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1 World Ethanol 2009 参加報告 ( その 2) 先月に引き続き 2009 年 11 月 2 日 ~5 日にフランス パリ市内で開催された World Ethanol 2009 について報告する 主催は Agra Informa Ltd. である 以下数回にわたって Ethanol Production Workshop ( 生産効率向上の研究報告 ) の講演内容について 特に欧州からの発表を重点的に報告する 1. 酵素の科学 : デンプンベースのエタノールプラントにおいて 酵素はどう働くか? Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社 1-1 酵素の紹介 (1) 酵素とは何か? 酵素とは アミノ酸から生成されるタンパク質であり 生きた細胞から生成される 特定種の反応を加速させる生物学的触媒の働きを持ち エネルギー要求量を削減するのに利用される 触媒として作用している間は 酵素自身は変化しない (2) 酵素はどのような働きを持つか酵素は多岐にわたる用途を持つ 主な用途 4 項目を以下に示す 1 天然のポリマー ( 重合体 ) を分解できる - 粘性の削減 ( デンプン / ヘミセルロースの融解 ) - 発酵可能なモノマー ( 単量体 ) の形成 ( グルコースの形成 ) 2 反中和要素を除去できる -フィチン酸の除去 3 酵母食品を生産できる -タンパク質からアミノ酸の自由形状での形成 4 蒸発器の汚染や付着を削減できる -タンパク質の分解 (3) 酵素はどうやって作られるか? 酵素は 発酵プロセス ( エタノールと同じ ) によって作られるのが一般的であるが 産業用酵素は 非病原性微生物から作られるものもある なお 酵素は生物ではない 酵素は濃縮され安定した透明または黄 茶褐色の液体製品として販売されている ここで一般的な酵素生産プロセスを図 1-1 に示す 43

2 種子小瓶 種子フラスコ 種子発酵器 製品発酵器 液体培養基回収器 液体培養基処理 細胞分離 限外ろ過 調合 品質分析タンク施設 最終液体製品 品質管理検査 顧客へ製品販売 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-1 一般的な酵素の製造プロセス (4) 酵素についてのまとめ酵素はタンパク質であり バクテリア 酵母 菌から作られるものである また不活性の生物系触媒でもある ph や温度に影響を受けやすく 壊れやすい性質を持っている 酵素は 活動場所である培養基によってそれぞれ命名されることになる また酵素は エタノール生産に多大な役割を果たすものである 主な働きとして デンプンをデキストリン ( 多糖類 ) に変換する デキストリンをグルコースに加水分解する 粘着性を軽減する アミノ酸およびペプチドの形成によって酵母食品を生成することが挙げられる 1-2 デンプンベースのエタノール原材料の紹介 (1) デンプンベース原材料の種類エタノールの原料として デンプンベースの材料が必要とされるが プロセスの難易によって以下に示すカテゴリー A~D に分類することが可能である ( カテゴリー A) 容易なプロセス 低粘性 トウモロコシ : 最も豊富な穀物原料で デンプンを多く含む 溶解性ペントサンやβ グルカン含有量が低く 繊維質含有も少ない 穀物モロコシ : 性質はトウモロコシに似ている アメリカでは一般的な原料である 溶解性ペントサンやβ グルカン含有量が低く 繊維質含有も少ない ( カテゴリー B) 容易なプロセス 粘性は中程度 小麦: 欧州では最も豊富な穀物原料で デンプン含有量は中程度である 溶解性ペントサンの含有量が多く 発酵中に形成する ライコムギ: 小麦とライ麦の複二倍体であり 穀物原料として魅力を持つものである 溶解性ペントサンの含有量が多く 繊維質含有量は中程度である 44

