バイオ解析チーム教育セミナーMS09

Size: px

Start display at page:

Download "バイオ解析チーム教育セミナーMS09"

かずまさすすむ
5 years ago
Views:

1 バイオ解析チーム教育セミナー資料質量分析9

2 ベンチトップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive による Proteome 解析サーモフィッシャーサイエンティフィックアプリケーション部肥後大輔 Thermo Scientific: Mass Spectrometers TSQ Vantage Q-Exactive + Exactive LTQ FT Ultra LTQ LTQ Orbitrap 2 1

3 ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive 94cm 91cm 74cm MS scan:m/z5-4, Q1 isolation:~m/z25 Isolation width:>.4amu MS/MS:m/z5-4, 質量精度 :1ppm( 内部標準 ) 5ppm( 外部標準 ) 分解能 : 17,5@12Hz 1,@1Hz Pos/Neg 切り替え測定 (<1s) Data dependent MS/MS 測定 SIM 測定 3 ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive HCD collision cell Predict AGC Quadrupole mass filter (Q1) 円柱面ではなく双曲面の四重極 Prefilling + HCD-MS/MS 高分解能モードでも透過効率を維持高感度 / 高速な MS/MS 測定 SIMモードによる定量 S-lens 高イオン透過効率 Orbitrap detector 新しい FT プログラム : Enhanced FT 従来よりも 1.8 倍の高分解能 ( or 高速化 ) 4 2

4 ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive S-lens 高イオン透過効率 5 S-Lens: Stacked Lens 従来のイオンガイド従来のトランスファーチューブを短く切断して代わりに S-Lens を搭載イオン透過効率が向上 S-Lens 6 3

5 S-Lens: Stacked Lens Standard LTQ Intensity: 1.1E3 1 NL: 1.7E3 m/z= M S AlpStdLTQ1fg_ x5 1 9 NL: 1.7E3 m/z= M S alpstdltq1fg_2 NL: 1.7E3 8 m/z= M S 75 alpstdltq1fg_3 NL: 1.7E3 m/z= M S alpstdltq1fg_4 65 NL: 1.7E3 m/z= M S alpstdltq1fg_5 NL: 1.7E3 55 m/z= M S alpstdltq1fg_6 NL: 1.7E3 45 m/z= M S AlpStdLTQ1fg_ 7 NL: 1.7E3 35 m/z= M S 3 alpstdltq1fg_8 25 Relative Abundance +S-Lens: Intensity: 8.8E3 1 NL: 8.8E3 m/z= x5 MS 9 A lpdualid 7_5m m tp6_2m m CL8t h_6 85 NL: 8.8E3 m/z= MS 75 alpdualid7_5m m t p6_2m m cl8th_ 7 7 NL: 8.8E3 m/z= MS 6 alpdualid7_5m m t p6_2m m cl8th_ 8 55 NL: 8.8E3 m/z= MS 45 alpdualid7_5m m t p6_2m m cl8th_ 9 NL: 8.8E3 m/z= MS 3 alpdualid7_5m m t p6_2m m cl8th_ Time (min) Time (min) x7~1 の感度 ( イオン透過効率 ) 向上 7 5 injections of Alprazolam ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive Quadrupole mass filter (Q1) 円柱面ではなく双曲面の四重極高分解能モードでも透過効率を維持 SIMモードによる定量 8 4

876 N=248,2 NL: 1.94E8 [15.-2.] 195.877 N=2,741 NL: 1.12E8 [19.1-2.

6 Hyperbplic Rods (Q1) 双曲面を持つ Hyperbolic Rods 分解能を上げても高い透過効率を維持 Quantum 円柱面を持つRound rod ユニット分解能プリカーサーイオンのアイソレーション :~m/z2,5 まで対応 SIM モードの測定 : 感度 (S/N) とダイナミックレンジの向上 HR/AM によるターゲット定量 9 Selected ion monitoring: Q1 mass filter Relative Abunda nce N=248,2 NL: 1.94E8 [15.-2.] N=2,741 NL: 1.12E8 [ ] Q1 filter: 1amu Sensitivity gain 5 1 x with SIM mode Full MS@m/z15 to 2, S/N = 745 SIM@m/z19 to 2 S/N = 5, ectrum) S/N (spe m/z195 Caffeine S/N (FMS) S/N (SIM1) 1 5

