分子病理診断: 進化し続けるバイオマーカー

第 27 回がん臨床研究フォーラム肺がん診療最前線 : 過去現在そして未来は? 平成 29 年 6 月 9 日 ( 金 ) 国立がん研究センター内国際研究交流会館分子病理診断 : 進化し続けるバイオマーカー谷田部恭 (YATABE, Yasushi) 愛知県がんセンター遺伝子病理診断部

肺癌治療の変遷 Nat Rev Clin Oncol. 2015 Sep;12(9):511-26

肺癌診断の一例診断 : non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma 2 本のCTガイド下針生検組織標本でおよそ30% に分化傾向の乏しい非小細胞肺癌が認められます形態学的には組織亜型の判別は困難ですが免疫染色ではTTF-1 陽性 p40 陰性を示し生物学的には腺癌の特徴を持ちます遺伝子検査の結果は以下のとおりで免疫チェックポイント阻害剤に対する効果が期待できます 1.EGFR 遺伝子 : Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません 2.K-RAS 遺伝子 : Codon 12に点突然変異が検出されました 3.HER2 遺伝子 : Exon 20 insは検出されません 4.BRAF 遺伝子 : V600Eは検出されません 5.ALK 遺伝子 : IHCで確認しましたが陰性です 6.ROS1 遺伝子 :IHCで確認しましたが弱陽性です 7.Tumor Proportion Score (TPS): 70% PD-L1: IHC 22C3にて陽性 ( 高発現 ) と判定します

肺癌診断の一例診断 : non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma 小細胞癌と非小細胞癌の区別 2 本のCTガイド下針生検組織標本でおよそ30% に分化傾向の乏しい非小細胞肺癌が認められます形態学的には組織亜型の判別は困難ですが免疫染色ではTTF-1 陽性 p40 陰性を示し生物学的には腺癌の特徴を持ちます遺伝子検査の結果は以下のとおりで免疫チェックポイント阻害剤に対する効果が期待できます 1.EGFR 遺伝子 : Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません 2.K-RAS 遺伝子 : Codon 12に点突然変異が検出されました 3.HER2 遺伝子 : Exon 20 insは検出されません 4.BRAF 遺伝子 : V600Eは検出されません 5.ALK 遺伝子 : IHCで確認しましたが陰性です 6.ROS1 遺伝子 :IHCで確認しましたが弱陽性です 7.Tumor Proportion Score (TPS): 70% PD-L1: IHC 22C3にて陽性 ( 高発現 ) と判定します

肺癌診断の一例診断 : non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma 2 本のCTガイド下針生検組織標本でおよそ30% に分化傾向の乏しい非小細胞肺癌が認められます形態学的には組織亜型の判別は困難ですが免疫染色ではTTF-1 陽性 p40 陰性を示し生物学的には腺癌の特徴を持ちます腺癌と扁平上皮癌の区別遺伝子検査の結果は以下のとおりで免疫チェックポイント阻害剤に対する効果が期待できます 1.EGFR 遺伝子 : Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません 2.K-RAS 遺伝子 : Codon 12に点突然変異が検出されました 3.HER2 遺伝子 : Exon 20 insは検出されません 4.BRAF 遺伝子 : V600Eは検出されません 5.ALK 遺伝子 : IHCで確認しましたが陰性です 6.ROS1 遺伝子 :IHCで確認しましたが弱陽性です 7.Tumor Proportion Score (TPS): 70% PD-L1: IHC 22C3にて陽性 ( 高発現 ) と判定します

腺癌と扁平上皮癌を区別する理由 1. 生物学的に異なる腫瘍 2. 腫瘍の特性による薬剤効果の違いペメトレキセド : 腺癌に有効性が示されているベバシズマブ : 有害事象が扁平上皮癌では高いニボルマブ : 有効性の傾向が異なる