3 情報報告 ウィーン カテゴリーC プロセスは難しく 粘性も高い 大麦 デンプン含有量は中程度 プロセスには高い技術と追加の酵素が必要とされる βグルカン含有量が高く 繊維含有量も高い 摩耗性あり ライ麦 低価格穀物である デンプン含有量は中程度 プロセスには高い技術と追加 の酵素が必要とされる 溶解性ペントサンの含有量が多く 繊維質含有量も 高い カテゴリーD 根や茎 キャッサバ 多くのアジア諸国で魅力的な原料であり デンプン含有量は中程度であ る 粘性を減らすためには 酵素が必要である (2)小麦の穀粒の形態 小麦穀粒のイメージを図 1-2 に示す 主要な 3 成分の特徴を以下に挙げる ①内胚乳 穀粒の 83 を占める デンプン源 タンパク質源 ②もみ殻 穀粒の 15 穀粒の外部層 ビタミン源 ③胚芽 穀粒の 2 油源 図 1-2 小麦穀粒のイメージ (3)デンプンベース原料の構造 デンプンとは 穀物における炭水化物を貯蔵する最重要設備であり 種子穀粒における小さ な顆粒として存在する またデンプンは 穀物穀粒総重量の約 を占め 酵母によって 発酵されるためには 加水分解される必要がある 表 1-1 に 各穀物のデンプン含有量および溶解性物質の濃度を示す 45

4 情報報告 ウィーン 表 1-1 デンプンの組織 組成 重合度 溶解性 デンプン βグルカン アラビノキシラン トウモロコシ 71± 穀物モロコシ 69± 小麦 68± ライ小麦 68± 大麦 59± ライ麦 61± キャッサバ 80±5 1-3 酵素によるデンプンの転換プロセスの概要 (1)転換プロセスの概要 穀物原料から酵素を用いてエタノールを生成するプロセスの概要を 図 1-3 に示す 図 1-3 穀物からエタノールへの一般的な転換プロセス (2)デンプンの融解 ①ゼラチン化と糊精化 デンプンのゼラチン化とは デンプン細粒の水和および膨張の結果 最大粘度となることで ある 一方で糊精化とは デキストリン 糊精 と呼ばれる短いグルコース鎖が 酵素の加水 分解によって生産されることを指し デンプンの可溶化およびマッシュ 泥状物 の粘性が削 減される 46

5 情報報告 ウィーン 泥状物粘性 mpas デンプンのゼラチン化挙動は 穀物の種類やデンプンの構成に依存することになる ペース ト状となる温度は であり ライ麦 小麦 トウモロコシの順で温度が高くなる ま た膨張体積 マッシュの粘性 は 原料によって変化するが 小麦 トウモロコシ キャッサ バの順で体積は大きくなる 温度と粘性の相関を 穀物モロコシの例として図 1-6 に示す 粉砕穀物モロコシ 固形物濃度 25 の水道水中での挙動 糊状 懸濁状 温度 図 1-4 デンプンのゼラチン化時の温度と粘性の相関 一方で デンプン細粒の可溶性を高めるためには 加熱が必要となる 温度が低いと 非効 率的である そこで酵素の添加によって 可溶化に必要なエネルギーの削減を図ることが可能 となる しかしそれでも 加熱はやはり必要なのである 温度ごとのデンプンの状況を図 1-5 に示す 非加熱コーンスターチに スルーソフト 10 デンプン増粘剤 を混合 75 に加熱 85 に加熱 90 に加熱 RVA 急速粘性分析装置 中で 95 60atm で加熱 図 1-5 デンプン細粒の可溶化状況 47

6 2αアミラーゼ αアミラーゼは デキストリンを生成するために α-1,4 グルコシド結合を無作為で加水分解する酵素である この融解可能な酵素が 粘性を削減させる働きを持つ αアミラーゼは 重合度を変えながら製品を形成していく特徴を持つ (3) 融解プロセスエタノール生成プロセスには 高圧蒸気を利用する高温ジェットクッキング法と 非圧力式クッキング法が用いられている その概要を図 1-6 および図 1-7 に示す Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-6 高温ジェットクッキング法の概要 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-7 非圧力式クッキング法の概要 48

