(12・6No.3)予稿集資料（福岡大学　福田）-1

Size: px

Start display at page:

Download "(12・6No.3)予稿集資料（福岡大学　福田）-1"

みがねかやぬま
5 years ago
Views:

1 1 R 編集機構を利用した部位特異的 R 変異導入を可能にする新規ガイド R 福岡大学理学部化学科助教福田将虎

2 2 研究背景 ( タンパク質の合成経路 - セントラルドグマ -) D 設計図 R D 情報を運ぶタンパク質生命現象の担い手遺伝情報は D R タンパク質の順に流れるタンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている

3 3 研究背景 ( タンパク質機能の異常は病気の原因 ) 作られる量や機能が変わる D 設計図 R D 情報を運ぶタンパク質生命現象の担い手多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる

4 4 研究背景 ( タンパク質機能制御の位置づけ ) 機能制御 D 設計図 R D 情報を運ぶタンパク質生命現象の担い手タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば生命現象を制御できる = 病気の予防治療ができる

5 5 生体内標的タンパク質の機能を制御する方法情報機能 D R タンパク質情報のレベルで標的タンパク質の機能を制御 ( 遺伝子改変技術 ) 標的タンパク質の機能を直接制御する ( 一般的な薬剤 )

6 遺伝子改変技術の比較ゲノム編集 (CRISPR-Cas9) sir, mir R 編集標的 D R R 効果恒常的一過的一過的オフターゲットのリスク大小小タンパク質制御自在発現抑制自在標的設定相補鎖相補鎖使用物質 R タンパク質 R 内在の機構を利用用途 D 遺伝子治療核酸製剤相補鎖 R 内在の機構を利用未開発 ( 目的 )R レベルで情報を改変する新たな技術を開発する 6

7 7 R 編集機構 R の段階で遺伝情報を変換する D R タンパク質 -to-i R 編集 adenosine H 2 inosine P - P - H H H P - P -

8 -to-i R 編集二本鎖 R 特異的アデノシンデアミナーゼ DR: denosine Deaminase cting on R アデノシン (denosine) P - H 2 DR イノシン (Inosine) P - H P - H P - H I ほぼ全ての高等生物が持つ生体の恒常性維持に必須の機構 IはGとして翻訳される (D 上の G 変異と等価 ) =タンパク質のアミノ酸配列 ( 機能 ) が変わるスプライシングを制御 mirのプロセシング及びrサイレンシングを制御 ishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013) 8

9 -to-i R 編集によるコドン変換 Prior to editing Ser Tyr Thr Ile Start/Met GU/C UU/C C/C/G/U UU//C UG fter -to-i editing Gly Cys la Val Val IGU/C UIU/C IG/C/G/U IUU/C/ IUG ( 例 ) Ser Gly -GU- -IGU- = -GGU-

9 9 -to-i R 編集によるコドン変換 Prior to editing Ser Tyr Thr Ile Start/Met GU/C UU/C C/C/G/U UU//C UG fter -to-i editing Gly Cys la Val Val IGU/C UIU/C IG/C/G/U IUU/C/ IUG ( 例 ) Ser Gly -GU- -IGU- = -GGU- タンパク質リン酸化制御約 30% の細胞内タンパク質がリン酸化される ( 機能が調節されている ) がんを始めとする腫瘍細胞ではタンパク質リン酸化シグナル伝達が異常 Stop His U UG, UG CU/C Trp rg UII UIG, UGI CIU/C タンパク質活性制御活性中心金属配位アミノ酸の変換 Lys /G Gly IG/G Glu I/G sn Gln U/C C/G sp rg IU/C CI/G Ser IU/C タンパク質発現調節開始コドン終止コドンの変換 sp GU/C Gly GIU/C Glu G/G Gly GI/G 様々な生体プロセスの制御が可能

(2000) DR2: 生後 2 3 週間で致死 Higuchi, M. et al., ature, 406, 78. (2000) hdr2 の構造 Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005) Stefl, R et al.

