HPL による USP 関連物質分析条件の UPL 分析への移管と開発 No. 720001866J はじめに 本アプリケーションでは HPL によるミルタザピンの純度分析 (USP) の Waters QUITY UPL システムへの移管についてご紹介します このシステムは 小さな粒子径 (1.7μm) の QUITY UPL H カラムを用い 伝統的な HPL のパフォーマンスを凌駕するものです このアプリケーションノートでは 分析法移管に加えてバリデーション結果の一部及び二つの方法によるアプローチの比較についてもご紹介します 分析法の移管は 移動相組成 カラム温度及び検出パラメータは変更せず その他のパラメータ 流量 注入量 分析時間 グラジエント勾配 ( グラジエント使用時 ) について 数学的に新しいカラムの内径及び長さとスケールに合わせて行われました このアプローチは シンプルでしばしばシステム適合性の要求事項を維持しながら 重要な成分同士の分離度を維持または改善するものです そして 感度の向上及び分析時間の短縮が達成されています このような分析法の移管において再バリデーションを実施する際 QUITY UPL によって得られるベネフィットを最大限に活かすため 分析法の調整を要する場合があります 様々な背景 要求によって 分離分析法が完全に再開発される場合においても 全てのクロマトグラフィパラメータが利用可能であり 既存の方法が達成できなかった 頑健性向上 分析時間短縮 重要な分析対象物の分離度向上 溶媒消費量削減といった様々な項目に対応しながら 分析法を改善することが可能です 新しく開発された方法では バリデーションを行うことが必要です しかしながら より早く より頑健性の向上した分析法と共に 操作の簡単な mpower TM 2 分析法バリデーションマネージャを利用することによって 全体のバリデーションプロセスは一元化され短時間で終了することが可能です ミルタザピン (1,2,3,4,10,14b-hexahydro-2- methylpyrazino[2,1-a]-pyrido[2,3-c][2]benzazepine( 図 1)) は抗うつ薬として利用されています 実験と結果 試料シグマ - アルドリッチ社 (St. Louis, MO) 製テトラメチルアンモニウム水酸化物ペンタ水和物 Fisher Scientific 社 (Fair Lawn, NJ) 製アセトニトリル メタノール及びテトラヒドロフラン Fluka 社 (St. Louis, MO) 製炭酸水素アンモニウム J.T. aker 社 (Phillipsburg, NJ) 製リン酸 水は MilliQ Gradient 10 システム (Millipore, illerica, M) で精製 ミルタザピン及び 5 つの類縁物質 (~ で表示 ) は 製造販売会社より購入 図 1. ミルタザピン
HPL 装置及び実験条件 HPLは 2487UV 検出器を装備したlliance 2695セパレーションモジュール カラムはUSPによるL1カテゴリー対応カラムとして 5μm, 4.6x250 mm Xridge TM 18 カラムを使用 USPによる初期条件は カラム温度 40 注入量 10μL 移動相は テトラメチルアンモニウム水酸化物緩衝液 ( ph7.4): アセトニトリル : メタノール : テトラヒドロフラン =65:15:12.5:7.5 流量 1.5mL/minのアイソクラティック 検出波長は240nm 試料は全て アセトニトリル: 水 =1:1で希釈 HPL 分析法 (USP) HPL を用いた分析法を確認するための合否判定基準は 1) 全ての化合物の分離度が 2.0 以上 2) シンメトリー係数 USP テーリングファクターとして 2.0 以下 3)3 回注入した場合の相対標準偏差 (%RS) が 2.0% 以下 合否判定基準を満たすよう USP の分析法から移動相の有機溶媒含量を若干変更し (35 から 33% へ ) HPL によるミルタザピン及び 5 つの類縁物質を含む標準溶液の分析を行いました ( 図 2) 及び のピーク間で得られた分離度が 3.7 と最小で 全ての化合物が良く分離されました ピークシンメトリーも合否判定基準 (<2.0) を満たしました 3 回の繰り返し注入における面積値の %RS も 合否判定基準 (2.0%) を満たしました ( 表 1) UPL 装置及び実験条件 QUITYT UPL は バイナリーソルベントマネージャ ( SM) サンプルマネージャ ( SM) QUITY UPL Tunable UV(TUV) 検出器で構成 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを使用 装置は全てmpower 2ソフトウェアによって制御され データ解析も同ソフトウェアを用いて実施 0.128 0.096 2.18 min 0.186 mg/ml 3.09 min 0.569 mg/ml 5.69 min 0.190 mg/ml 6.53 min 0.188 mg/ml 34.85 min 0.187 mg/ml Mirt.