Microsoft Word - 報告書案
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- たつや いのら
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1 第二回質量分析の定量セミナー 報告 日時 :2014 年 6 月 24 日 ( 火 )14:00~15:30 場所 : 生物科学研究棟 3 階大セミナー室 (S311) 講師 : サーモフィッシャーサイエンティフィック ( 株 ) 肥後大輔先生内容 : 定量プロテオーム解析のアプローチ 定量的プロテオーム解析を総括的に お話しいただいた 者 :22 名 資料セミナー参加のみ配布 :1 名主任研究員室 :4 室環境資源科学研究センター :1 グループ 1ユニット脳科学総合研究センター :1チームグローバル研究クラスタ :1チーム グローバル研究クラスタの教育セミナー第 2 弾として 3 回シリーズで質量分析の定量測定方法を中心に講演を行った 第 2 回はプロテオミクスの定量について MS と MS/MS を使った網羅的解析からターゲット分析まで SLIAC,TMT,DIA,SIM,SRM,PRM に分類して 特にサーモの Q-Exactive や TSQ Quantiva を用いた定量についての実例を交えてご講演頂いた また ASMS で発表された新機種の紹介もあった 参加者から 多くの質問があった ノンラベル定量する際 DIA( データ非依存的分析 ) と DDA( データ依存的分析 ) の違いについての質問は DDA は 定量の対象となる同定数は多いが 分析ごとに同定されるペプチドが異なる点が問題となり DIA ではいつも同じ MS を分析するので結果は安定しているとの説明があった 新しい TSQ Quantiva のニュートラルブロッカーと Q-Exactive の曲がった導入部との違いについての質問や新機種についての質問もあった 終了予定時間が 10 分伸び 15:10 に終了しました アンケート結果 ( 回答者 :20 名 ) 教育セミナーの内容は? 難しかった :7 名 適切であった :13 名 易しかった :0 名
2 感想は?( 複数回答有 ) 定量法について知見を得ることができ良かった 新技術が多く 理解するのが難しかった 定量プロテオーム解析の実際を学ぶことができ 大変参考になった 説明が分かり易かった 実際の解析例など論文が紹介されたりすると より具体的に分かり易いかもしれないと思った いろいろな定量の方法が出てきたので 具体的な例から どういう時に どの方法が良いということを もう少し詳しく聞きたかった 定量解析について大変分かり易い説明であった 更に更に新しい装置が出たとのことに驚いた それぞれの前処理方法と測定 DATA の出し方について分かった 新装置の新技術について学べて良かった 高い感度で定量できるようになっていることが分かった 真空を落とさずに洗浄ができるのが良いと思った Neutral Blocker 等 進化が目覚ましく驚いた 装置をいつ買い替えるか 更に悩む所だ 参考になりました 新しい TSQ の技術が素晴らしい 特に イオン源の汚れ対策 現行機にもニュートラルブロッカーが欲しい 定量と新製品の話が聞けて良かった 分からない所もあったが 興味を持って最後まで聞くことができた 以上
3 定量プロテオーム解析のアプローチ サーモフィッシャーサイエンティフィック CMD アプリケーション部 肥後大輔 1 The world leader in serving science プロテオーム解析 前処理試薬 自動化 Fishing Biomarker Discovery Targeting Biomarker Quantification 2 1
4 Easy nlc+spray 大規模プロテオーム解析 Near-complete, rapid and robust proteome analysis single-shot LC-MS/MS system >4,000 identified proteins per run 50 cm column length Median sequence coverage 23% 1% FDR 4 h gradient 35 o C (nano UHPLC) 3 Nagaraj et al.,systems-wide perturbation analysis with near complete coverage of the yeast proteome by single-shot UHPLC runs on a bench-top Orbitrap. MCP 2011, M Multiplexed Protein Quantification Strategies Isobaric labering Orbitrap Fusion / Q Exactive Isobaric labeling Orbitrap Fusion / Q Exactive SILAC Data Independent Aquisition Orbitrap Fusion / Q Exactive TMT DIA HR/AM Orbitrap Fusion / Q Exactive SIM PRM SRM 500 SRM/sec TSQ Quantiva MS 4 2
5 Multiplexed Protein Quantification Strategies MS level precursor ion SILAC More information Full mass range with data base search MS/MS level product ion TMT DIA Narrow mass range with library search DIA SIM Targeted mass range SRM PRM High sensitivity 5 Mass range effect m/z S/N = 1 Full mass range ( m/z ) Targeted mass range ( m/z ) m/z S/N =