10 10 R 編集酵素 denosine deaminase acting on R (DR) P - P - H H 2 P I - P - H H 二本鎖構造中のアデノシンを編集するほとんどの細胞種で発現 ( 特に神経細胞で高発現 ) Deaminase domain dsrbd2 dsrbd1 DR ノックアウトマウスは DR1: 胚性致死 Wang, Q. et al., Science, 290, (2000) DR2: 生後 2 3 週間で致死 Higuchi, M. et al., ature, 406, 78. (2000) hdr2 の構造 Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005) Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010) mir のプロセシング及び R サイレンシングを制御 ishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)

11 11 -to-i R 編集機構を利用した R 変異導入 hdr2 dsrbd2 標的 R に DR を誘導し部位特異的に -to-i 変異を導入する R 変異導入法標的 R I 標的アデノシン

Chem. Int. Ed. Engl., 51, 11166. (2012) Montiel-Gonzalez, M. F. et.

12 従来の R 変異導入法の特徴 Deaminase domain (DD) guide-r (gr) SP-DD λ-dd SP-tag BzG-gR λ box-gr Stafforst, T. and Schneider, M. F. ngew. Chem. Int. Ed. Engl., 51, (2012) Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PS, 110, (2013) ( 修飾した DR を用いる ) 煩雑な操作が必要内在の R 編集に干渉する可能性 12

13 13 本 R 変異導入技術のコンセプト D-gR による R 変異導入内在の R 編集機構を利用相補配列で標的を設定 DR-guide R (D-gR) DR を目的部位に誘導するガイド R hdr2 標的 R I 標的アデノシン

14 14 編集ガイド R(D-gR) 設計コンセプト hdr2 Deaminase domain dsrbd2 dsrbd1 CUU GGUGGGUGG U G UUCUU G C GUGU CCUCCCC UU UUUGUUGU U C C G GluR2 R ( 生体内の編集基質 R) dsrbds と GluR2 R の複合体 (Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))

15 編集ガイド R(D-gR) 設計コンセプト標的 R 天然型 DR を誘導 ( 内在の R 編集機構を利用 ) 相補領域の配列で標的部位を設定 D-gR GGGUGG U G UUCUU G C XXXXX XXXUCCCC UU UUUGUUGU U C C G 相補領域 (<15 nt) DR 結合領域 (40-49 nt) 15

実施例 1 (D-gR の設計と機能評価 ) 配列設計 5 GFP mr 200 UGCCCCCUGGCU CGGCGUGCGUGCUU 3 3

reaction condition) 300 nm GFPs R (160 nt) 900 nm D-guide GFP_200 10 mm

6), 150 mm acl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min 1 2 3 In vitro 編集解析 +

16 実施例 1 (D-gR の設計と機能評価 ) 配列設計 5 GFP mr 200 UGCCCCCUGGCU CGGCGUGCGUGCUU 3 3 CUGGUGGGCUCG C GCC D-guide GFP_200 複合体形成確認 (Gel shift assay) (nnealing reaction condition) 300 nm GFPs R (160 nt) 900 nm D-guide GFP_ mm Tris-HCl (ph 7.6), 150 mm acl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min In vitro 編集解析 + hdr2 in vitro editing reaction RT-PCR 8% ative PGE (EtBr staining) Lane 1: GFPs R (160 nt) Lane 2: D-guide GFP_200 Lane 3: nnealed sample Direct sequencing 16

実施例 1 (D-gR の設計と機能評価 ) o guide-r G G 200 C T C G G C G GFP R hdr2 100 編集率 ( 反応時間 1 時間 ) ピーク高の比 (G/(+G)) から算出 ntisense R hdr2 G G C T G C G G C G % editing 80 60 40 20 D-gR hdr2 G G C T G C G G C G 0

17 実施例 1 (D-gR の設計と機能評価 ) o guide-r G G 200 C T C G G C G GFP R hdr2 100 編集率 ( 反応時間 1 時間 ) ピーク高の比 (G/(+G)) から算出 ntisense R hdr2 G G C T G C G G C G % editing D-gR hdr2 G G C T G C G G C G 0 guide (-) antisense D-guide GFP_200 (reaction condition) 12.5 nm recombinat DR2, 5 nm guide R -target R complex, 20 mm HEPES-KH (ph 7.5),2 mm MgCl 2, 150 mm acl, 0.5 mm DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol reaction duration: 2 h 標的部位特異的な変異導入に成功 ( 変異導入効率 : 約 80%) 17

18 18 改変型 Dg-R(Dg-rR) の設計 3 -antisense 5 5 -antisense GFP mr 3 CUGGUGGGCUCG 200 UGCCCCCUGGCU CGGCGUGCGUGCUU GFP mr GCC C Dg-GFP_ UGCCCCCUGGCU CGGCGUGCGUGCUU CG GCCGCCGUCUG C Dg-rGFP_

