インドネシアで流通している複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群のイオンペアクロマトグラフィー分析本研究ではインドネシアで流通している複合ビタミ 9 CLASS-VP を使用したンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群の定量に適用可能な新たなイオンペアHPLC法を確立したので研修の講義４標

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ありさおえづか
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1 8 国立医薬品食品衛生研究所報告 Bull. Natl. Inst. Health Sci., 131, 第131号 13 Technical Date インドネシアで流通している複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群のイオンペアクロマトグラフィー分析宮崎玉樹堀嵜允文阿曽幸男奥田晴宏 Ion-pair HPLC analysis of B vitamins in syrup products in Indonesia Tamaki Miyazaki, Tadafumi Horisaki, Yukio Aso, Haruhiro Okuda A training course for analysis of B vitamins in syrup products was undertaken at the National Agency of Drug and Food Control at Jakarta as part of the project to deliver safe drugs to people in Indonesia by Japan International Cooperation Agency. Analytical methods have been developed for quantitative determination of B vitamins by ion-pair high-performance liquid chromatography using 1-hexanesulfonic acid sodium salt. Measurements were performed for two syrup products removed from a drug store in Jakarta to determine the amount of each vitamin B. The measured values of riboflavin -phosphate sodium, nicotinamide and pyridoxine hydrochloride were almost the same with those of nominal content for both products. While the measured values of thiamine hydrochloride, pantothenol and cyanocobalamin were approximately twice the amount of nominal contents. Keywords: B vitamins, ion-pair HPLC, syrup, Indonesia はじめにタミンＢ群塩酸チアミンリン酸リボフラビインドネシアでは公的病院や保険所などに供給されンナトリウム VB2 ニコチンアミドパントた医薬品が地域住民の医療を支えているしかし製テノール VB ピリドキシン塩酸塩シアノ造品質管理が不十分で品質の劣る医薬品あるいは偽コバラミン 2 の一斉定量法の設定を目的として医薬品の流通が問題になっており GMP査察や試験検行われた BPOMではインドネシアで流通している小査技術の向上など国家医薬品食品監督庁 BPOM にお児用複合ビタミンＢシロップ製剤の品質確保のため製ける品質確保および安全対策が喫緊の課題となってい剤中に含有されるビタミンＢ群の定量が試みられている独立行政法人国際協力機構 JICA によるインたしかし米国薬局方の Pyridoxine Hydrochlo- ドネシア安全な医薬品を届けるプロジェクトはその ride 各条に記載されている高速液体クロマトグラフィような相手国の薬事事情の改善を支援するため提言ー HPLC 法を参考にした分析条件により複合ビタミセミナー研修などを通じ BPOMおよび地方支所職員ンＢシロップ製剤の測定を行ったところ想定していたの医薬品管理に係る知識と技術の向上を目標としてい数以上のピークが観察されたこと各ピークの分離が不る今回 7年から５カ年計画で実施されている当該十分であったことなどから分析条件の設定に関してプロジェクトの一環としてジャカルタに本拠を置く JICAプロジェクトに技術協力が求められたそこで研 BPOMにおいて二週間の医薬品分析研修を行った修においてはイオンペアHPLC分析における溶離液中今年度の研修はインドネシアにおいて公的な試験法の有機溶媒の比率やイオンペア試薬の濃度カラム温度が設定されていない複合ビタミンＢシロップ製剤中のビなどの分析条件がビタミンＢ群のピークの分離に及ぼす影響について理論を講義した後実技演習を行ったし # To whom correspondence should be addressed to かし分離が不十分な成分があるうえ未知成分のピー Tamaki Miyazaki; Division of Drugs, National Institute クも検出されたことから研修期間中には分析条件を確 of Health Sciences, １-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, To- 立できなかったそこで帰国後当所においてフォト kyo 18-81, Japan; Tel: ext. 227; Fax: ダイオードアレイ検出器 PDA を使用して未知成分 ; miyazaki@nihs.go.jp の推定を行うとともに HPLC分析条件の改良を試みた