実際に分けようとすると高分化腫瘍かどうかが難しい分化の傾向は明らか腫瘍かどうかは明らか分化の傾向は不明低分化

実際に分けようとすると高分化腫瘍かどうかが難しい分化の傾向は明らか

実際に分けようとすると高分化腫瘍かどうかが難しい分化の傾向は明らか腫瘍かどうかは明らか分化の傾向は不明低分化

免疫染色による判別 63 歳男性喫煙者末梢の 4cm 大結節

免疫染色による判別 TTF-1 p40

生物学的特徴に基づいた WHO 分類腺癌 Lepidic Acinar Papillary Micropapillary Solid これまでは大細胞癌に含まれていた腫瘍も免疫染色で TTF-1 陽性であれば充実性腺癌に入れられる扁平上皮癌 Keratinizing Non-keratinizing Basaloid これまでは大細胞癌に含まれていた腫瘍も免疫染色で p40 陽性であれば非角化型扁平上皮癌となる

肺癌における遺伝子検査

IV 期非小細胞肺癌 EGFR 検査 ALK 検査 ROS1 検査 PD-L1 IHC 22C3 EGFR 変異陽性 ALK 融合遺伝子陽性 ROS1 融合遺伝子陽性 TPS 50% TPS 1-49% TPS <1% 遺伝子異常に応じた分子標的治療を考慮ペムブロリズマブを考慮化学療法を考慮化学療法を考慮一次治療後増悪扁平上皮癌非扁平上皮癌 *1 *2 ペムブロリズマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブを除くその他の治療を考慮 *1 PD-L1 IHC 28-8 を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが IHC 28-8 による再検査が困難な場合には PD-L1 IHC 22C3 の結果で代用することも可能 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある日本肺癌学会 PD-L1 検査の手引より

IV 期非小細胞肺癌頻度 30% 4-5% 1% ~30% EGFR 検査 ALK 検査 ROS1 検査 PD-L1 IHC 22C3 DNA 抽出免疫染色免疫染色 22C3 免疫染色 PCR 解析 FISH 解析 RT-PCR 解析 28-8 免疫染色

EGFR 変異検査 PCR based allele-specific detection NGS 法 (Ion Torrent)

IV 期非小細胞肺癌 EGFR 検査 ALK 検査 ROS1 検査 PD-L1 IHC 22C3 EGFR 変異陽性 ALK 融合遺伝子陽性 ROS1 融合遺伝子陽性 TPS 50% TPS 1-49% TPS <1% 遺伝子異常に応じた分子標的治療を考慮ペムブロリズマブを考慮化学療法を考慮化学療法を考慮一次治療後増悪扁平上皮癌非扁平上皮癌耐性変異陽性 *1 *2 オシメルチニブ治療を考慮ペムブロリズマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブを除くその他の治療を考慮 *1 PD-L1 IHC 28-8 を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが IHC 28-8 による再検査が困難な場合には PD-L1 IHC 22C3 の結果で代用することも可能 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある日本肺癌学会 PD-L1 検査の手引より

EGFR-TKI 耐性変異 Nat Rev Clin Oncol 11:473-81, 2014

再生検による耐性変異検査 Nosaki K et al. Lung Cancer 101 (2016) 1 8

再生検の実際 Initial Biopsy Rebiopsy

リキッドバイオプシーとは? Liquid biopsy is defined as non-invasive blood tests that detect the features of tumor cells that are shed into the blood from the primary tumour and from metastatic sites. 1. Circulating tumour cells (CTCs) 2. Circulating free/fragments of tumor DNA (cfdna) 血液中に含まれる腫瘍を基にした検査

cfdna Crowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472 484 (2013);

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2015 Jan;24(1):206-12. Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Qiu M 1, Wang J 2, Xu Y 3, Ding X 3, Li M 2, Jiang F 2, Xu L 4, Yin R 4.

cfdna による EGFR の実際愛知県がセンター 2017.02-05 まとめ EGFR T790T T790M Wild-type 21 0 Mutation 21 9 58.8% で EGFR 変異が検出されたそれらはすべて組織での変異パターンと一致したそのうちの 30% で T790M が検出された

