エピジェノミクス解析編 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 株式会社キアゲンアプライドアドバンストゲノミクス宮本真理, PhD 1
アジェンダ ChIP-seq 解析 Transcription Factor ChIP-seq Histone ChIP-seq Bisulfite-seq 解析 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 2
NGS Applications ゲノミクス Genome assembly (Gx only) Resequence トランスクリプトミクス RNA-seq, Expression analysis Small RNA エピジェノミクス ChIP-seq Bisulfite seq 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 3
様々なプラグインによるエピジェノミクス強化 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 4
ChIP-seq 101 サンプル準備 Mardis, E. R., & Mardis, E. R. (2007). ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods, 4(8), 613. doi:10.1038/nmeth0807-613 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 5
ChIP-seq Basic method Park, P., ChIP--seq: advantages and challenges of a maturing technology Nature Reviews Genetics, 2009, 10, 669-680 Pepke, S.; Wold, B. & Mortazavi, A., Computation for ChIP-seq and RNA-seq studies Nature methods, 2009, 6, S22-S32 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 6
Transcription Factor ChIP-seq ChIP インポート Control インポート クオリティチェック クオリティチェック マッピング マッピング ピークコール アノテーション 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 7
Transcription Factor ChIP-seq 解析フロー インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 8
ChIP-seq 解析パイプライン インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション シーケンサーごとのインポーター ゲノムやアノテーション情報もインターフェースからインポート 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 9
ChIP-seq 解析パイプライン インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション 様々なクオリティレポート クオリティでのトリミングやアダプターのトリミングが可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 10
ChIP-seq 解析パイプライン インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション リードの Forward Reverse のカバレッジ分布 非常に軽いブラウザ マッピングのカバレッジに関するレポート 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 11
ChIP-seq 解析パイプライン インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション ピークの山の表示 テーブルには ピークの位置情報や長さ p-value など テーブルに含まれる情報はフィルタリングに利用可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 12
ChIP-seq ピークコール詳細 Quality check and create report Peak Shape Filter 作成 Peak Shape Score 計算 p-value 計算 ピークコール 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 13
ChIP-seq クオリティチェック (Enrichment check) Cross-correlation ( 相互相関関数 ):2 つのベクトルの類似度を計算するもの ChIP-seq では 免疫沈降による濃縮がうまく行われていれば (-) 鎖側にマップされるリードを k 塩基シフトさせたとき ある k においてピークが見られると考えられそれを濃縮のクオリティの目安とする Landt, S. G., Marinov, G. K., Kundaje, A., & Frazer, K. A. (2012). ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modencode consortia the genome, 1813 1831. doi:10.1101/gr.136184.111 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 14
ChIP-seq クオリティチェック (Enrichment check) Cross-correlation で見た濃縮がうまく行っている例 うまく行ってない例 Landt, S. G., Marinov, G. K., Kundaje, A., & Frazer, K. A. (2012). ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modencode consortia the genome, 1813 1831. doi:10.1101/gr.136184.111 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 15
アルゴリズム詳説と比較 アルゴリズム比較のホワイトペーパー Three data sets are used for validation, MAX, NRSF and SRF. CisGenome, HOMER and MACS are used for comparison. 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 16
ChIP-seq 解析パイプライン インポート QC トリミング マッピング ピークコール ピーク近傍のアノテーション ピーク領域の アノテーション ピークの 5 末側 3 末側に一番近い遺伝子の名前とその距離をテーブルに付加 距離の情報でフィルタリングすることで たとえば 3 末端側上流 1000bp に遺伝子を持つピーク といった選択が可能 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 17
実行方法 ウィザードから各ステップごとの実行 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 18
Transcription Factor ChIP-seq 実行方法 Transcription Factor ChIP-Seq を選択 Mapping 結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 19
Transcription Factor ChIP-seq 実行方法 Control data がある場合 Control を選択 なくても実行できる Control data もマッピング済である必要がある Peak Shape Filter との乖離を示す Peak Shape Score の p-value の閾値を設定 検定の p-value のようなもの アウトプットを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 20
Transcription Factor ChIP-seq 結果 QC Report Peak shape filter 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 21
Transcription Factor ChIP-seq 結果 Peaks にピークの詳細情報が出ている 表示をテーブルビューに切り替えている 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 22
Transcription Factor ChIP-seq 結果 Peaks と Peak shape score はトラックリストに組み込んで利用できる 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 23
実行方法 解析パイプラインを作成し実行 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 24
遺伝子名のアノテーション付け Annotate with Nearby Gene Information を選択 Peaks のデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 25
遺伝子名のアノテーション付け アノテーションを付けたい遺伝子のトラックを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 26
遺伝子名のアノテーション付け 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 27
Advanced Peak Shape tools Learn Peak Shape Filter Learn Peak Shape Filter を選択 マッピングデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 28
Advanced Peak Shape tools Positive, Negative の領域を選択 Peak Shape Filter 作成に使う Bin の数やサイズも指定可能 Bin の数を大きくし過ぎると Filter がスムーズな形状にならない場合があるので 注意が必要 データ保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 29
Advanced Peak Shape tools 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 30
Advanced Peak Shape tools Apply Peak Shape Filter Apply Peak Shape Filter を選択 Mapping データを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 31
Advanced Peak Shape tools 作成した Peak Shape Filter を選択 ピークコールの p-value の閾値を指定 アウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 32
Advanced Peak Shape tools 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 33
Histone ChIP-seq Histone ChIP インポート Control インポート クオリティチェック クオリティチェック マッピング マッピング Histone ピークコール Histone のピークは Transcription Factor に比べてなだらかで広い領域のピークとなります 基本的なアルゴリズムは同じですが Histone ピークを想定した調整がされています Gene のアノテーションが付いているものを対象としているため 事前にアノテーションを準備ください 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 34
Histone ChIP-seq Histone ChIP-seq を選択 マッピングデータを選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 35
Histone ChIP-seq Gene のアノテーショントラックを選択 コントロールがあれば コントロールのマッピングを選択 アウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 36
Histone ChIP-seq 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 37
Bisulfite seq Bisulfite インポート Control インポート クオリティチェック クオリティチェック Bisulfite マッピング Bisulfite マッピング メチレーションレベル計算統計検定 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 38
Bisulfite Mapping Read データを選択 Map Bisulfite Reads to Reference を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 39
Bisulfite Mapping 選択したデータが選ばれていることを確認 Reference を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 40
Bisulfite Mapping Mapping のパラメータ アウトプットと保存 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 41
Bisulfite Mapping 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 42
Bisulfite Mapping コントロールのデータがある場合 同様に Bisulfite Mapping を行っておく 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 43
Call Methylation Level Call Methylation Levels を選択 マッピング結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 44
Call Methylation Level Read Filter:Non-specific や Duplicate を取り除いたり リードの末端部分を塩基数を指定して無視するような設定を行う Methylation detection: 検出したいメチレーションのタイプや指定する領域を選択 (RRBS の場合 ここで指定 ) マッピング結果を選択 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 45
Call Methylation Level 結果 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 46
ご清聴ありがとうございました Question? 2016/08/10 Filgen ChIP-seq (Transfactor & Histone), Bisulfite webex seminar 47