2 インドネシアで流通している複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群のイオンペアクロマトグラフィー分析本研究ではインドネシアで流通している複合ビタミ 9 CLASS-VP を使用したンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群の定量に適用可能な新たなイオンペアHPLC法を確立したので研修の講義４標準溶液の調製および検量線の作成で用いた参考データ作成のための基礎検討結果も含めて報告する各ビタミンＢ標準溶液の調製には試薬を用いた標準溶液の原液としてVB １は. mg/ml VB2 は4 mg/ ml は2 mg/ml VBは2 mg/ml は. mg/ 実験方法 ml 2は. mg/mlの水溶液を調製したリボフラ１試ビン標準溶液の原液はメタノール/水 1/2 混液で薬リボフラビンおよびp-ヒドロキシ安息香酸は試薬一級.6 mg/mlとなるように調製したビタミンＢ群のをブチルパラベンは液体クロマトグラフ用標準品を HPLCピークの分離に及ぼす測定条件の影響を検討する VBは試薬グレードの物を用いたメタノールは高速液際は各ビタミンＢ標準溶液の原液をHPLCの溶離液で体クロマトグラフ用をアセトニトリルはLC/MS用を使２倍希釈した単一成分溶液あるいは数種類の標準用した 1-ヘキサンスルホン酸ナトリウム 1-HexSO3Na 溶液の原液を適宜混合した溶液を用いたおよび1-オクタンスルホン酸ナトリウム 1-OctSO3Na シロップ製剤中の各ビタミンＢの定量に際しては標はイオンペアクロマトグラフ用を用いたリボフラビン準溶液の原液をHPLCの溶離液で希釈しそれぞれ下記と VB 以外のビタミンＢ VB2 の濃度範囲で５点検量線を作成した 2 およびその他の試薬は特級を使用した試薬類 VB１.2. mg/ml は全て和光純薬工業製であった水は超純水製造リボフラビンおよびVB2.1. mg/ml 装置 Millipore社製Direct-Q 3UV により精製した比.2. mg/ml 抵抗値が18.2MΩ cm以上の純水を用いた VB.2 1. mg/ml ２試料.1.mg/mL 2.2. mg/ml インドネシアの薬局から入手した小児用複合ビタミンＢシロップ製剤２種類 Becombion Syrup Becombion ５定量 Extra Lysine を試料とした含有されるビタミンＢ群シロップ製剤中の各ビタミンＢの定量は Table 1にの種類と mlあたりの含量の表示量は両製剤ともに示す３通りの条件で行った VBと2を定量する際はが mg VB2が2 mg が mg VBが3 mg 製剤原液を VB2 を定量する際はHPLCの溶が2. mg 2が3 μgであった離液で製剤を2倍に希釈した溶液をを定量する際は製剤を倍に希釈した溶液を試料溶液としその３装置 μlを高速液体クロマトグラフに注入した予め各ビタ高速液体クロマトグラフは島津製作所製のオンラミンＢの検量線作成過程で得られたピークの保持時間おインデガッサ DGU-12A 送液ユニット LC-ADVP よび保持時間においてPDAにより得られた紫外吸収スカラムオーブン CTO-AC PDA SPD-MAVP ペクトル UVスペクトルの情報を参考に試料溶液あるいは紫外可視検出器 UV-VIS SPD-A オーのクロマトグラム上でそれぞれのビタミンＢに相当するトサンプラー SIL-ADVP データ処理ソフトウェアピークを同定しその面積を求め予め作成しておいた Table 1 HPLC conditions used for B vitamins analysis Mobile phase (A/B) A: #3 7/3 9/1 9/1 ml acetic acid+1 L water, mm sodium phosphate buffer (ph 4.),.2 % phosphoric acid, mm 1-HexSO3Na mm 1-HexSO3Na mm 1-HexSO3Na methanol acetonitrile acetonitrile Column temperature 2 C 4 C 4 C Flow rate.8 ml/min 1. ml/min 1. ml/min 27 nm for, VB2, ; 27 nm for, VB2, ; 29 nm for ; 2 nm for VB 29 nm for 36 nm for 2 B: UV wavelength for detection