7 ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive HCD collision cell Predict AGC Prefilling + HCD-MS/MS 高感度 / 高速な MS/MS 測定 11 BSA 2fmol: m/z (.79ppm), z=3, MS/MS 12 MASCOT search result: MS tol.=1ppm, MS/MS tol.=.2da 6

8 BSA 2fmol: m/z (1.99ppm), z=2, MS/MS 13 MASCOT search result: MS tol.=1ppm, MS/MS tol.=.2da BSA 2fmol: m/z114. (.46ppm), z=3, MS/MS 14 MASCOT search result: MS tol.=1ppm, MS/MS tol.=.2da 7

9 ベンチップ型四重極 Orbitrap Q-Exactive Orbitrap detector 新しい FT プログラム : Enhanced FT 従来よりも 1.8 倍の高分解能 ( or 高速化 ) 15 静電場によるイオンのトラップ...Static charges can not be stable in electrostatic fields... Linear traps Segmented-ring traps Orbital traps 16 8

Orbitrap でのイオンの軌道 Characteristic frequencies:

oscillations ω r Frequency of axial oscillations ω z

r / 2 + R ln( r / )} m R m ω r = ω z 2 R m R k ωz = m

Electrodynamic Squeezing A.A. Makarov, Anal. Chem., v.

10 Orbitrap でのイオンの軌道 Characteristic frequencies: Frequency of rotation ω φ Frequency of radial oscillations ω r Frequency of axial oscillations ω z r z ω ϕ = ω z 2 R m R 2 1 φ k U ( r, z) = { z r / 2 + R ln( r / )} m R m ω r = ω z 2 R m R k ωz = m / q 2 17 Lord of the ion rings: リングの形成 Electrodynamic Squeezing A.A. Makarov, Anal. Chem., v.72 (2), No.6, p A.A. Makarov, US Pat. 5,886,346, Fast Injection 18 9

11 Lord of the ion rings: リングの維持 ω = k m / z 1. 周波数の決定はフーリエ変換を利用質量の情報へ 2. 高感度かつ高分解能を得るためにはイオンを持続的に運動する必要があるさらなる高真空度を要求 19 精密質量を妨害する要因質量の誤差 1) 装置の温度変化に対する観測質量のシフト測定時間 mass shift (m/z 524) vs. TIC 2) 検出器の飽和による観測質量のシフト ppm) deviation ( 質量の誤差 TIC イオン強度の増加 2 1

12 観測質量の精度はシグナル強度に依存質量誤差 (ppm) (ppm) deviation ( mass shift (m/z 524) vs. TIC TIC 強いシグナル Intensity 弱いシグナル R.T. 21 精密質量を妨害する要因の解決 1 ~ イオン量制御 ~ Auto Gain Control (AGC) MS スペクトルの観測を行う前にプレスキャン (~1msec) を行い予め溶出ピークのイオン量を確認し観測を行う際には適切なイオン量を導入ソフトウェアによる自動制御で実際の操作では全く気が付きませんイオン溜め込み時間イオン強度 Scaled TIC (counts) Injection Time (ms) Scan Number 8.E+8 7.E+8 6.E+8 5.E+8 4.E+8 3.E+8 2.E+8 1.E+8.E Scan Number Injection Time Scaled TIC 22 11

13 精密質量を妨害する要因の解決 1 ~ イオン量制御 ~ pm) deviation (p mass shift of m/z scan number AGC OFF mass shift (m/z 524) vs. TIC イオン量を制御していないとその強度の増減に影響して観測質量の誤差が生じてしまいます deviation (ppm m) TIC 23 精密質量を妨害する要因の解決 1 ~ イオン量制御 ~ pm) deviation (pp mass shift of m/z scan number AGC ON 制御されたイオン量範囲 mass shift (m/z 524) vs. TIC 適切なイオン量によって質量分析精度が向上 deviation (ppm m) TIC 24 12