7 情報報告 ウィーン (5)融解状況の監視 融解状況を監視する方法として DE 値 Dextrose Equivalent ブドウ糖等量値 の計測す ることになる 具体的には ブドウ糖と比較した還元力を計測する滴定法 ブドウ糖が 100 デンプンは 0 や デンプン融解プロセス中の糊精化温度の計測などが挙げられる ただし 高いβアミラーゼ濃度を持つ穀物 小麦 大麦 ライ麦 が作り出す DE データは マルトース 麦芽糖 形成の高いレベルのために 糊精化温度が過大評価されかねない 他には 糖質の 減少分を定量化する共通の方法として Lane-Eynon 法もしくは Luff Schoorl 法がある また穀物中のデンプンが可溶性となり加水分解される状況を確認する方法として ヨウ素試 験法も使用することが可能である ヨウ素がデンプンと錯体を作るとき アミロースやアミロ ペクチンの鎖の長さ 加水分解度 に依存する色の錯体を形成する アミロースが分解される 際には ポリマーはヨウ素との錯体を形成する性質を失う この場合 色は青から黄色まで変 化する 融解状況の具体例として HPLC 高速液体クロマトグラフィー による 融解時に形成され るブドウ糖の計測例を 重合度とブドウ糖濃度の相関の形で図 1-8 に示す ブドウ糖濃度 トウモロコシ DE12 小麦 DE24 大麦 DE25 融解酵素 αアミラーゼ 重合度 植物系βアミラーゼによって 小麦や大麦マッシュから DP2 マルトース が生成される 図 1-8 穀物 DE 値 による重合度とブドウ糖濃度との相関 1-4 プロセスの新たな開発 (1)αアミラーゼの開発 エタノール生産効率を上げるために 酵素の開発も進められてきた ここではαアミラーゼ の開発状況の概要を図 1-9 に示す 49

8 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-9 αアミラーゼの開発状況また異なるαアミラーゼを用いた場合の粘性減少度を図 1-10 に 重合度の増加傾向を図 1-11 にそれぞれ示す Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-10 異なるαアミラーゼを使用した場合の粘性減少状況 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-11 異なるαアミラーゼを使用した場合の重合度の成長度合 50

9 情報報告 ウィーン (2)デンプンの糖化 ①グルコアミラーゼ グルコアミラーゼは α1-4 結合を分解して 非還元末端のグルコースユニットを切り離す 働きを持つ またα1-6 結合を加水分解するグルコアミラーゼも存在する したがってグルコ アミラーゼは ブドウ糖を発酵可能なグルコースに変換する作用を持つことになる ただしグルコアミラーゼは 可溶性酵素よりも熱的な安定性は低い ②糖化プロセス 糖化プロセスでは 完全糖化と部分糖化の 2 種類に分類することができる 完全糖化とは 発酵プロセスが始まるよりも優先して完全に加水分解されることである 部分糖化とは 冷却 され発酵容器等に送られる以前に グルコースレベルを 5 25 に加水分解されることである 他には 糖化発酵同時発生 SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation プ ロセスも存在しており 糖化プロセスにおいても新たな開発が進められている (3)糖化と発酵の監視 糖化と発酵の監視には 前述同様に HPLC 分析 高速液体クロマトグラフィー が利用可能 である その装置の写真と分析結果例を図 1-12 に またバッチプロセスにおける糖化発行同時 発生の状況を図 1-13 に それぞれ示す DP-2 DP-1 ピーク高さ グリセロール DP-3 乳酸 琥珀酸 エタノール 酢酸 メタノール DP-n 滞留時間 分 図 1-12 HPLC 装置 高速液体クロマトグラフィー とその分析結果例 51

10 情報報告 ウィーン エタノール グルコアミラーゼ添加量 0.365g kg-穀物 酸性プロテアーゼ添加量 0.05g kg エタノール 重量 糖分 重量 全糖質 グルコース 発酵時間 時間 図 1-13 糖質酵素であるグルコアミラーゼと酸性アミラーゼのブレンドを使用した場合 の糖化と発酵の同時進行状況 (4)グルコアミラーゼの開発 ここではグルコアミラーゼの開発状況の概要を図 1-14 に示す 糸状菌 Trichoderma reesei グルコアミラーゼと αアミラーゼのブレンド 糖化効率 エタノール生産 AnGA と他の酵素のブレンド アスペルギルス ニゲル AnGA コウジカビ グルコアミラーゼ 図 1-14 グルコアミラーゼの開発状況 小麦の SSF における 異なる固形物濃度での最大エタノール生成割合を 二次酵素ブレンド と三次酵素ブレンドを比較した結果例を図 1-15 に 残留デンプンの割合について 図 1-16 に それぞれ示す 52

11 最大エタノール生産割合 ( 容積 %) 三次酵素二次酵素 状態 :SSF 培養基 : 小麦 ph:4.0 尿素 :400~600ppm 乾燥固形物濃度 (%) Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-15 小麦の SSF における 異なる固形物濃度における最大エタノール生成割合 ( 二次酵素ブレンドと三次酵素ブレンドとの比較 ) 残留デンプン割合 (% 乾燥ベース ) 三次酵素二次酵素 状態 :SSF 培養基 : 小麦 ph:4.0 尿素 :400~600ppm 乾燥固形物濃度 (%) Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-16 異なる固形物濃度における残留デンプンの割合 ( 二次酵素ブレンドと三次酵素ブレンドとの比較 ) 53