* 26.68 min 0.306 mg/ml U 0.064 0.032 Mirt. 0.000 分 0.00 6.00 12.00 18.00 24.00 30.00 36.00 42.00 48.00 54.00 60.00 *Mirt. = ミルタザピン 図 2. USP 条件を用いた HPL による分析例 (10μL 注入 )
HPL による分析法 (USP) を QUITY UPL システムへ移管 HPLを利用した分析法をQUITY UPL システムへと移管いたしました USP L1カテゴリーに対応するため 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを選択しました HPLでの分析スケールからUPL カラムへの分析法移管では 分析時間 流速 注入量を変更いたしました HPLでの分析時間は ミルタザピンの溶出時間の約 2 倍の60 分に設定されていました 計算の結果 QUITY UPL システムを用いた分析時間は 10 分と算出されました USP の HPL による分析では流量は 1.5 ml/min でしたが UPL では 0.30 ml/min に 注入量は HPL による分析での 10μL から 0.40μL へと変更されました 試し打ちを行って検討した結果 非常に極性の高い化合物 ではピークに影響がでたため 0.10μL から試験を開始することと致しました HPL から UPL への移管に際し 利用された計算式を表 2 にまとめました パラメータ ミルタザピン 平均保持時間分 2.18 ± 0.18% 3.09 ± 0.23% 5.67 ± 0.50% 6.50 ± 0.46% 26.5 ± 0.54% 34.7 ± 0.40% 相対保持時間 0.08 0.12 0.22 0.25 1.0 1.31 USP Resolution N 4.74 ± 1.29% 14.3 ± 1.13% 3.70 ± 1.62% 37.3 ± 0.54% 8.16 ± 0.64% USP Tailing 0.67 ± 6.0% 1.36 ± 1.32% 1.20 ± 0.58% 1.21 ± 0.25% 1.23 ± 0.98% 1.49 ± 0.34% %RS( 面積 ) 0.57 1.98 0.66 0.76 0.62 0.23 表 1 USP 条件を用いた HPL による分析結果 [n=3] パラメータ 分析時間 計算式 UPL Run Time = HPL Run Time x UPL olumn Length HPL olumn Length 流量 UPL Flow Rate = HPL Flow Rate x (UPL olumn iameter) 2 (HPL olumn iameter) 2 注入量 UPL Injection Volume = HPL Injection Volume x UPL olumn Volume (π r 2 L) HPL olumn Volume (π r 2 L) 表 2 アイソクラティック分離における分析法移管のための基本的な計算式
図 3 UPL への分析法移管によって得られたクロマトグラム [0.1μL 注入 ] QUITY UPL による分析 ミルタザピンの HPL による分析からの移管によって 溶出順序または全体的なクロマトグラフィックプロファイルには影響を与えることはありませんでした ( 図 3) 分離度 テーリングファクター及び再現性については 3 回の注入で得られた面積値の %RS を見た場合 HPL 分析で設定された基準値を全て満足する結果が得られました ( 表 3) 及び 及び ピークの間の分離度は 2.0 以上でした 各ピークに対するテーリングファクターは 1.6 以下で 3 回注入に対する面積値の %RS は全て 1% 以下でした 以上より HPL による分析法から UPL への分析法の直接移管が完了し 全体的なパフォーマンスについても HPL で得られたものと同等の結果が得られました パラメータ ミルタザピン 平均保持時間分 0.491 0.631 1.11 1.28 4.80 5.39 相対保持時間 0.10 0.13 0.23 0.27 1.0 1.1 USP Resolution N 2.45 ±0.57% 7.90 ±0.84% 2.62 ±0.23% 28.2 ±0.48% 3.05 ±0.10% USP Tailing 1.36 ±0.05% 1.60 ±0.63% 1.24 ±0.16% 1.22 ±0.16% 1.03 ± 0.033% 1.07 ±0.28% %RS ( 面積 ) 0.67 0.74 0.58 0.65 0.88 0.60 表 3 UPL への分析法移管によって得られた結果 [n=3]
