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1 ACQUITY UPLC SYNAPT TM G2 HDMS TM /3/29 13:00-13: Nihon Waters K.K. LC/MS Monoclonal Antibody Aspirin Insulin EPO MW 180 MW 6,000 MW 34,000 MW 147, Nihon Waters K.K. 2 1

2 LC/MS ACQUITY UPLC /SYNAPT TM G2 HDMS TM 2010 Nihon Waters K.K. 3 ACQUITY UPLC PITTCON Nihon Waters K.K. 4 2

3 ACQUITY UPLC LC/MS UPLC HPLC Speed Resolution 15,000 psi 120 µl HPLC UPLC = Sensitivity HPLC UPLC U.S. Patent No. 6,686,035 B2 Anal. Chem. 2003, 75, ,000 psi Better MS Data 2010 Nihon Waters K.K. 5 UPLC 1. UPLC Amino Acid Analysis Solution 2. Peptide Separation Technology 3. Oligonucleotide Separation Technology 4. Protein Separation Technology 5. Glycan Separation Technology 2010 Nihon Waters K.K. 6 3

4 SYNAPT TM HDMS TM PITTCON Nihon Waters K.K. 7 SYNAPT TM G2 HDMS TM Q-TOF10 Q-TOF MS E ESI MALDI 2010 Nihon Waters K.K. 8 4

5 SYNAPT TM G2 Q-TOF IMS MS/MS MS > 40,000 FWHM > ppm RMS UPLC 20 spectra/sec 4 IMS IMS TAP -IMS- MS 2010 Nihon Waters K.K. 9 Prepare Analyse Interpret Decide 2010 Nihon Waters K.K. 10 5

6 SYNAPT TM HDMS TM 2010 Nihon Waters K.K LC,HC / etc -S-S Goal 2010 Nihon Waters K.K. 12 6

7 LC,HC / - etc -S-S Goal Waters LC/MS MassPREP TM Micro Desalting Column Protein Separation Technology Column BiopharmaLynx TM MaxEnt Nihon Waters K.K. 13 IgG IgG LC/MS BiopharmaLynx TM 2010 Nihon Waters K.K. 14 7

8 LC/MS MassPREP TM Desalting Column : 3 min + 51 Charge state TIC ( min) Pre-run Blank 0.5 µg IgG1 ( ) ( ) Gal Fuc Man Fuc S S S S S S S S ( ) ( ) GOF/G0F G0F/G1F G1F/G1F G0F/G2F MaxEnt1 : G1F/G2F Post-run Blank G0/GOF G2F/G2F 2010 Nihon Waters K.K. 15 BiopharmaLynx TM BiopharmaLynx TM : 2010 Nihon Waters K.K. 16 8

9 etc LC,HC / - etc -S-S Goal Waters UPLC AAA solution Peptide Mapping solution RapiGest TM SF Peptide separation technology column MS E BiopharmaLynx TM Nihon Waters K.K. 17 IgG LC/MS PST BiopharmaLynx TM 2010 Nihon Waters K.K. 18 9

10 Peptide Separation Technology AU 7.0e-2 60e2 6.0e-2 5.0e-2 HPLC 2.1 x 250 mm, 3.5 µ PST Column : 4.0e-2 90 min 3.0e-2 2.0e-2 Improved resolution Reduced run time TFA or Formic acid ph 1-12, High Temp Columns QC tested with a peptide map AU 1.0e-2 Time e-1 9.0e-2 80e2 8.0e-2 7.0e-2 6.0e-2 5.0e-2 4.0e-2 3.0e-2 2.0e-2 UPLC 2.1 x 150 mm, 1.7 µ 55 min Time Nihon Waters K.K. 19 High Resolution Separation of Glycopeptides by UPLC G2 (M+H) +3 m/z % 6 3 PST Column : G1 (M+H) +3 m/z % G0 (M+H) +3 m/z % Time Mouse IgG glycoforms were detected using extracted mass chromatograms of the triply charged glycopeptides. The positional isomers of G1 have been separated by UPLC Nihon Waters K.K

11 BiopharmaLynx TM BiopharmaLynx TM : 2010 Nihon Waters K.K. 21 LC/MS E Data Acquisition 1 sec MS Precursor MS E : MS E Fragments LowEnergy HighEnergy Retention Time 2010 Nihon Waters K.K

12 BiopharmaLynx TM 1.2 : BiopharmaLynx TM ver.1.2 : MS E b/y 2010 Nihon Waters K.K. 23 BiopharmaLynx TM 1.2 : 1. Fragmentation patterns can be compared between analyses 2. Potential alternative peptide assignments tested and selected 3. Modifications can be assigned to specific residues BiopharmaLynx TM ver.1.2 : 2010 Nihon Waters K.K