ALK 融合遺伝子検査 EGFR/KRAS 変異検査肺癌検体 RNA 抽出可能 ( 細胞診新鮮凍結組織など ) RT-PCR IHC 陰性陽性陰性陽性臨床的 (40 歳以下の患者など ) 形態学的 ( 粘液産生を伴う篩状増生パターンを示す腺癌や印環細胞癌 TTF-1 陽性の粘液産生性腺癌 ) FISH 迅速な治療開始を要する場合に限り * 精度管理された IHC 法での結果 IHC 偽陽性の可能性を十分に説明 FISH による確認が必要陰性陽性 *ALK 融合遺伝子陽性肺癌患者には進行が非常に速く迅速な治療薬開始が必要と判断される患者も含まれるこのような医学的判断がなされた場合には IHC 検査偽陽性の可能性につき患者家族に十分説明の上 FISH 検査結果を待たずに ALK 阻害薬を投与することも選択肢となるであろうこの際は十分な精度管理がなされた IHC 法である確認 FISH 検査のオーダーと後日の結果確認が必要である ALK 阻害薬日本肺癌学会 ALK 検査の手引より

IHC ( 免疫染色免疫組織化学染色 ) 組織内抗原抗原賦活化一次抗体組織内抗原への一次抗体反応 DAB DAB DAB 二次ポリマー抗体の反応 DAB 酵素反応による発色

肺癌における ALK の免疫染色 Clone ALK1 Clone D5F3

ALK のタンパク発現正常肺組織 ALK 陽性肺癌

ALK 肺癌

ALK break apart FISH Break apart FISH No fusion Fusion positive ALK gene Probe Probe

Standard FISH procedure < 標本の下準備 > 1. 脱パラフィン 2. 洗浄 3. 加熱処理 (2xSSCに入れ10 分間電子レンジで加熱 ) 4. ペプシンによるタンパク質分解 5.PBSで洗浄アルコールシリーズにより脱水乾燥 < ハイブリダイゼーション > 6. 切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける 7.80 90 のホットプレート上で 10 分間加熱し変性処理 8.37 で overnight ハイブリダイズ < 洗浄検出 > 9.2 SSC 中 5 分浸漬しカバーグラスを静かにはずす 10.50% ホルムアミドで余分なプローブを除去 11.DAPI 染色後マウント 12. 蛍光観察

Updated CAP/IASLC/AMP guideline (Draft) Recommendation: Physicians should use ROS1 molecular or cytogenetic testing on all lung adenocarcinoma patients, irrespective of clinical characteristics, when selecting patients for ROS1-targeted therapy. Expert Consensus Opinion: Physicians may use ROS1 IHC as a screening test in lung adenocarcinoma patients; however, positive ROS1 IHC results should be confirmed by a molecular or cytogenetic method. Systematic review 1. A sensitivity of ROS1 IHC was 100% relative to FISH or RT-PCR, so tumors lacking ROS1 expression can be safely interpreted as lacking a ROS1 fusion. 2. The specificity of ROS1 IHC is more variable, ranging from 92 to 100% with different methods and interpretive cutoffs.

ROS1 IHC

ROS1 IHC の問題点 ROS1 最構成は 1% 程度の頻度の低い異常であり一施設のみで十分な陽性コントロールを集めることは困難論文にはいくつかの方法が記載されているが実際その通りにやっても微妙なところが異なりうまくいかない ( ように思える <- 症例が少なく確信が持てない ) どの程度の染色感度を持てば満足な感度をもって検出されているかわからない

免疫チェックポイント阻害剤

免疫チェックポイント阻害剤 IASLC PD-L1 Atlas より

免疫チェックポイント阻害剤の効果予測検査 IASLC PD-L1 Atlas より

本邦で承認されている免疫チェックポイント阻害剤ニボルマブペムブロリズマブ腫瘍細胞の PD-L1 の発現によらない * 扁平上皮癌腺癌では効能に差がある EGFR/ALK 陽性例にも二次治療にのみ PD-L1 陽性の EGFR/ALK 陰性例に ( 一次治療 ) 一次治療も二次治療も * ただし保険償還では問題を生じることがある