12 (5) プロセスの改善 1 穀物の非デンプン系ポリ糖質 - 穀物からエタノールへの変換プロセスへの影響ライ麦 大麦 ライコムギ 小麦のような穀物は 高いレベルのヘミセルロース (βグルカン ペントサン ) を含んでいる また高い水和性を持つため 粘性は高い 結果として 熱交換操作 固形物の遠心分離 蒸発 発酵における転換などの効率が下がることになる マッシュ中の固形物濃度にも限界がある またプロセスにおけるエネルギーバランスの効率低下の原因となり 結果として固形分割合の低さ 水分の高さ エタノール生産量の低下を招くことになる さらに 残留ヘミセルロースは熱交換器や蒸留装置の汚染の原因となる 2βグルカナーゼとキシラナーゼの利用マッシュ化および発酵中の粘性削減プロセスを図 1-17 に示す で示した部分が 粘性で問題となり得る箇所である また各穀物のβグルカナーゼとキシラナーゼの含有度合を図中の表に示した 粘性が問題となり得るポイント 粉砕穀物 純水 スラリータンク 10 分 ~1 時間 融解 1~3 時間 糖化 0~24 時間 発酵 24~72 時間 穀物 β グルカネーゼ アラビノキシラネーゼ 小麦 穀物モロコシ 大麦 ライ麦 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-17 泥状化および発酵中の粘性削減のプロセス 3 大麦およびライ麦マッシュの粘性削減混合および融解時のマッシュの粘性削減状況を 大麦の場合を図 1-18 に ライ麦の場合を図 1-19 にそれぞれ示す 54

13 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-18 大麦マッシュの粘性削減状況 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-19 ライ麦マッシュの粘性削減状況 (6) プロテアーゼの利用 1プロテアーゼの特長プロテアーゼとは タンパク質などのペプチド結合を加水分解する酵素である 以下にその特長を挙げる プロテアーゼがない場合と比較して 培養基ベースの穀物に対するエタノール生成割合増加と生成時間短縮が可能となる 酵母の成長と維持に必要不可欠なアミノ酸やペプチドの形成に対して 必要な酵母養分を供給する 細胞内のデンプン構造を加水分解し易くする作用を持つ 蒸留や乾燥時における 小麦タンパク質の硬さ( 加水分解のし難さ ) を軽減する 55

14 2プロテーゼの種類プロテアーゼの ph と温度による特性を図 1-20 に示す Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-20 ph と温度によるプロテアーゼの種類 (7) 発酵効率の最大化酸性の菌性プロテーゼによる エタノール生成率の改善状況を 図 1-21 に示す Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社図 1-21 発酵効率の最大化 ~ 酸性菌プロテアーゼによるエタノール生成率の改善効果 56

15 1-5 補足最後に 本文中で取り上げたキーワードを 以下の通りに簡単にまとめる 1 酵素バイオ触媒として作用するタンパク質である 2デンプングルコース分子から作られるポリマー ( アミローズとアミロペクチン ) であり アミラーゼによって低粘性に分解可能で また発酵可能なグルコースを生成することが可能である 3αアミラーゼマッシュの粘性を削減するために融解で利用される酵素であり 開発された酵素は 優れた特性を持つ 4グルコアミラーゼブドウ糖を発酵可能なグルコースに加水分解できる酵素である 酸性の菌性プロテアーゼや酸性 αアミラーゼのような他のバイオ触媒と組み合わせることで 発酵効率を改善できる 5βグルカナーゼとキシラナーゼマッシュの粘性削減に必要であり 高泥度固形物のプロセスにおけるエネルギーバランスを改善するのに必要な酵素である 6 酸性プロテアーゼマッシュ中でタンパク質やペプチドから遊離アミノ酸を作り出すために使用可能な酵素であり 発酵率やエタノール生産を増やすことが可能となる これらの酵素は 小麦のタンパク質の硬度削減と 蒸留および DDGS プロセスにおける汚染を軽減できる ( 参考資料 ) World Ethanol 2009 Ethanol Production Workshop 講演資料 Gerhard Konieczny-Janda 氏 Genencor 社 57

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