H), ppm (m, 21H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ (q, J = 37.2 Hz),

59 132.8, 131.9, 128.9, 128.1, (q, J = 286 Hz), 85.3, 78.7, 74.8, 72.8, 64.6, 54.9, 17.9, 11.7 ppm; MS (DRAT) m/z 524 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 23 H 36 F 3 NO 5 SSi [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 23 H 36 F 3 NO 5 SSi: C, 52.75; H, 6.93; N, Found: C, 52.73; H, 6.89; N, Phenyl 3,4-di-O-benzoyl-2-deoxy-1-thio-2-trifluoroacetylamino-6-Otriisopropylsilyl-β-D-glucopyranoside (15) 14 (5.21 g, 9.95 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (20 ml) に溶解し BzCl (4.62 ml, 39.8 mmol) を 0 C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で 1 時間攪拌した 反応終了後 0 C で MeOH (25 ml) を加え反応を終結させた 溶媒を減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 5 : 1 4 : 1) で分離精製し 無色油状 15 (6.07 g, 83%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 4H), (m, 4H), (m, 7H), (m, 1H), (m, 1H), 5.10 (d, J = 10.0 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), ppm (m, 21H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 167.6, 165.0, (q, J = 37.2 Hz), 133.8, 133.3, 132.8, 131.8, 129.8, 129.4, 128.9, 128.5, 128.3, 128.2, 128.1, (q, J = 287 Hz), 86.3, 79.6, 74.5, 69.2, 62.8, 53.6, 17.9, 11.8 ppm; MS (DRAT) m/z 732 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 37 H 45 F 3 NO 7 SSi [M+H] + : Found: O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-3,4-di-O-benzoyl-2-trifluoroacetylamino-6-Otriisopropylsilyl-β-D-glucopyranose (16) 15 (6.07 g, 8.30 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 CH 2 Cl 2 (15 ml) に溶解し MS 4Å (2 g) NIS (4.70 g, 20.8 mmol) TfOH (150 μl) を加えアルゴン雰囲気下室温で 15 分間攪拌した 反応終了後 MS 4Å をセライトでろ過した

60 ろ液を CHCl 3 (50 ml) にて抽出し 有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液 (50 ml) 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (50 ml) 飽和食塩水 (50 ml) で洗浄し 無水硫酸ナトリウムで乾燥後 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1) で分離精製し 淡黄色油状 16 (5.01 g, 78%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 4H), (m, 2H), (m, 9H), (m, 1H), (m, 1H), 4.87 (d, J = 8.4 Hz), (m, 2H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 4H), (m, 2H), ppm (m, 21H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 166.9, 165.0, (q, J = 37.2 Hz), 137.9, 133.6, 133.3, 129.9, 129.6, 129.1, 129.0, 128.4, 128.4, 127.8, 127.7, 125.4, (q, J = 287 Hz), 100.7, 75.5, 73.2, 72.9, 69.3, 69.1, 68.8, 62.7, 55.1, 17.8, 11.9 ppm; MS (DRAT) m/z 774 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 40 H 51 F 3 NO 9 Si [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 40 H 51 F 3 NO 9 Si: C, 62.08; H, 6.51; N, Found: C, 61.91; H, 6.37; N, ,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-(2-hydroxyethyl)-2-trifluoroacetylamino-6-Otriisopropylsilyl-β-D-glucopyranose (17) 16 (1.50 g, 1.93 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 THF (80 ml) に溶解し 20% Pd(OH) 2 /C (450 mg, 30 wt %) を加えH 2 雰囲気下室温で72 時間攪拌した 反応終了後 Pd(OH) 2 /Cをセライトでろ過した ろ液をを減圧留去した後 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し 無色固体 17 (1.18 g, 89%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 4H, H-Ph), (m, 2H), (m, 4H), (m, 1H), (m, 1H), 4.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 7H), ppm (m, 21H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 167.1, 165.0, (d, J = 37.2 Hz), 133.7, 133.4, 129.9, 129.6, 128.9,