3 6 国立医薬品食品衛生研究所報告各ビタミンＢの検量線から試料溶液中の対象ビタミンＢ第131号 13 持時間には大きな影響が見られなかった濃度を求めたさらに得られたそれぞれのビタミンＢ Fig. 3にビタミンＢの保持時間に及ぼす溶離液中の濃度に希釈倍率を乗じて製剤中の濃度を算出し結果はイオンペア試薬濃度の影響を示す 1-HexSO3Naの濃度３回測定の平均値と標準偏差とを成分表示量に対する百が増加するとの保持時間が長くなり分率で示した特にの保持時間の遅れが顕著であったまたのピークのシンメトリー係数は1-HexSO3Na濃度の増加に従って減少し 1 mm: 2.4 mm: 1.7 mm: 結果と考察インドネシアのBPOMにおいて検討されていた分析条件は米国薬局方のPyridoxine Hydrochloride各条に記 1.2 mm: 1.1 mm以上の1-hexso3na濃度においてテーリングがほぼ抑制されることが示された載されている条件を参考にしておりオクタデシルシリイオンペア試薬を1-HexSO3Na mm から1-OctSO3Na ル化シリカゲル ODS を充填したカラムを用い mm に変えるとの保持時間は約２倍にの mmの１-hexso3naを含む酢酸水溶液酢酸 ml 水1 保持時間は約３倍になったは1-OctSO3Naをイオン L ph 2.8 とメタノールを７対３の割合で混合した液ペア試薬として用いると 9分までに溶出しなかったを溶離液としカラム温度は3 であるしかしこのさらに1-OctSO3Naをイオンペア試薬として用いると条件では一部のビタミンＢの分離が不十分なため溶離のピークはテーリングし 2のピークはブロード化液中のメタノールの比率 ph イオンペア試薬の濃度したしたがってビタミンＢの分析には1-OctSO3Na や種類カラム温度を変えてより良い条件を検討したよりも1-HexSO3Naが適していると考えられた Fig. 1に各ビタミンＢの保持時間に及ぼすメタノー Fig. 4にビタミンＢの保持時間に及ぼすカラム温度ル混合比の影響を示す溶離液中のメタノール混合比がの影響を示すカラム温度が低いほどクロマトグラム低いほどそれぞれのビタミンＢの分離はよくなったがの先頭付近に溶出すると2の分離がよくなった保持時間が長くなった一方溶離液のpHを変えると 3 で使用するよりもカラム圧が約2 MPa/cm2 増加しと2ではピーク形状と保持時間が変化したが Fig. 2 今回検討したpHの範囲内では他のビタミンＢの保 4 2 ph 2.1 ph 2.1 riboflavin 3 VB ph ph ph ph Methanol (ratio) Fig. 1. Effect of methanol on the retention time of B vitamins Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Mobile phase: A/B 4/1-13/7, A; mm phosphate buffer (ph 2.8) containing mm 1-HexSO3Na, B; methanol Flow rate: 1. ml/min Column temperature: 3 C Detector: UV-VIS nm Fig. 2. Effect of ph of aqueous mobile phase on the peak shape and retention time of and 2 Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Mobile phase: A/B 7/3, A; mm phosphate buffer containing mm 1-HexSO3Na, B; methanol Flow rate: 1. ml/min Column temperature: 3 C Detector: UV-VIS nm 22

4 インドネシアで流通している複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群のイオンペアクロマトグラフィー分析たが使用推奨最大圧力以下であったので成分分離の観 2 61 VB riboflavin 2 点から2 Cが適切と考えられた以上の検討をもとに選択した分析条件 Table 1 #１により測定したBecombion Syrupのクロマトグラムを Fig. に示す Becombion Extra Lysineにおいても同様のクロマトグラムが得られたピークの同定は保持 1 時間とPDA検出器で得られたUVスペクトルの比較により行った製剤に含まれる６種類のビタミンＢの中ではVB2が最も早く溶出しこのピークより前に溶出したピークは製剤中のビタミンＢ以外の成分あるいはインジェクションショックと推定されたまた VB2は図中で枠囲みした２本のピークに割れた検量線の作成時など標準溶液 1 を注入した場合も同様にピークが２本観察されたこと初めのピークの立ち上がり付近である保持時間2.7 min 1-HexSO3Na (mm) から２本目のピークトップのやや後保持時間3.1 min Fig. 3. Changes in the retention time of B vitamins with increasing the concentration of 1-HexSO3Na Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Mobile phase: A/B 7/3, A; ml acetic acid+1 L water containing 1- mm 1-HexSO3Na, B; methanol Flow rate: 1. ml/min Column temperature: 3 C Detector: UV-VIS nm までのUVスペクトルが同じ吸収パターンを示したことから両ピークをもってVB2 とみなした VB はVB2 とのピークの中間に保持時間を有するが nm以上の波長領域に特徴的な吸収を持たないことに比べて含有量が約1/と少ないことから本分析条件では定量できなかったの後に溶出する2については 23 2 C 3 C riboflavin VB C Fig. 4. Chromatograms of mixture of B vitamins measured under different column temperature Column: Shim-pack CLC-ODS M μm, 4.6 mm Mobile phase: A/B 7/3,A; ml acetic acid+1 L water containing mm 1-HexSO3Na, B; methanol Flow rate:.7 ml/min Column temperature: 2-4 C Detector: PDA 28 nm C