6 Multiplexed Protein Quantification Strategies SILAC TMT DIA SIM PRM SRM 7 Isobaric Labeling: SILAC Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture Light-peptide Heavy-peptide SILAC Ratio = heavy/light 8 4
7 Isobaric Labeling: TMT 6plex Isobaric mass tagging on peptide Peptides MS/MS m/z 6 Reporter Ions 126 * * *** * *** * 129 * * *** ** * * * * * *** ** ** * * HCD FRAGMENTATION Labeled Peptides LC-MS/MS Full MS m/z One Signal 9 DIA : Label Free Protein Quantification SILAC TMT DIA SIM PRM SRM 10 5
8 DIA : Data Independent Acquisition Data Dependent Independent Acquisition 16 of 25 Da isolation wide windows = 400 m/z MS/MS Database Search m/z Library search, MS/MS level Quantification method 11 Leading Portfolio of MS Quantification Solutions HR/AM DIA Method Instrument Control Software 22Sp1 2.2 MS/MS Spectral Library Development using Thermo Scientific Pinpoint Software Complex digest UPLC DIA Multiplexed DIA (msxdia) Targeted Quan Data Extraction Using Pinpoint Software Predefined include lists 12 6
9 Simultaneous Qualification and Quantification Using Pinpoint Quan out put Qual using eight most intense fragment ions Quan using three most intense fragment ions 13 DIA Performance with Wide Isolation Window 50 fmol product ion signal 100 amol product ion signal Library search, MS/MS level Quantification method 14 7
10 90% of Total Targeted Proteins Quantified Quantitative summary for targeted 806 proteins from E.Coli 15 Excellent Reproducibility 66.4% Observed CV% for 2966 peptides from 500 ng EColi E.Coli digest # of peptides 25.5% 49% 4.9% 2.4% 1.0% CV% (n=3) 16 8
11 DIA : Data Independent Acquisition Scan range Library 17 Multiplexed Protein Quantification Strategies SILAC TMT DIA SIM PRM SRM 18 9
12 HR/AM Targeted Protein Quantification for high selectivity for flexibility for throughput 19 HR/AM SIM SIM Dilution curves SIM 4.4 fmol Zoom in Res : Res : amol 20 10
13 Comparing Traditional SRM with HR/AM SIM HR/AM quan works for a much wider range of peptides 21 Data courtesy of Scott Peterman, Thermo Scientific PRM = Parallel Reaction Monitoring (multiplexed t-ms 2 ) Serial monitoring Parallel monitoring 22 Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Peterson et al., MCP 2012, O
14 PRM for Highest Selectivity ratio Area r amol Multiplexed thcd PRM Zoom in Res : fmol (LOQ SIM, Res 70 Dilution 000) curves Amount (fmol) Res : SIM 4.4 fmol Main fragments: m/z (y 8+ ) m/z (y 9+ ) m/z (y 10+ ) Transition m/z (y 8+ ) 18 amol 23 Multiplexed Protein Quantification Strategies SILAC TMT DIA SIM PRM SRM 24 12
15 SRM Serial monitoring 25 Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Peterson et al., MCP 2012, O Triple Quad mass spectrometer TSQ Endura 高感度定量のスタンダードシステム 耐久性 (=Endurance) をさらにアップ 使い易さを追求したソフトウエア 堅牢性の向上 TSQ Quantiva 世界最高クラスの高感度定量システム TSQ Vantage の約 10 倍感度アップ 新たなテクノロジーを搭載 アトグラムレベルの感度 使い易さと堅牢性をアップ 26 13