14 設定分解能と測定時間の比較 Acquisition speed Hz Orbitrap + Enhanced FT 8 Orbitrap Resolusion 25 HCD-MS/MS: Prefilling in C-trap RP7k 256ms Full MS 17.5k 64ms MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS イオン貯め込み時間 (Sec) Full MS scan + Top1-MS/MS 測定のサイクルタイム (Sec) 26 13

Coli / Yeast のタンパク質還元アルキル化 (CAM) Trypsin 消化

3 Count only rank1 peptide, FDR<1% nanolc:easy

1x1mm, ODS (Easy column, Thermo scientific)

15 1 Full MS scan + Top1-MS/MS = 1 sec E.Coli tryptic digested 1 ug:nanolc-ms(3k)-ddtop1(17.5k) 27 サンプルおよび測定 / 解析 Method E.Coli / Yeast のタンパク質還元アルキル化 (CAM) Trypsin 消化 Proteome Discoverer 1.3, MASCOT ver2.3 Count only rank1 peptide, FDR<1% nanolc:easy nlc ( Thermo scientific) Trap column:.1x1mm, ODS (Easy column, Thermo scientific) Analytical column:.75x1mm, ODS ( 日京テクノス ) 移動相 A: 水 +.1% ギ酸移動相 B: アセトニトリル +.1% ギ酸グラジェント :-35%B(12min) Flow rate:3nl/min MS:Q-Exactive (Thermo scientific) Full MS scan:m/z3-15 (RP7k) ddtop1:hcd NCE3(RP17.5k) Charge state:z=2 and 3 Dynamic exclusion 28 14

四重極 Q1 による Isolation width の効果 E.Coli = 5 ng Iso width=2.

4 Input 51,746 51,644 52,12 PSM 1,851 1,838 1,43 Peptide 6,123

49 7 6 5 3 2 1 6,123 6,219 5,894 1,178 1,216 1,197 Isolation

4 Peptide ID Protein ID 29 同定ペプチドの質量誤差 :Isolation width =.

16 四重極 Q1 による Isolation width の効果 E.Coli = 5 ng Iso width=2. Iso width=.7 Iso width=.4 Input 51,746 51,644 52,12 PSM 1,851 1,838 1,43 Peptide 6,123 6,219 5,894 Protein 1,178 1,216 1,197 Average score ,123 6,219 5,894 1,178 1,216 1,197 Isolation Width = 2. Isolation Width = Isolation Width =.4 Peptide ID Protein ID 29 同定ペプチドの質量誤差 :Isolation width =.7 <15ppm :1,838 ( 1% ) <5ppm : 9,598 ( 88.56% ) <3ppm : 8,658 ( 79.89% ) Error ( ppm ) Number of peptide

Isolation width による同定タンパク質のオーバーラップ Isolation Width =

7 1,216 protein Mascot (B2) 53 12 12/1385 = 72.

54,276 PSM 5,45 6,515 6,92 11,13 Peptide 3,32 4,172

17 Isolation width による同定タンパク質のオーバーラップ Isolation Width = Mascot.4 (A2) 1,197 protein Isolation Width =.7 1,216 protein Mascot (B2) /1385 = 72.3% Mascot (C2) Isolation Width = 2. 1,178 protein 31 E.Coli タンパク質の同定結果 E.Coli 2 ng 5 ng 1 ng 5 ng Input 42,56 45,724 46,437 54,276 PSM 5,45 6,515 6,92 11,13 Peptide 3,32 4,172 4,345 5,815 Protein ,162 Average score ,815 6, 5, 4, 3,32 4,172 4,345 Peptide ID Protein ID 3, 2, ,162 1, 2 1 ng 5 2 ng 1 3 ng 5 4 ng 32 16