5 62 国立医薬品食品衛生研究所報告 VB 2 (3.3 min) 第131号 13 unknown (4.7 min) (.1 min) (not detected) (3.6 min) VB2 (3. min) Spectrum from syrup without dilution unknown (16.4 min) (26. min) (6.4 min) riboflavin (.1 min) benzoic acid (27.1 min) unknown (24. min) Fig.. Chromatogram of Becombion Syrup 2 times dilution under the HPLC conditions of Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Detector: PDA 27 nm Time in parenthesis is the retention time of each substance. Spectra in the left side are those obtained by PDA from standard solutions, and spectra in the right side are those from the sample solution. 標準溶液のクロマトグラムではほぼ対称な１本のピーク酸の一斉分析１の溶離液 mm 1-HexSO3Na が観察されたのに対し製剤のクロマトグラムでは２本を含む.2 %リン酸水溶液/アセトニトリル 9/1 を用のピークが観察された Fig. 6 PDA検出器で測定さいて分析したところ 2は標準溶液の原液を注入したれたUVスペクトルは２本のピークのどちらも37 nm 場合にも溶出が確認できなかった 2 は溶離液のpH 付近に2 に特徴的な吸収極大を示したが保持時間が低くなると保持時間が延長しピークがブロード化すが2 の標準溶液と一致しなかったため本分析条件る傾向がある Fig. 2 2 はpH 2付近において解では 2 の定量を行わなかった離状態の異なる分子種が共存することが報告されてい minには含有成分として表示されているビる２ mmの1-hexso3naを含む.2 %リン酸水溶液のタミンＢ群以外のピークが観測された.1 minのピー phは1.9であるためこの水溶液を用いた溶離液中ではクはリボフラビンであり VB2の不純物として含まれて 2 が種々の荷電状態を有する複数の分子種として存いたものかあるいはVB2の分解により生成したものと在しピークがブロード化して検出できなかったと考え考えられる VB2の表示量に対するリボフラビンの相対られた 2 はpH 4付近ではほぼ１種類の荷電状態を的な量は Becombion Syrupでは7.7±.3 % Becombion 示すことから 1-HexSO3Na mm を含むpH 4.の Extra Lysineでは6.±.1 %であった 27.1 minのピー mmリン酸ナトリウム塩緩衝液を用いた溶離液を検討しクは保持時間とUVスペクトルから安息香酸であるこた Table 1 #２この溶離液を用いて得られたクロとが確認された 24. minと26. minのピークも保存剤マトグラムをFig. 7に示す 2は他のビタミンＢや未に由来すると考えられるが保持時間とUVスペクトル知物質と完全に分離し 16.1 min に溶出したまたからパラベン類やp-ヒドロキシ安息香酸ではないことがの分離も良好であったただし VB2は明らかになった #１の分析条件の場合と同様図中に枠囲みで示した２ #１の分析条件ではVBと2の２つのビタミンＢが本のピークとなり VBのピークと重なった溶離液の定量できなかったためジーエルサイエンスが公表し組成比やカラム温度を調整してもVBと他のビタミンＢている複合ビタミンＢ VB2 パントテンとの分離を改善することができなかったため VBはジ

6 インドネシアで流通している複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群のイオンペアクロマトグラフィー分析 63 ーエルサイエンスが公表している溶離液 Table 1 #３を用いて定量することとした VBは紫外および可視領域における吸収が小さくシロップ製剤を希釈せずに注入しなくてはならなかったがのピークの裾に溶出した Fig. 8 今回選択した分析条件が異なるメーカーのODSカラムを用いた場合にも適用可能か用いるカラムをInertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm からShim-pack CLCODS M μm, 4.6 mm に変えて測定を行った Shim-pack CLC-ODS M では分析対象ビタミンＢ群の中で最後に溶出する2 の保持時間が9. min 検出される全ピークの中で最後に溶出する未知物質の保持時間が23.9 minとやや測定時間が短縮されたが各ビ 3 