16 TSQ Quantiva 高い耐久性を兼ね備えた高感度 LC-MS/MS 質量範囲 : m/z 10~1,850 高速 pos/neg 切り替え (<25 ms) より高感度に新たなIon Funnelを搭載四重極 RF 設定の変更 更なる耐久性 Neutral Blocker 多成分 SRM 分析を支援する Active Collision cell 27 AIM=Active Ion Management の略 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell
17 Ion Funnel 効率よくイオンを収束 感度 UP! 29 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell
18 Neutral Blocker 31 耐久性 Normalized Peak Area Extreme Robustness Testing (Synthetic Serum Stress Test) TSQ Quantiva >3x more robust 耐久性が UP! Novel neutral blocker captures contaminating species outside of the ion path Current State of the Art Number of Injection Equivalents 32 16
19 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell Equal Amplitude (Balanced) 33 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell Equal Amplitude (Balanced) 10% Bias Amplitude (Asymmetric) 34 17
20 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell Increased Transmission at Every Resolution ansmission % Relative Tra % Increase in Signal 感度 UP! Asymmetric RF Balanced RF FWMD (Da) 35 TSQ Quantiva - AIM Technology について - 新しいイオンファンネルニュートラルブロッカー四重極 RF 設定の変更 Active collision cell 多成分を同時に測っても十分なスキャンポイントと感度が得られます! 36 18
21 TSQ Quantiva : 感度 Challenge サンプル量が少ない試料 マトリクスの多い試料 少ない注入量で高感度に測定したい TSQ Quantiva MS AIM 技術を採用したTSQ Quantiva が解決します 37 TSQ Quantiva の感度 : アルプラゾラム 100 Blank fg on column fg on column fg on column 0.3fg on column 0.3 fg Alprazolam on Column neat. RSD = 9.5% (auto-integrated) fg on column Time (min) 38 19
22 6 桁の広いダイナミックレンジ : アルプラゾラム %RSD Level (No IS) 0.3 fg 9.5% 1 fg 6.6% 3 fg 3.01% 10 fg 2.09% 30 fg 1.03% 100 fg 0.68% 300 fg 0.99% 1 pg 0.85% 3 pg 0.52% 10 pg 0.31% 30 pg 0.41% 100 pg 0.56% 300 pg 1.27% 39 TSQ Quantiva TSQ Endura : 堅牢性 Challenge TSQ Quantiva MS 長期間の連続稼働時でも安定した 湾曲型四重極レンズとニュートラル 感度を維持したい ブロッカーが高い堅牢性を維持 40 20
23 TSQ Quantiva : 堅牢性 1.0 堅牢性テスト (Synthetic Serum Stress Test) ニュートラルブロッカーが四重極の汚染を防ぎます ormalized Peak Area TSQ Quantiva MS >3x more robust N 0.2 従来までの装置 Number of Injection Equivalents 41 TSQ Quantiva : 耐久性試験 Total 8 days test STD Plasma 4 days (830 injection) 4 days (850 injection) STD solution ng/mL in 80%ACN aq. Plasma sample prep. Bovine plasma : ACN= 1:4 crashed 10,000 rpm, 3 min Supernatant added STD 1.0 ng/ml spiked plasma sample 42 21
24 優れた耐久性 : プラズマ添加試料 4 days, 850 injection Plasma: 除タンパク試料 Minoxidil CV=4.4% Carbamazepine CV=6.1% Clenbuterol CV=4.5% Warfalin CV=7 7.2% Pirenzepine CV=5.6% 43 Sweep Cap: 真空を落とさず簡単洗浄! 牛乳添加試料 連続測定後 44 22
25 イオントランスファーチューブ : 真空を落とさず簡単洗浄! イオントランスファーチューブ装着時 汚れが溶け易い溶媒による超音波洗浄 真空解除しなくてOK イオントランスファーチューブ交換方法 Metal ball 45 TSQ Quantiva - メンテナンスの簡単さ 工具不要 46 23
26 TSQ Quantiva TSQ Endura : 操作性 Challenge 条件の最適化 分析メソッドの作成 直感的で操作が簡単なソフトウェア TSQ Quantiva MS ドラッグ アンド ドロップのメソッド作成画面を採用 47 ターゲットタンパク質定量 前処理試薬 自動化 Fishing Biomarker Discovery Targeting Biomarker Quantification 48 24