同定タンパク質の再現性 5ng 1 st run 897 protein 5ng

umber of Indentified Prote 5 1 ng 1 ng 1

18 同定タンパク質の再現性 5ng 1 st run 897 protein 5ng 2 nd run 885 protein 87/976 = 82.7% 5ng 1 st run 1,162 protein 5ng 2 nd run 1,176 protein 169/1272 = 84.% 33 微量プロテオーム解析 Yeast protein with reported cellular copy number* 6 ins Nu umber of Indentified Prote 5 1 ng 1 ng 1 ng Cellular Copy Number in Log-phase Growth Cells *Yeast cellular protein copy numbers are from Weissman and co-workers, Nature, 23, 16,

$微量プロテオーム解析 High confidence identification from 1 ng of Yeast Digest Extracted from: C:\Xcalibur\data\Zhiqi\ID_QE\211321_1ngYeastDigest_Top1_1min_1.raw #2348 RT: 77.42 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=645.$

19 微量プロテオーム解析 High confidence identification from 1 ng of Yeast Digest Extracted from: C:\Xcalibur\data\Zhiqi\ID_QE\211321_1ngYeastDigest_Top1_1min_1.raw #2348 RT: FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z= Da, MH+= Da, Match Tol.=2 mmu Intensity [counts] (1^3) y₁ y₂ y₃ LGNDDEVILFR D L MASCOT IonScore: 9 Exp Value: 3.8 E-9 b₅+-nh₃ y₄ y₅ y₆+-h₂o y₆ y₇ y₈ y₉ y₁₀ m/z Peptide of YOR2C, 149 copy number, identified from 1 ng yeast digest 35 測定条件 Method of Q Exactive FULL MS / DD-MS² (TOPN) General Polarity positive Full MS Microscans 1 Resolution 7, AGC target 1e6 Maximum IT 6 ms Number of scan ranges 1 Scan range 3 to 15 m/z dd-ms² / dd-sim Microscans 1 Resolution 17,5 AGC target 5e5 Maximum IT 8 ms Loop count 1 MSX count 1 TopN 1 Isolation window 2. m/z Fixed first mass 1. m/z NCE 3. Stepped NCE dd Settings Underfill ratio.1 % Intensity threshold 6.3e3 Apex trigger Charge exclusion unassigned, 1, 4-8, >8 Peptide match Exclude isotopes on Dynamic exclusion 3. s LOCK MASSES Positive Positive.75x12mm ODS column (Nikkyo tech) Sample サンプルは.1ug/uLと.1ug/uLとなるように.1%FAにて溶解希釈しましたサンプルは設定濃度となるように注入量を変えて測定を行っております 36 18

20 サンプル測定結果 (BPC)Isolation width の比較 RT: Relative Abund dance ng 1 st Isolation width nd Isolation width Time (min) NL: 1.37E9 Base Peak F: ms MS THP1_5n g_iso7_1 NL: 1.33E9 Base Peak F: ms MS THP1_5n g_iso2_8 37 サンプル測定結果 (BPC) サンプル濃度の比較 RT: Relative Abundance ng 5 ng ng Isolation width ng Time (min) NL: 1.9E8 Base Peak F: ms MS THP1_2ng_ iso2_14 NL: 2.98E8 Base Peak F: ms MS THP1_5ng_ iso2_16 NL: 9.8E8 Base Peak F: ms MS THP1_2ng _iso2_18 NL: 1.33E9 Base Peak F: ms MS THP1_5ng _iso2_

21 Percolator を使用した MASCOT 検索 39 各サンプル濃度における同定結果の比較 THP-1 5ng 2ng 5ng 2ng # of MS/MS 42,169 41,347 38,296 33,724 PSM 1,891 1,54 7,71 3,91 peptide hit 8,691 7,972 5,681 3,193 protein hit 2,91 1,875 1, ,691 7,972 # of peptide ,681 # of protein 5 3, ,91 1,875 1, ng 1 2ng 2 5ng 3 2ng 4 2