USP の HPL による分析法は 最小限の労力で QUITY UPL システムへと移管されました HPL による分析法と UPL による分析法の各パラメータの比較を表 4 に示します このシンプルな分析法移管によって生み出された分析法は 設定された基準値を満たすものでした ( 表 3) UPL による分析法によって USP のシステム適合性における要求を満たしつつ 1 分析あたり 50 分短縮することができました 更に 注入量は 100 分の 1 の量で また移動相消費量も 97% 削減されたことから 廃棄費用を含めコスト削減を達成することができました 分析法の改良 HPL から UPL への分析法移管は USP のシステム適合性の要求を満たしている一方 複雑な移動相 次善策である流量 弱い保持 ( 早い溶出時間 ) 化合物 及び の分離度等の要因を考慮すると 分析法を改良できる余地がありました そこで 移管された分析法についてバリデートする前に 分析法の改良を開始いたしました この検討の主要な目的は USP の HPL による分析法で求められるシステム適合性を満たしながら 分析時間を短縮し よりシンプルで頑健性の高い分析法を開発することでした 分析法検討のアプローチでは ミルタザピンやその類縁物質といった塩基物質が高い ph の移動相で効果的に分離することを利用いたしました パラメータカラムカラム温度移動相分析時間ミルタザピン保持時間流量注入量 USP HPL Method 4.6 x 250 mm, 5 μm Xridge 18 40 : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic, 67% :33% 60 min 26.7 min 1.5 ml/min 10 μl Transferred QUITY UPL Method 2.1 x 50 mm, 1.7 μm QUITY UPL H 18 40 : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic, 67% :33% 10 min 4.8 min 0.30 ml/min 0.1 μl 表 4 USP の HPL 分析法と移管された UPL による分析パラメータの比較
QUITY UPL Hカラムはこれらの高いpH 環境下で使用することが可能です 改良された分析法が必要に応じて MS( 質量分析計 ) での分析を行えるように 炭酸水素アンモニウム緩衝液を選択しました ミルタザピン及びその類縁物質 ( 水 : アセトニトリル =1:1 で約 1mg/mL に希釈 ) を グラジエント条件として 10mM の炭酸水素アンモニウム緩衝液 (ph10.5) とアセトニトリルを用い 1.7μm, 2.1x50 mm QUITY UPL H 18 カラムを選択して分析いたしました 注入量は 1.0μL で流量は 0.65μL/min です グラジエント条件として 5% から 85% までアセトニトリル含量を直線的に変化させ 5 回から 10 回の予備分析を行いました 検討の結果 ミルタザピン及びその類縁物質に対して 流量を 1.2mL/min とし 分析時間 5 分という分析法を設定することができました ( 表 5) また グラジエントの初期条件及びスロープを微調整することにより 特にミルタザピンと化合物 の分離度を更に改善することができました クロマトグラムを図 4 に示します 再設定された QUITY UPL の分析法は USP の HPL 分析法及びシンプルに移管しただけの UPL 分析法と比較し 同等かそれ以上のパフォーマンスを示しています ( 表 6) 再設定された分析法については 直線性 精度 定量限界 (LOQ) の各項目に対して 分析法バリデーションを実施いたしました 化合物 については 0.05% から 0.5% までの範囲で直線性が得られ ミルタザピンを含むそれ以外の化合物については 0.01% から 0.5% までの範囲で直線性が得られました 相関係数 r 2 については 全ての化合物について 0.99 以上の値が得られています