27 Attomo オーダーでのペプチド定量感度 49 Attomol オーダーでのペプチド定量の安定性 50 25
28 amol ~ fmol をカバーする広いダイナミックレンジでのペプチド定量 51 TSQ Quantiva :Faster Scan Speed (500 Transitions/Sec) Peptide A spiked in 1 ug cell digests AA: %CV (n=3): 3 モニターイオン :100 チャンネル AA: %CV (n=3): 4 モニターイオン :500 チャンネル 52 Data Courtesy of OnCoplexDx 26
29 Pinpoint Software タンパク質同定結果から自動化されたターゲット定量メソッド開発 SRMメソッド構築の最適化 データ解析の自動化 - Qualitative Analysis: タンパク質 / ペプチドの同定 - Quantitative Analysis: タンパク質 / ペプチドの量 ( 濃度 ) の決定 53 Quantiva と Pinpoint を使ったメソッド構築と定量分析の流れ E. Coli 消化物にスパイクされた 12 種類の標準タンパク質消化物をターゲットとした定量メソッドの構築と最適化 Sample A:500ng の E.Coli にスパイクされた 5fmol/uL の 12 種類の標準タンパク質 Sample B: 500ng の E.Coli にスパイクされた 12 種類の標準タンパク質 12 種類のうち四つずつを 0.5fmol/uL 5fmol/uL 50fmol/uL の濃度違いを作成 54 27
30 Pinpoint 1.3 による SRM 測定メソッドの作成 MASCOT 結果など Proteome 解析結果ファイルのインポート 55 Pinpoint 1.3 による SRM 測定メソッドの作成 ターゲットとするペプチドを選択することで同定結果から得られた MSMS パターンから SRM に最適と推奨される定量イオンをソフトが自動的に選別 CID MS/MS 942 transitions Top 6 y ions automatically selected as transitions per peptide target 56 28
31 ターゲットタンパク質定量の実施 Targeting Biomarker Quantification 57 Pinpoint 1.3 による SRM 測定メソッドの最適化 ソフトが自動的に選別した定量イオンによる SRM 測定結果の解析 ターゲット定量が不十分であったペプチドについてのみ 定量イオンやコリジョネネルギーを変更するなど最適化を実施 Top N peptides per targeted protein, which passed peak detection criteria and gave strongest signal Intensities are selected automatically for generating next refined SRM assay 58 29
32 Pinpoint 1.3 による SRM 測定結果の定量解析 最適化された SRM メソッドによる実サンプル (A および B) の定量解析結果 定量結果の表示 A 精度 (%CVs) ピークエリア表示 B 59 Pinpoint 1.3 による SRM 測定結果の定量解析結果 最適化されたメソッドによる SRM 測定の結果 E.Coli 500ng にスパイクされた 12 種類の標準タンパク質中 濃度の異なる 3 グループ (0.5~50fmol/uL) の精度の高い定量結果 60 30
33 Multiplexed Protein Quantification Strategies Isobaric labering Orbitrap Fusion / Q Exactive Isobaric labeling Orbitrap Fusion / Q Exactive SILAC Label free quantification Orbitrap Fusion / Q Exactive TMT DIA HR/AM targeted quantification Orbitrap Fusion / Q Exactive SIM PRM SRM 500 SRM/sec TSQ Quantiva MS 61 Transform Your Science 62 31
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LTQ Orbitrap Shotgun proteomics Large scale proteomics by orbitrap technology. Thermo fisher scientific K.K SID C&MS Application OMICS Team TMT 2 Proteome Cell and Tissue Protein Peptide Extraction Protease
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5-53 - プロテオームプロファイリング ( タンパク質組成分析 ) は組織 血液などのペプチドやタンパク質の検出を目指す技術です 液体クロマトグラフィー タンデム質量分析法に基づき タンパク質の混合物を質量分析法で同定し データ解析が行われます トランスクリプトーム解析とともに 生体システムにおけるダイナミックな変化を網羅的に解析できます 高解像度と高精度 : 解像度は 10 5 超 精度は 1ppm
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バイオ解析チーム教育セミナー資料 質量分析9 ベンチトップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive による Proteome 解析 サーモフィッシャーサイエンティフィック アプリケーション部肥後大輔 Thermo Scientific: Mass Spectrometers TSQ Vantage Q-Exactive + Exactive LTQ FT Ultra LTQ LTQ Orbitrap