4 # of MS/MS 42,169 42,269 41,718 PSM 1,891

hit 2,91 2,48 1,849 9 8,691 8,21 # of peptide 8

41 Isolation width = 2. Isolation width =.7 Isolation width =.

22 Isolation width における同定結果の比較 THP-1, 5ng Isolation 2. Isolation.7 Isolation.4 # of MS/MS 42,169 42,269 41,718 PSM 1,891 1,435 8,62 peptide hit 8,691 8,21 6,522 protein hit 2,91 2,48 1, ,691 8,21 # of peptide ,91 2,48 1,849 6,522 # of protein 41 Isolation width = 2. Isolation width =.7 Isolation width = Qual / Quan proteome 解析 Target peptide quan 21

23 比較定量の手法タンパク質同定 & 発現量変動解析 Label Free SIEVE ラベル試薬 TMT, SILAC, itraq 43 Pierce Biotechnology is Part of Thermo Scientific TMT (Tandem Mass Tag) TMT reagent (229Da) Reporter Balance N-term and K ペプチドレベルでラベル化 N- 末端 / Kのアミノ基に結合多群間での比較定量が一度の分析結果から解析可能同定はMS/MSから定量もMS/MSスペクトルから解析 * * * * * * * * * * 126 Da 129 Da * * * * * * * * * * 127 Da 13 Da * * * * * 128 Da * * ** * 131 Da 44 22

TMT 試薬を用いたタンパク質発現変動解析 Cleavable Linker Mass Reporter Mass Normalizer Reactive Group タンパク質可溶化酵素消化 126-131 13-97 TMT126 (229Da) TMT reagent

: 2サンプルの比較 126, 127 (Normalizer : 99-1) TMT 6 : 6 サンプルの比較 126, 127, 128, 129, 13, 131 (Normalizer : 99-14) 1 9 MS/MS spectra 129.1374 13.

24 TMT 試薬を用いたタンパク質発現変動解析 Cleavable Linker Mass Reporter Mass Normalizer Reactive Group タンパク質可溶化酵素消化 TMT126 (229Da) TMT reagent (229Da) TMT 試薬のラベル化 TMT127 (229Da) TMT 試薬を用いたタンパク質発現変動解析 Cleavable Linker Mass Reporter Mass Normalizer Reactive Group TMT 2 : 2サンプルの比較 126, 127 (Normalizer : 99-1) TMT 6 : 6 サンプルの比較 126, 127, 128, 129, 13, 131 (Normalizer : 99-14) 1 9 MS/MS spectra TMT126 (229Da) m/z TMT127 (229Da)

25 TMT 試薬を用いたタンパク質発現変動解析 exp. ratio 1 : 2 : 4 : 6 : 8 : 3 obs. ratio 1 : 2 : 4 : 7 : 8 : Reporter ppm ppm ppm ppm ppm ppm ndance Relative Abu y b a b a b a 3 b y y b a m/z a 4 126~131 13~97 b 5 m/z Discovery Quan (TMT) accuracy and precision TMT reporter ion ratio Peptide level quan error <5% CV<13% observed expected 127/ / /126 13/ /126 Result from 8 ng E. Coli digest 48 24

Discovery Quan (TMT) - >97% of identified peptides were quantified Num mber of peptides at 1% FDR 1 9 8

of E. Coli digest 49 Accurate mass / High resolution MS での SIM 定量 Quadrupole mass filter (Q1) Multi

26 Discovery Quan (TMT) - >97% of identified peptides were quantified Num mber of peptides at 1% FDR ng ng 8ng 2ng 5ng unique peptide total IDed MSMS spectra quantifiable MSMS spectra Amount of E. Coli digest 49 Accurate mass / High resolution MS での SIM 定量 Quadrupole mass filter (Q1) Multi plex SIM 同時に最大 1 チャンネルを Q1 で選択 Orbitrap detector 新しい FT プログラム : Enhanced FT 従来よりも 1.8 倍の高分解能 ( or 高速化 ) 5 25

Selected ion monitoring: Q1 mass filter Relative

94E8 [15.-2.] 195.877 N=2,741 NL: 1.12E8 [19.1-2.

mode Full MS@m/z15 to 2, S/N = 745 SIM@m/z19 to 2 S/N

82 195.84 195.86 195.88 195.9 195.92 195.