USP の不純物限度値 (0.10%) に対して 80,100,120% 濃度で全ての化合物がブランク試料に添加され 評価されました その結果 全ての化合物に対して 添加回収率は 99±7% 繰り返しの分析における面積値の %RS は 2.0% 以下と 良好な結果が得られました 全ての化合物対して LOQ は USP の不純物限度値 0.1% よりも低い値を示しました mpower 2 分析法バリデーションマネージャといったソフトウェアを用いることによって これらのプロセスは効率的に短時間で終了することが可能です パラメータカラムカラム温度移動相分析時間ミルタザピン保持時間流量検出注入量 Original USP HPL Method 4.6 x 250 mm, 5 μm Xridge 18 40 : Tetramethyl ammonium hydroxide pentahydrate, ph 7.4 : cetonitrile:methanol:thf (43:36:21) Isocratic 67% :33% 60 min 26.7 min 1.5 ml/min 240 nm at 5 pps 10 μl Newly eveloped QUITY UPL Method 2.1 x 50 mm, 1.7 μm QUITY H 18 40 : 10 mm mmonium bicarbonate, ph 10.5 : cetonitrile Gradient 5 37% over 4.5 min 4.6 min. 4.15 min 1.2 ml/min 240 nm at 20 pps 1 μl 表 5 シンプルに移管された UPL 分析法及び改良された UPL 分析法のパラメータ比較
0.28 0.21 0.81 min 0.159 mg/ml 1.36 min 0.451 mg/ml 2.34 min 0.151 mg/ml 2.59 min 0.150 mg/ml 3.99 min 0.075 mg/ml Mirt 4.15min 0.245 mg/ml Mirt U 0.14 0.07 0.00 0.00 0.46 0.92 1.38 1.84 2.30 2.76 3.22 3.68 4.14 4.60 分 図 4 改良された UPL 分析法によるクロマトグラム パラメータ ミルタザピン 平均保持時間 0.81 ±0.12% 1.36 ±0.18% 2.34 ±0.11% 2.59 ±0.11% 3.99 ±0.06% 4.15 ±0.07% 相対保持時間 0.20 0.33 0.56 0.62 0.96 1.0 USP Resolution N 17.1 ±0.47% 29.9 ±0.05% 7.45 ±0.01% 36.3 ±0.12% 3.78 ±0.64% USP Tailing 1.60 ±0.01% 1.37 ±0.80% 1.01 ±0.02% 1.06 ±0.00% 1.02 ±0.09% 1.19 ±0.20% %RS ( 面積 ) 0.10 0.19 0.26 0.27 1.44 0.50 表 6 改良された UPL 分析法による結果 [n=3]
まとめ 本アプリケーションノートでは ミルタザピン及びその類縁物質に関する USP の HPL 分析法を まず UPL 分析法へと移管いたしました このプロセスによって得られた UPL 分析法においても十分なデータを得ることができましたが 更に検討を重ね改良された UPL 分析法を開発することに成功いたしました 表 6 に示すように 改良された UPL 分析法はより短時間で分析を終了することが出来 ミルタザピンとその類縁物質について また類縁物質同士について更に良い分離度を得ることができました 幾つかの項目について実施された分析法バリデーションの結果も良好でした 4.5 分という分析時間は HPL による分析法 (60 分 ) と比較し また 単純に移管された UPL 分析法 (10 分 ) と比較しても 2 倍早いものでした 新しい分析法をバリデートする時間及び労力のために多くの研究者は 分析法を再検討することをためらいがちです しかし UPL 及び mpower 2 分析法バリデーションマネージャがもたらす大幅な分析時間の短縮化によって 分析法バリデーションはかつてないほど簡単で時間を必要としないものとなりました まず第一に 既存の分析法を UltraPerformance L へと分析法の移管を検討することが重要ですが この新しい技術を最大限に活かすために分析法を更に検討することも重要です 分離能の向上 分析時間の短縮 そしてより頑健性の増した分析法は 上市に至る時間の短縮 全体の開発コスト削減に対して有効です