61 128.5, 128.4, 128.3, (d, J = 286 Hz), 101.2, 75.5, 72.8, 72.5, 69.0, 62.7, 62.1, 55.3, 17.8, 11.8 ppm; MS (DRAT) m/z 684 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 33 H 44 F 3 NO 9 Si [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 33 H 44 F 3 NO 9 Si: C, 57.96; H, 6.49; N, Found: C, 57.60; H, 6.23; N, ,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-2-trifluoroacet yl-amino-6-o-triisopropylsilyl-β-d-glucopyranose (18) 17 (1.18 g) をデシケーターで一晩乾燥後 ピリジン (12 ml) に溶解し DMTrCl (697 mg, 2.07 mmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 24 時間攪拌した 反応終了後 MeOH (10 ml) を加え反応を終結させ 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 数滴ピリジンを有する酢酸エチル ) で分離精製し 無色固体 18 (1.67 g, 98%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 4H), (m, 15H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 4H), (m, 2H), 4.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 4H), (m, 1H), (m, 1H), ppm (m, 21H); MS (DRAT) m/z 986 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 54 H 63 F 3 NO 11 Si [M+H] + : Found: ,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-2-trifluoroacet yl-amino-β-d-glucopyranose (19) 18 (597 mg, 600 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 THF (10 ml) に溶解し TBAF (910 μg, 910 μmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 22 時間攪拌した 反応終了後 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 数滴ピリジンを有するヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し 無色固体 19 (341 mg, 68%) を得た 1 H NMR (CDCl 3 ) δ (m, 4H), (m, 15H), 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 4H),

62 (m, 1H), 4.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), (m, 8H), ppm (m, 2H); MS (DRAT) m/z 830 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 45 H 43 F 3 NO 11 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 45 H 42 F 3 NO 11 H 2 O: C, 63.75; H, 5.23; N, Found: C, 63.45; H, 5.25; N, Solid support (20) 19 (531 mg) を CPG 樹脂固層担体 11 の合成方法と同様に合成を行い CPG 樹脂 固層担体 20 (1.56 g) を得た その活性は 19.3 μmol/g であった Scheme 3. Synthesis of N 3 -Bz-Thymine and Di-Boc-Adenine. Reagents and conditions: (a) BzCl, pyridine, MeCN; (b) K 2 CO 3, Dioxane, H 2 O N 3 -Bz-Thymine 79) Thymine (10.0 g, 78.5 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 pyridine (40 ml) と MeCN (100 ml) に溶解し BzCl (28 ml, mmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で 24 時間攪拌した 原料が消えた後 MeOH を加え反応を終結させ Toluene と共沸し 溶媒を減圧留去した 粗生成物に 0.5 M の K 2 CO 3 (60 ml) と Dioxane (120 ml) を加え さらに室温で 24 時間攪拌した 反応液を CHCl 3 (120 ml) にて抽出し 有機層を 2 M の HCl 水溶液 (100 ml) 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (100 ml) 飽和食塩水 (100 ml) で洗浄し 無水硫酸ナトリウムで乾燥させた CHCl 3 で再結晶を行い N 3 -Bz-Thymine (8.22 g, 45%) を得た

63 Scheme 4. Synthesis route of 6'-basic glucosamine monomer unit. Reagents and conditions: (a) Benzyloxyethanol, Me 2 O BF 3, MeCN, reflux, 67%; (b) MeONa, MeOH, rt, 88%; (c) N 3 -Benzoyl-thymine, PPh 3, DEAD, THF, rt, 84%; (d) Ethylenediamine, EtOH, reflux, 87%; (e) (CF 3 CO) 2 O, pyridine, rt, 90%; (f) Pd(OH) 2 /C, H 2, THF, rt, quant; (g) DMTrCl, Pyridine, rt, 79%; (h) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 37 umol/g. 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-3,4,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranose 80) (21) 2 (50 mg, 105 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 MeCN (2 ml) に溶解し 2-benzyloxy ethanol (150 μl, 1.05 mmol) BF 3 OMe 2 (29 μl, 315 μmol) を加えアルゴン雰囲気下 90 C で 5 時間還流した 反応終了後 反応温度を室温まで戻し TEA を加え反応を中和し 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1 1 : 2) で分離精