19 実施例 2 (Dg-rGFP_200 の設計と機能評価 ) 100 Editing efficiency (vs time) guide R (-) D-guide GFPr_200 % editing D-gR (5 -S) D-gR (3 -S) Time (min) (reaction condition) 12.5 nm recombinat DR2, 5 nm guide R -target R complex, 20 mm HEPES-KH (ph 7.5),2 mm MgCl 2, 150 mm acl, 0.5 mm DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol 変異導入効率の向上に成功 ( 変異導入効率 : 約 100%) 19

実施例 3 (D-gR を用いた細胞内 R 変異導入 ) Reporter mr (GFP

I Trp G UG MV promoter MV promoter H1 promoter

20 実施例 3 (D-gR を用いた細胞内 R 変異導入 ) Reporter mr (GFP W58X) Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PS, 110, (2013) UG U 173 stop G UG Dg-GFP_173 UG U 173 I Trp G UG MV promoter MV promoter H1 promoter pcd3.1_ GFP W58X pcd3.1_ DR2 psuper_d-gr Transfection GFP W58X hdr2 D-gR HEK293 cell 20

21 実施例３ (D-gRを用いた細胞内R変異導入) Phase GFP Merge (Transfected plasmid) GFP WT Dg-rGFP-173 DR2 GFP W58X (-) DR2 GFP W58X 5 -S DR2 GFP W58X Dg-rGFP-173 DR2 21

22 新技術の特徴従来技術との比較ゲノム編集技術とは異なる原理の遺伝子改変技術 ( 一過的な変異導入が可能 off-target のリスクが低 ) タンパク質因子を必要とする従来技術と比べ本技術はガイド R のみで目的 R 変異導入を達成できる ( 使いやすい低コスト ) 標的部位の設定は単純な相補配列で設定できる ( 汎用性が高いカセットベクター等の構築も可能 ) 本 R 変異導入法はタンパク質機能制御に応用できるため多くの生体内プロセスの制御に適用できる ( 創薬基盤技術への展開 ) 22

23 23 想定される用途本技術 (R 変異導入 ) の特徴はゲノム情報を改変することなく遺伝情報 ( タンパク質機能情報 ) を変換できることにある一過的遺伝子変異導入ツール ( 基礎研究用 ) 新たな創薬基盤技術核酸創薬 ( タンパク質リン酸化阻害剤など )

24 24 実用化に向けた課題現在 in vitro ( 培養細胞内 ) における変異導入が可能一方一過的な R 変異導入により細胞プロセスを制御できるかを明らかにする必要がある生物個体での実施が課題アプタマー sir 等を用いた核酸創薬と同様の問題 ( コスト薬効ドラッグデリバリーなど ) に直面する逆にこれら技術に適用されている化学修飾や導入方法を応用し実用化に向けて編集ガイド R の最小化及び高機能化する必要がある

25 25 企業への期待 R 変異導入技術を用いた創薬は未だ例が無い R 変異導入技術の確立及びその応用研究に興味を持って頂ける企業特に核酸創薬及び生物個体における機能評価技術を持つ企業との共同研究を希望また核酸医薬品を開発中の企業遺伝子治療への展開を考えている企業には本技術の導入が有効と思われる

26 26 本技術に関する知的財産権 ( 発明の名称 ) 部位特異的 R 変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイド R ならびに標的 R- 標的編集ガイド R 複合体出願番号 ( 国内 ) : 特願出願番号 ( 国際 ) :PCT/JP2016/ 出願人 : 福岡大学発明者 : 福田将虎

27 27 問い合わせ先福岡大学研究推進部産学官連携センター担当コーディネーター芳賀慶一郎 TEL ( 内線 2809) FX

ナノの技術をバイオに応用

ナノの技術をバイオに応用本日までお試し期間なので出席は取りません現代生物学概論 2 遺伝子 ( プログラム ) と蛋白質 ( ナノマシン ) 先進理工学科化学生物学研究室准教授生体機能システムコース瀧真清 1 本日の概要 : 蛋白質生合成の全スキーム D から蛋白質への情報の流れアミノ酸から蛋白質への物質の流れ転写 D 本日は詳細は省略アミノアシル tr 合成酵素 (RS) 翻訳 mr コドンーアンチコドンの対合

(12・6No.3)予稿集資料（福岡大学 福田）-1

(12・6No.3)予稿集資料（福岡大学　福田）-1