GBS（Genotyping by Sequencing）によるアグリゲノミクス解析

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まなたけはな
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1 GBS (Genotyping by Sequencing) によるアグリゲノミクス解析フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 1

2 研究の背景多数サンプルの SNP データを統計的に比較し表現型と関連する SNP を見つけ農作物や家畜などの育種に役立てるハイスループットな SNP ジェノタイピングには従来はマイクロアレイが多く利用されていた現在ではコストの低下などにより次世代シークエンサーを利用した DNA シークエンスによるジェノタイピング (Genotyping by Sequencing : GBS) も利用されるようになった OR SNP ジェノタイピング AGTACGAGCTCACTGCA AGTACGATCTCACTGCA AGTACGAACTCACTGCA 2

3 育種への応用 GBS データから育種に有用なマーカーを見つけるために関連解析という手法が使われる関連解析を行うことで各サンプルのジェノタイプデータと表現型データを比較し表現型のマーカーを見つけることができ家畜や農作物の育種に応用できるグループ 1 表現型との関連が高いマーカーグループ 2 3

4 関連解析の種類ゲノムワイド関連解析 (GWAS) ゲノムレベルのデータ量を扱う基本的な関連解析の手法 Chi-squared test Fisher s exact test Armitage test Correlation/Trend test Odd ratios Logistic or Linear regression etc 線形混合モデル解析おもにサンプルの血縁関係による偏りを除外し関連解析を行う場合に用いられる手法育種分野で近交系サンプルなどの解析に用いられる Mixed Model GWAS using a single locus (EMMAX) Multi-locus mixed model GWAS (MLMM) Genomic Best Linear Unbiased Predictors (GBLUP) 4

5 データ解析を行うには次世代シークエンサーやマイクロアレイから作成された大容量のジェノタイプデータや表現型データを扱うことができるこれらデータを処理するための強力な統計解析機能が搭載されている一般的なモデル生物の他多様な生物種のゲノムデータを扱うことができるそれら生物種の各種アノテーションデータを利用できる 5

SNP & Variation Suite (SVS) 1. 各メーカー (Affymetrix, Illumina など ) の SNP / CNV マイクロアレイデータおよび次世代シークエンサー解析の VCF ファイルをインポート可能 2. Golden Helix 社のサーバーから各種アノテーションデータを容易に取得可能 3.

6 SNP & Variation Suite (SVS) 1. 各メーカー (Affymetrix, Illumina など ) の SNP / CNV マイクロアレイデータおよび次世代シークエンサー解析の VCF ファイルをインポート可能 2. Golden Helix 社のサーバーから各種アノテーションデータを容易に取得可能 3. 変異解析以外に様々なアプリケーションを搭載ゲノムワイド関連解析 (GWAS) コピー数 (CNV) 解析少数サンプルの NGS 変異解析 Genomic Prediction RNA-Seq 解析多数サンプルの NGS 変異解析... など 4. 高度な統計学的計算アルゴリズムを多数搭載カイ二乗検定フィッシャー検定トレンド検定ハーディワインベルグ平衡の計算ハプロタイプブロックの検出線形混合モデル (mixed linear model) CNV 領域の検出および関連解析 DE-SeqによるRNA-Seq 発現解析 5. 有償モジュールの追加により家系情報に基づいた解析が可能線形 / ロジスティック回帰解析 LD( 連鎖不平衡 ) 解析 Runs of homozygosity (ROH) の検出 Genomic BLUP (GBLUP) による Genomic Prediction Collapsing Method によるレアバリアント関連解析メタアナリシス... など 6. 様々なグラフ表示機能 6