64 製し 無色固体 21 (40 mg, 67%) を得た 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-β-D-glucopyranose (22) 21 (1.42 g, 2.50 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後 MeOH (20 ml) に溶解し MeONa (28% in MeOH) (10.0 ml, 48.9 mmol) を加え室温で 30 分間攪拌した 反応終了後 AcOH を加え反応を中和し 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シ リカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 2) で分 離精製し 無色固体 22 (1.06 g, 88%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 2H), (m, 2H), (m, 3H), (m, 2H), 5.34 (d, J = 8.5 Hz, 1H), (m, 1H), 4.27 (2H, s), 4.16 (dd, J = 11.0 Hz, 8.5 Hz, 1H), (m, 3H), (m, 2H), (m, 1H), ppm (m, 2H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ 168.5, 138.0, 134.0, 131.7, 128.2, 127.4, 123.4, 98.5, 75.5, 72.9, 71.7, 71.6, 69.1, 68.8, 61.9, 56.6 ppm; MS (DRAT) m/z 444 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 23 H 26 NO 8 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 23 H 25 NO 8 1/4H 2 O: C, 62.30; H, 5.68; N, Found: C, 61.72; H, 5.59; N, (N 3 -Benzoylthymine-1-yl)-1-O-(2-benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-β-Dglucopyranose (23) 22 (603 mg, 1.36 mmol) N 3 -benzoylthymine (315 mg, 1.36 mmol) PPh 3 (716 mg, 2.72 mmol) の混合物をデシケーターで一晩乾燥後 THF (20 ml) に溶解し DEAD (1.27 ml, 2.72 mmol) を加え室温で 48 時間攪拌した 反応終了後 MeOH (20 ml) を加え反応を終結させ 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 2) で分離精製し 無色固体 23 (751 mg, 84%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.94 (d, J = 7.8 Hz), (m, 2H), (m,

65 3H), (m, 2H), (m, 4H), (m, 2H), 5.36 (d, J = 8.8 Hz), (m, 1H), (m, 1H), 4.31 (d, J = 3.9 Hz), (m, 1H), (m, 1H), (m, 3H), (m, 2H), (m, 1H), 1.95 ppm (s, 3H). 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 168.4, 168.2, 162.7, 151.6, 141.5, 137.9, 135.2, 134.0, 131.7, 131.3, 130.4, 129.3, 128.3, 127.5, 127.4, 123.4, 111.3, 98.8, 74.2, 73.0, 71.9, 70.2, 69.0, 68.8, 55.9, 48.5, 12.4 ppm; MS (DRAT) m/z 656 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 35 H 34 N 3 O 10 [M+H] + : Found: Amino-1-O-(2-benzyloxyethyl)-2-deoxy-6-(thymine-1-yl)-β-D-glucopyranose (24) 23 (54 mg, 82 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後 EtOH (5 ml) に溶解し エチレンジアミン (335 μl, 4.94 mmol) を加えアルゴン雰囲気下 90 C で 2 時間還流した 反応終了後 反応温度を室温まで戻し 溶媒を減圧留去した 残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( クロロホルム : メタノール = 4 : 1) で分離精製し 無色固体 24 (30 mg, 87%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 5H), 7.05 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 1H), (m, 1H), 1.79 ppm (s, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 164.4, 151.9, 141.9, 137.7, 128.2, 127.5, 110.0, 103.5, 76.5, 75.2, 74.1, 72.9, 71.2, 68.8, 68.7, 56.7, 48.6, 11.9 ppm; MS (DRAT) m/z 422 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 20 H 28 N 3 O 7 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 20 H 27 N 3 O 7 H 2 O: C, 54.66; H, 6.65; N, Found: C, 54.37; H, 54.37; N,