免疫チェックポイント阻害剤にける IHC 治療ライン初回治療二次治療以降薬剤ペムブロリズマブペムブロリズマブニボルマブ PD-L1 免疫染色染色キット 22C3 22C3 28-8 染色の必要性必須必須必要 * ( コンパニオン診断 ) ( コンパニオン診断 ) 適応判断基準値 50% 1% 1% EGFR ALK 陽性肺癌の有効性有効性を示すデータがない遺伝子変化に関係ない遺伝子変化に関係ない組織型有効性に差はない有効性に差はない組織型により有効性の傾向が異なる * 必須ではないが適正使用推進ガイドラインで施行が求められている

PD-L1 IHC 評価方法について 1. 陽性細胞は腫瘍細胞のみ ( リンパ球やマクロファージの陽性像は考慮しない ) 少なくとも100 個の腫瘍細胞で評価する細胞膜陽性所見を陽性とする部分的でもよい 1+ 程度の弱い染色でもよい 2. 腫瘍全体での陽性腫瘍細胞の割合を求める = Tumor proportion score (TPS) 3. TPS によって以下の臨床的に意味のある分類に分ける High expression 50% Low expression 1-49% No expression <1%

PD-L1 22-8 IHC の実際

PD-L1 22C3 IHC の実際

免疫チェックポイント阻害剤の効果予測検査 IASLC PD-L1 Atlas より

ハーモナイゼーション研究 BluePrint German study NCCNS study Yale study AZ study Reference (PMID) 27913228 27389313 28278348 27541827 28073845 Study body FDA, AACR, Parametrical companies, IASLC German pathologists supported by BMS, Roche and AstraZeneca NCCN sponsored BMS funding Institutional study AstraZeneca directed N= 39 15 training and 15 90 30 493 validating Histotypes N.A. 18 ADC and 12 SQC N.A. N.A. 270 non-sqc, 210 SQC, 13 ASC Sample types Mostly surgical but few biopsies NA Surgical samples Tissue microarray from Surgical N.A. Antibody clones 22C3, 28-8, SP142, and SP263 22C3, 28-8, SP142, SP263 and E1L3N 22C3, 28-8, SP142, and E1L3N samples 22C3, 28-8, SP142, SP263, 904.9A11, and E1L3N 22C3, 28-8, SP263 IHC Platform Lab developed tests Following the manufacturers instructions, except E1L3N Following the manufacturers instructions, except SP142 and E1L3N Lab developed tests Ventana and Dako Number of pathologists 3 9 16 Quantitation by image analysis 2 Concordance of the clones comparable among 22C3, 28-8, and SP263 assays Staining proportion similar in 22C3 and 28-8, less in, and more in SP263 Detection of less tumor cells in SP142 and 22C3 than 28-8 and E1L3N High concordance across the antibodies High concordance across the antibodies (>0.9) Intra-observer variation N.A. N.A. for tumor cells κ=0.6 to 0.8 k=0.88 to 0.86 75.9%-97.5% (2 tier cut-off) for immune cells κ<0.2 k=0.17 to 0.23

IV 期非小細胞肺癌 EGFR 検査 ALK 検査 ROS1 検査 PD-L1 IHC 22C3 EGFR 変異陽性 ALK 融合遺伝子陽性 ROS1 融合遺伝子陽性 TPS 50% TPS 1-49% TPS <1% 遺伝子異常に応じた分子標的治療を考慮ペムブロリズマブを考慮化学療法を考慮化学療法を考慮一次治療後増悪扁平上皮癌非扁平上皮癌 *1 *2 ペムブロリズマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブ治療やその他の治療法を考慮ニボルマブを除くその他の治療を考慮 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが IHC 28-8による再検査が困難な場合には PD-L1 IHC 22C3の結果で代用することも可能 ( 最適仕様推進ガイドラインより ) *1 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが IHC 28-8による再検査が困難な場合には PD-L1 IHC 22C3の結果で代用することも可能 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある

まとめ現在肺癌治療に関連する数多くの新規薬剤が開発され 2002 年に発売された分子標的薬ゲフィチニブ ( イレッサ ) に始まり現在では免疫チェックポイント阻害剤まで多岐にわたり使用されているこれらの薬剤の多くは治療効果を予測するバイオマーカーによって腫瘍の特性 ( 個性 ) に合わせた腫瘍の選択が必要となっている組織診断遺伝子テストについて適切な理解を得るとともに病理診断位を含めたチーム医療が望まれる