7 SNP & Variation Suite (SVS) アノテーションデータ表現型データジェノタイプデータサンプルの表現型データとジェノタイプデータを統合表示し各種データ解析を行う 7

8 SNP & Variation Suite (SVS) 遺伝統計学の様々な解析アルゴリズムを搭載 8

9 SNP & Variation Suite (SVS) 専用のデータ管理ツールを使用し様々なデータソースのアノテーションデータを容易にデータ解析に使用が可能 9

10 SNP & Variation Suite (SVS) 解析データの様々なグラフ表示が可能 10

11 SNP & Variation Suite (SVS) 対応生物種一覧哺乳動物 Bos taurus( ウシ ) Canis familiaris( イヌ ) Capra hircus( ヤギ ) Cricetulus griseus( チャイニーズハムスター ) Equus caballus( ウマ ) Felis catus( ネコ ) Gallus gallus( ニワトリ ) Heterocephalus glaber( ハダカデバネズミ ) Homo sapiens( ヒト ) Macaca mulatta( アカゲザル ) Mus musculus( マウス ) Nomascus leucogenys( ホロジロテナガザル ) Ovis aries( ヒツジ ) Rattus norvegicus( ラット ) Sus scrofa( ブタ ) Vicugna pacos( アルパカ ) 植物 Arabidopsis thaliana( シロイヌナズナ ) Brassica rapa( アブラナ ) Capsicum annuum( トウガラシ ) Carica papaya( パパイア ) Citrullus lanatus( スイカ ) Eucalyptus grandis( ユーカリ ) Glycine max( ダイズ ) Gossypium raimondii( ワタ ) Oryza sativa( イネ ) Prunus persica( モモ ) Setaria italica( アワ ) Solanum lycopersicm( トマト ) Solanum tuberosum( ジャガイモ ) Sorghum bicolor( モロコシ ) Zea mays( トウモロコシ ) 魚類 Danio retio( ゼブラフィッシュ ) Medaka( メダカ ) Oncorhynchus mykiss( ニジマス ) その他 Anopheles gambiae( ハマダラカ ) Caenorhabditis elegans( 線虫 ) Drospphila melanogaster( ショウジョウバエ ) E.coli( 大腸菌 ) Leishmania infantum JPCM5( リーシュマニア寄生虫 ) Mycobacterium tuberculosis H37Rv( 結核菌 ) Plasmodium falciparum 3D7( マラリア ) Saccharomyces cerevisiae( 出芽酵母 ) Schizosaccharomyces pombe( 分裂酵母 ) Staphylococcus aureus( 黄色ブドウ球菌 ) 11

12 解析の流れ使用するジェノタイプデータ : 生物種 : トウモロコシ (Zea mays) NGSサンプルデータ数 : 281 例ファイルフォーマット :VCFファイル変異数 : 3,096 個データのインポートジェノタイプデータファイル表現型データファイルのインポートクオリティコントロール各種クオリティデータに基づくフィルタリングとサンプル間相関データの作成関連解析の実行線形混合モデルを用いたジェノタイプ関連解析の実行ビジュアライゼーションマンハッタンプロットの表示 12

13 データのインポートデータファイル表現型データファイル (Excel ファイル Text ファイル ) 表現型データファイルには疾患 / 正常などのグループ分類の他に身長体重などの連続値のデータも使用できるジェノタイプデータファイルはバリアントコール用ツールなどで作成した VCF ファイルを使用するジェノタイプデータファイル (VCF ファイル ) 13

14 データのインポート SVS へのインポート表現型データファイル (Excel ファイル ) のインポートジェノタイプデータファイル (VCF ファイル ) のインポート 14

15 データのインポートデータの統合表現型データシートジェノタイプデータシートシートの結合 15

クオリティコントロール評価項目 SNP & Variation Suite で使用可能なクオリティコントロール SNP Call Rateの検証 Hardy Weinberg 平衡 (HWE) の計算 Minor Allele Frequency (MAF) に基づくフィルタリング連鎖不平衡を示すSNPの除去集団の階層化