66 1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-6-(thymine-1-yl)-2-trifluoroacetylamino-β-D-glucopyranose (25) 24 (273 mg) を化合物 16の合成方法と同様に合成を行い 中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 酢酸エチル ) で分離精製し 無色固体 25 (300 mg, 90%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 7.39 (s, 1H), (m, 5H), (m, 3H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 2H), 1.82 ppm (s, 3H). 13 C NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ 166.9, (q, J = 35.7 Hz), 153.0, , 139.6, 129.4, 128.8, 128.6, (q, J = 285 Hz), 110.2, 101.9, 75.2, 74.8, 74.1, 73.9, 70.4, 69.9, 57.7, 50.3, 12.1 ppm. MS (DRAT) m/z 518 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 22 H 26 F 3 N 3 O 8 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 22 H 26 F 3 N 3 O 8 2/3H 2 O: C, 49.91; H, 5.20; N, Found: C, 49.82; H, 5.09; N, Deoxy-1-O-(2-hydroxyethyl)-6-(thymine-1-yl)-2-trifluoroacetylamino-β- D-glucopyranose (26) 25 (299 mg) を化合物 17の合成方法と同様に合成を行い 中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し 無色固体 27 (247 mg, quant.) を得た 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ (s, 1H), 9.20 (d, J = 9.20 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 5.40 (d, J = 5.60 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 6.00 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 3H), (m, 1H), 1.73 ppm (s, 3H). MS (DRAT) m/z 428 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 15 H 21 F 3 N 3 O 8 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 15 H 20 F 3 N 3 O 8 1/2H 2 O: C, 41.29; H, 4.85; N, Found: C, 41.44; H, 4.69; N,

67 2-Deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-6-(thymine-1-yl)- 2-trifluoroacetylaminoβ-D-glucopyranose (27) 26 (740 mg) を化合物 18の合成方法と同様に合成を行い 中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 数滴ピリジンを有する酢酸エチル ) で分離精製し 無色固体 27 (994 mg, 79%) を得た 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ (m, 3H), (m, 7H), 6.85 (d, 4H, J = 8.80 Hz), 4.49 (d, 1H, J = 8.00 Hz), (m, 1H), 3.77 (s, 6H), (m, 3H), (m, 2H), (m, 3H), (m, 1H), 1.87 ppm (s, 3H). MS (DRAT) m/z 730 [M+H] +, HRMS (DART) Calcd for C 36 H 39 F 3 N 3 O 10 [M+H] + : Found: ; Anal. Calcd for C 36 H 38 F 3 N 3 O 10 : C, 59.26; H, 5.25; N, Found: C, 58.88; H, 5.21; N, Solid support (28) 27 (399 mg) を CPG 樹脂固層担体 20 の合成方法と同様に合成を行い CPG 樹脂 固層担体 28 (1.29 g) を得た その活性は 36.7 μmol/g であった オリゴヌクレオチドの合成と粗精製 DNA/RNA 自動合成機 (Applied Biosystem Model 3400) を用い ホスホロアミダイト固相合成法に従い 1 μmol スケールで合成を行った ホスホロアミダイト ra ru rg rc dt およびは 5'- 末端蛍光ホスホロアミダイト 5'-F をそれぞれ 0.1 M になるように MeCN に溶解し RNA protocol の常法に従い合成した オリゴヌクレオチドの 5 末端は DMTr 基を除去した状態で合成を終了した 合成終了後 Ar ガスで CPG 樹脂を十分乾燥させた CPG 樹脂体を蓋付きのエッペンドルフチューブに移し NH 4 OH : EtOH = 3 : 1 (v/v) 水溶液 (1.2 ml) を加え 室温で 12 時間振とうさせ 樹脂からの切り出しおよび脱保護を行った