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薬物分析法の開発
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1. を使用して 測定化合物のモニターイオン (m/z) コーン電圧 及び (MS/ MS システムの場合 ) コリジョンエネルギーの最適化を行い MS メソッドを自動作成する方法についてご紹介します 同時にレポートを印刷することも可能です 1.1 測定化合物のイオン化確認 シリンジに 測定化合物 ( 濃度 0.1 ~ 1 μg/ml 前後 ) を準備します ( 最初から高濃度のものを MS に導入しますと
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<4D F736F F D C6E30385F A B B83932E444F43>
1,2,4-1,2,4-Trimethylbenzene Pseudocumene 1,3,5-1,3,5-Trimethylbenzene Mesitylene CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 1,2,4-trimethylbenzene 1,3,5-trimethylbenzene CAS 95-63-6 CAS 108-67-8 C 9 H 12 C 9 H 12
<4D F736F F D F90858C6E5F C B B B838B>
Isobutyl alcohol IUPAC 2-methylpropan-1-ol 2--1-2-Methyl-1-Propanol, Isobutanol CH 3 H 3 C OH CAS 78-83-1 C 4 H 10 O log P ow ( C) ( C) (kpa) (g/l) 74.12 74.14 1) -108 2) 108 2) 1.2 2) 87 2) 0.8 2) (74.1214)
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2,2-2,2 -Iminodiethanol Diethanol amine CAS 111-42-2 C 4 H 11 NO 2 105.1356-105.0790-28 C 1) 1.0881 g/cm 3 1)
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ウイルス 感染症研究 実験特集 不可能を可能にする NanoLuc テクノロジー NanoLuc テクノロジーをご利用のウイルス 感染症研究に携わるユーザー 4 名の方に最新の 研究成果についてご寄稿頂きました プロメガが開発した NanoLuc は 19 KDa の低分子の発光酵素であり 従来のホタルルシフェラーゼの 1/3 の分子量であるにもかかわらず 発 光レベルは 1 倍にも達します この
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26 Discrimination of abnormal breath sound by using the features of breath sound 1150313 ,,,,,,,,,,,,, i Abstract Discrimination of abnormal breath sound by using the features of breath sound SATO Ryo
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05_Sakamoto
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テレビ番組による相互交流
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2011 Vol.60 No.2 p.138 147 Performance of the Japanese long-term care benefit: An International comparison based on OECD health data Mie MORIKAWA[1] Takako TSUTSUI[2] [1]National Institute of Public Health,
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...1...1...1...2...4...4...4...6...7...7...7...7...8...8...9...9...10... 11... 11... 11... 11...12...12...13...16...18...20 1 1-1 1-2 1 1 km 24.5 m/s 10 50 m 1 1-3 μm 1-4 1-5 2 8 http://www.jma-net.go.jp/sat/himawari/obsimg/image_dust.html
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1.0 1. Display Format 8*2 Character 2. Power Supply 3.3V 3. Overall Module Size 30.0mm(W) x 19.5mm(H) x max 5.5mm(D) 4. Viewing Aera(W*H) 27.0mm(W) x 10.5mm(H) 5. Dot Size (W*H) 0.45mm(W) x 0.50mm(H) 6.
: / FDA HBsAg HIV 1/2 HCV : QMS : 3.5% IgM () 1.0% H317 - H334 - : : :: : QMS Everolimus : 6.4% (II) H400 - H % SDS QMS EDTA (K 3 ) EDTA (K 2 )
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