13 LC,HC / - etc -S-S Goal Waters LC/ESI/MS IgG IgG MassPREP TM Glycoanalysis Kit Glycan separation technology column MALDI/MS BiopharmaLynx TM 2010 Nihon Waters K.K. 25 IgG & IgG() PNGaseF N- 2-AB LC/MS PST LC/MS LC/FLR/MS (GST ) MALDI/MS 2010 Nihon Waters K.K

14 090520_YAA026_ABC_ProIgG_ (18.564) Cm (1038:1056) % : TOF MS ES m/z Glycan Separation Technology GST column : IgG13 QC MassPREP TM Glycoanalysis kit : PNGaseF HILIC SPE MALDI 2010 Nihon Waters K.K. 27 GST2-ABLC/FLR/MS 5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G _YAA026_ABC_ProIgG_02 (1) ACQUITY FLR ChA Ex330,Em420 nm G0F G1F Range: EU x 10e G Man G0FGN G G1FGN G Man6 G1FS1 G2F GST column G2FS FLR 5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G _YAA026_ABC_ProIgG_02 1: TOF MS ES BPI 77.8 (M+2H)2+ GST column ESI/MS Loss -15 Da of labeled glycans % Loss of GN (M+H) BPI Time IMS MS Nihon Waters K.K

15 MALDI/MS A) G1F GOF MALDI/TOF G2F m/z B) Q-TOF B1 Y5 Y5 B1 B1 Y4 B2 Y4 B2 B5Y3 Y2 B2 Y3 B3 B3/Y5/Y5 Y1 Y2 B4 Y3 B5 Y4/Y5 B3/Y5 Y4 B5/Y5 B5/Y5/Y5 Y4/Y4 Y5/Y5 B4 B5/Y5/Y4 Y5 B5 (M+Na) + GlcNAc Man Fuc G0F MALDI/Q-TOF m/z 2010 Nihon Waters K.K LC,HC / etc -S-S Goal 2010 Nihon Waters K.K

16 UPLC MS Software Solution system ICH Q6B MassPREP TM micro desalting column PrST column SYNAPT TM BiopharmaLynxTM MaxEnt TM a) PST column SYNAPT TM HDMS TM TUV BiopharmaLynx TM MaxEnt TM 3 BioLynx TM DriftScope TM c) d) e) f ) e) a) b) AccQ Tag TM Ultra BEH C18 column SYNAPT TM EmpowerTM MassLynx TM b) GST column Amide column SYNAPT TM HDMS TM FLR - MALDI/SYNAPT TM SYNAPT TM FLR SimGlycan* DriftScope TM BioLynx TM f) SEC, IEX TUV Empower TM, MassLynx TM c) HCP HCP nanoacquity 2D RP-RP TRIZAIC TM SYNAPT TM PLGS nanoacquity Verify E TRIZAIC TM TQ TargetLynx TM - SYNAPT TM HDMS TM DriftScope TM f) nanoacquity HDX * SYNAPT TM - PST column SYNAPT TM PLGS PST column TQ Verify E TargetLynx TM a) b) c) 2010 Nihon Waters K.K. 31 SYNAPT TM HDMS TM 2010 Nihon Waters K.K

17 LC/MS UPLC 60mer QC ACQUITY BEH OST C 18, 50 x 2.1 mm, 1.7 µm column mer oligothymidine ladder, 0.2 ml/min 40T 50T 60T UV 260 nm 0 minutes Nihon Waters K.K. 33 LC/MS A: 15 mm TEA, 400 mm HFIP aq. B: 50% Solvent A, 50% MeOH short-mer TIC MS 2010 Nihon Waters K.K

18 LC MS ProMass for MassLynx TM Deconvolution charged envelope parent MW 2010 Nihon Waters K.K. 35 LC MS ProMass for MassLynx TM 2010 Nihon Waters K.K

19 UPLC OST column HFIP/TEA 1 OST column Ammonium bicarbonate MS Software Solution system SYNAPT TM MaxEntTM 1 ProMass SYNAPT TM MaxEntTM 1 ProMass OST column SYNAPT TM MaxEntTM 3 Spreadsheet * - MALDI/SYNAPT TM OST column PEG (MassPREP TM desalting column) SYNAPT TM TUV ProMass SYNAPT TM HDMS TM MaxEntTM 1 BiopharmLynx TM (charge stripping) DriftScope TM - SYNAPT TM HDMS TM DriftScope TM OST column SYNAPT TM ProMass OST column BEH C18 1.0mm column SYNAPT TM nanoacquity UPLC (TRIZAIC TM ) QuanLynx TM 2010 Nihon Waters K.K. 37 ACQUITY UPLC SYNAPT TM G2 HDMS TM Xevo TM QTof MS 2010 Nihon Waters K.K

20 Q-Tof 1. UPLC /MS IgG 2. Nano UPLC /MSIgG UPLC / Tof 5. UPLC /MS UPLC /MS E Nihon Waters K.K

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