68 上清をエッペンドルフチューブに移した後 H 2 O : EtOH = 3 : 1 (v/v) 水溶液 (1.2 ml) で CPG 樹脂を洗浄し 同様に上清をエッペンドルフチューブに移すことを 2 回繰り返した スピードバックにて一晩乾固させた 残渣に 1 M TBAF/THF 溶液 (1 ml) を加え 室温で 12 時間振とうさせ シリル基の脱保護を行なった 反応溶液を 0.1 M TEAA buffer a (30 ml) に希釈し 逆相カラムクロマトグラフィー (Sep-Pak C18) に通し オリゴヌクレオチドをカラムに吸着させ 滅菌水 (10 ml) で洗浄するにより脱塩した また 50 % MeCN (1 ml 3) でオリゴヌクレオチドをエッペンドルフチューブに洗い出し スピードバックにて乾固した 残渣に loading solution (90% formamide in 1 TBE) 200 μl を加え 20% PAGE b 電気泳動によりオリゴヌクレオチドの粗精製を行い 目的オリゴ ヌクレオチドのバンドを切り出し 溶出液 c (20 ml) に浸し 一晩振とうした この濾液を Sep-Pak C18 により脱塩させ スピードバックにて乾固した a. 0.1 M TEAA buffer: AcOH ( ml) に TEA (277.6 ml) を加え Milli Q で 1 L にし ph 7.0 に調整し 2 M TEAA buffer を調製した これを滅菌水にて 20 倍希釈した b.40% アクリルアミド (19:1) 溶液 d (40 ml) 尿素 (33.6 g) 10 TBE buffer e 8 ml を混合し Milli Q を加え 80 ml にした 最後に APS (55 mg) を加え溶かし TEMED (40 μl) を加え 振り混ぜた後 速やかに 1.5 mm スペーサーを挟んで固定した 2 枚のガラス板の間に流し込み 固化するまで静置した 1 TBE buffer を泳動用緩衝液として用いた c. 溶出液 : 2 M TEAA buffer (1 ml) 0.1 M EDTA 水溶液 f (0.2 ml) を滅菌水にて 20 ml にし 調整した d.40% アクリルアミド (19 : 1) 溶液 : アクリルアミド (190 g) N,N -ビスアクリルアミド (10 g) を Milli Q にて溶解させ 500 ml とした e. 10 TBE buffer: Tris(hydroxymethyl)aminomethane (108 g) ホウ酸 (55 g) EDTA-4Na (7.43 g) を水に溶解させ 1 L にし 調製した 1 TBE buffer は

69 10 TBE buffer を水にて 10 倍希釈し 調製した f. 0.1 M EDTA 水溶液 : EDTA-4Na (1.81 g) を滅菌水で 40 ml にし 調製した オリゴヌクレオチドの定量と構造確認 オリゴヌクレオチドを滅菌水 (1 ml) に溶かし 260 nm における吸光度を測 定し その収量を求めた a また 30 pmol を乾固し 3 μl の滅菌水に溶解さ せ 3 μl のマトリックス溶液 b を加え よく混和させた後 プレートにサン プルをアプライした サンプルが乾固した後 MALDI-TOF/MS で分子量の確 認を行った a. オリゴヌクレオチドは水溶液とし 波長 260 nm での吸光度 (Abs 260 ) が, 吸光度計の有効範囲になるように希釈した 光路長 (l) 1 cm の吸光度測定用石英セルを用い 室温にて Abs 260 を測定した OD 260 値の計算には次式を用いた ここで V は溶液の全量を示す OD 260 (Mε -1 ml -1 cm -1 )=Abs 260 (Mε -1 ) V -1 (ml) l -1 (cm) また N 1 pn 2 pn 3 p N n-1 pn n で表される一本鎖オリゴヌクレオチドのモル吸光係数 ε 260 の算出には 次式を用いた ε 260 = 2 {ε (N 1 pn 2 ) +ε (N 2 pn 3 ) + +ε (N n-1 pn n ) } {ε (N 2 ) +ε (N 3 ) + +ε (N n-1 )} ここで ε (N n ) はある核酸 N n の ε 260 を示し ε (N n-1 pn n ) はある核酸二量体 N n-1 pn n の ε 260 を示す また 濃度 C (mol/l) の算出には 次式を用いた C = Abs 260 ε l -1 b. マトリックス溶液 : 3-hydroxypicolinic acid (4.85 mg) と di-ammonium hydrogen citrate (0.8 mg) を 50 % MeCN in Milli Q (50 μl) に溶解させ調整した なお di-ammonium hydrogen citrate は Na + や K + が付着するのを阻害