16 クオリティコントロール評価項目 SNP & Variation Suite で使用可能なクオリティコントロール SNP Call Rateの検証 Hardy Weinberg 平衡 (HWE) の計算 Minor Allele Frequency (MAF) に基づくフィルタリング連鎖不平衡を示すSNPの除去集団の階層化 (Population stractification) 性別誤認 (Gender misidentification) の検出メンデルエラーの検証常染色体のヘテロ接合性 Principal Component Analysis(PCA) Identity by Descent (IBD) の計算多次元解析による異常値検出染色体異常スクリーニング... など 16

17 クオリティコントロール処理の実行以下項目で SNP のフィルタリングを実行 Call Rate 検出された SNP の割合 Number of allele 検出されたアレル数 Alternate allele frequency 変異アレルの頻度 Linkage disequilibrium (LD) SNP 間の連鎖不平衡 17

18 クオリティコントロールサンプル間の相関データフィルタリングを行った SNP データを使用し GBLUP モデルでサンプル間の相関を計算 18

19 関連解析サンプルの問題点 Inbred lines( 近交系 ) サンプルを解析に使用する場合は関連解析実行時に血縁関係によるバイアスを取り除く必要がある今回使用する線形混合モデルではサンプル間の相関データを使って血縁関係にあるデータを補正することができる血縁関係の他民族の違いによるバイアスも補正が可能 19

20 関連解析線形混合モデルの種類 Mixed Model GWAS using a single locus (EMMAX) ジェノタイプデータによるサンプル間の相関データを用いて血縁関係の偏りを補正する 1 か所の SNP ごとに表現型との関連を計算する Multi-locus mixed model GWAS (MLMM) ジェノタイプデータによるサンプル間の相関データを用いて血縁関係の偏りを補正する複数か所の SNP をまとめて表現型との関連を計算する Genomic Best Linear Unbiased Predictors (GBLUP) ジェノタイプデータによるサンプル間の相関データを用いて血縁関係の偏りを補正するサンプルごとのランダム効果と SNP ごとのアレル代替効果を計算する農学分野における育種価の計算に用いられる 20

21 関連解析解析の実行最初に検定に使用するサンプルの表現型データの種類を指定する線形混合モデルのパラメータでクオリティコントロールで計算しておいたサンプル間相関データを選択する 21

22 関連解析解析結果計算が終了すると使用した計算手法ごとに別のデータとして各 SNP を評価した P-Value などのデータが出力される 22

23 ビジュアライゼーション GenomeBrowse Golden Helix 社より無償で提供されているゲノムブラウザー GenomeBrowse が SVS に組み込まれており BAM ファイルデータ VCF ファイルデータ各種数値データやアノテーションデータなどを統合表示が可能 23

24 ビジュアライゼーション表示データの選択関連解析で計算したシートの各 SNP ごとの -log10(p-value) を選択してプロットする同時に各種データベースのアノテーションデータやユーザー作成データのプロットも可能 24

25 ビジュアライゼーション表示結果プロット上の各ポイントをクリックすると画面左下に SNP の詳細情報が表示される 25

26 オプション解析変異の分類多数サンプルデータによる統計処理以外にも各種データベースのアノテーションデータを利用した解析も可能タンパク質アミノ酸配列の変化による非同義変異の抽出やコモン SNP の除去などが可能 26

27 ソフトウェアの詳細は以下の弊社 Web サイトをご覧ください SNP & Variation Suite (SVS): お問い合わせ先 : フィルジェン株式会社 TEL (9:00~17:00) FAX biosupport@filgen.jp 27

PowerPoint プレゼンテーション

PowerPoint プレゼンテーション ~ NGS トリオ解析による疾患関連変異の探索 ~ フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 (biosupport@filgen.jp) 1 本日の内容 Golden Helix 企業概要 Golden Helix 社製ソフトウェア VarSeqイントロダクション VarSeq 詳細デモンストレーション : NGS トリオ解析デモライセンス 2 Golden Helix 企業概要アメリカのモンタナ州にて1998