27 Selected ion monitoring: Q1 mass filter Relative Abunda nce N=248,2 NL: 1.94E8 [15.-2.] N=2,741 NL: 1.12E8 [ ] Q1 filter: 1amu Sensitivity gain 5 1 x with SIM mode Full MS@m/z15 to 2, S/N = 745 SIM@m/z19 to 2 S/N = 5, ectrum) S/N (spe m/z195 Caffeine S/N (FMS) S/N (SIM1) 51 SIM によるペプチドターゲット定量 Q フィルターと高分解能 MS による SIM で高感度 / 高精度な定量 52 26

28 Exactive vs. TSQ Ultra - Calibration Curves Antifungal drug curves : LC-ESI-TSQ Ultra - MS Antifungal drug curves : LC-ESI Exactive - MS hydroxy-itraconazole Itraconazole Posaconazole Area Ratio Area Ratio Area Ratio mg/l Caspofungin mg/l Voriconazole mg/l Voriconazole-NO Area Ratio Area Ratio Area Ratio mg/l mg/l mg/l 53 SIM によるペプチドターゲット定量 ( Low matrix ) 1 ng Yeast に添加したペプチド標品の検量線 4.E+9 3.E+9 k Area) Log 1 (Peak S/N: > Low amole detection 4 orders of linearity CV<1% at 5amole SSAAPPPPPR* Peak Area 2.E+9 1amole 1fmole 1fmole Log 1 (Sample Amount) GISNEGQNASIK* 1.E+9 DIPVPKPK*.E+ R 2 : Sample Amount (fmole) 54 27

SIM によるペプチドターゲット定量 ( High matrix ) 1, ng Yeast に添加したペプチド標品の検量線 6E+8 5E+8 4E+8 rea) Log 1 (Peak Ar S/N: 2.

29 SIM によるペプチドターゲット定量 ( High matrix ) 1, ng Yeast に添加したペプチド標品の検量線 6E+8 5E+8 4E+8 rea) Log 1 (Peak Ar S/N: amol- 1fmol detection for most targets 3 to 4 orders of linearity NGFILDGFPR* Peak Area 3E+8 2E+8 1amole 1fmole 1fmole Log 1 (Sample Amount) GLILVGGYGTR* 1E+8 E+ R 2 : Sample Amount (fmole) 55 まとめベンチトップ型オービトラップ Q-Exactive によるタンパク質の大規模解析の評価を行いました新しいFTプログラム Enhanced FT によって高速な測定が可能なり 1MS+1MS/MS を 1 秒で観測することが可能でした Orbitrapの水冷式から Q-Exactiveでは空冷式に変更したものの質量精度は安定している結果が得られ <5ppmでの同定が可能でした繰り返し測定から同定されるタンパク質の再現性は8% 以上である結果を得ましたより発現量の少ないタンパク質の同定が可能な高感度分析が可能でした SILACやiTRAQ TMTなどのラベル化試薬を利用することにより大規模な同定結果と同時に比較定量結果を得ることが可能でした SIMでのターゲット定量では4 桁のダイナミックレンジで良好な直線性が得られることが判りましたまた複雑なマトリクス条件下においてもamolオーダーでの定量が可能でした 56 28

バイオ解析チーム教育セミナーMS04

バイオ解析チーム教育セミナーMS04 LTQ Orbitrap Shotgun proteomics Large scale proteomics by orbitrap technology. Thermo fisher scientific K.K SID C&MS Application OMICS Team TMT 2 Proteome Cell and Tissue Protein Peptide Extraction Protease