タミンＢと未知物質の溶出順序には変わりがなくそれ 4 ぞれのピークの分離も良好であった 6 #１ #２あるいは#３の分析条件により測定したインドネシアで市販されているシロップ製剤中の６種類の Fig. 6. Comparison of chromatograms for VB 12 in a standard solution solid line and in Becombion Syrup dotted line measured under the HPLC conditions of Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Detector: PDA 36 nm UV spectra were obtained by PDA at the retention time of each peak top. ビタミンＢの定量結果をTable 2に示す VB2 はほぼ表示どおり含有されていたと2については表示量の約２倍の値が得られたは溶離液の異なる２種類の分析条件下でほぼ同等の定量値が得られたこと PDA検出器によって測定されたUVスペ VB 26 VB2 unknown (4. min) (not detected) (2.9 min) (3.6 min) (26.4min) (3.7 min) benzoic acid (8.2 min) unknown (3. min) (23.3min) 2 riboflavin (17.9 min) (16.1 min) Spectrum from syrup without dilution Fig. 7. Chromatogram of Becombion Syrup (2 times dilution) under the HPLC conditions of Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Detector: PDA 27 nm Time in parenthesis is the retention time of each substance. Spectra in the left side are those obtained by PDA from standard solutions, and spectra in the right side are those from the sample solution.

7 64 国立医薬品食品衛生研究所報告第131号 13 クトルがピークの先端極大裾のいずれにおいても試薬のスペクトルと同じであり単一成分のピークで (2.9 min) あると確かめられたことから含有量が表示量の２倍であると考えられた 2については１種類の溶離液での定量結果であるが PDA検出器によって測定されたUV スペクトルが2 に特徴的なスペクトルであったこと VB から未知成分の妨害はなく表示量の２倍の2 が (3.6 min) 製剤中に含まれていると考えられた VB は Fig. 8の試料溶液におけるUVスペクトルからわかるように標準溶液では見られなかった27 nm付近の吸収が認めら VB2 れ約十倍量含有されるとの分離が不完全であることが考えられたまたカラム１での結果がカラム２での結果よりも低い傾向が見られたことからカラムの種類によってやその他製剤マトリクス由来の 2 3 成分との分離が異なる可能性が考えられたシロップ製剤の検体数を増やすなどして傾向と再現性を確かめる必要がある今回設定した分析条件#２と#３の併用をインドネシアで流通する複合ビタミンＢシロップ製剤中のビタミンＢ群の定量の in-house method として採用するため両分析条件についてインドネシアの試験機関 4 Fig. 8. Part of chromatogram of Becombion Syrup without dilution under the HPLC conditions of #3 Column: Inertsil ODS-3 3 μm, 4.6 mm Detector: PDA 2 nm Time in parenthesis is the retention time of each B vitamin. Spectrum in the left side is that obtained by PDA from standard solutions, and spectrum in the right side is that from the sample solution Nominal amount relativemeasured measured values of of B vitamins in syrup samplessamples Table 2Table Nominal amount andand relative values B vitamins in syrup Nominal amount (mg/ ml) VB2 2 VB Relative measured values against HPLC HPLC conditions column* nominal amount (%) Becombion Becombion Syrup Extra Lysine ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1..4 ±.3.4 ± ± ± ±.3 2. ± ± ± 1. # ± ± 1. # ± ± ± ±.4 1. ± ± ± ± ± ± ± ±.4 Relative measured values are the average ± standard deviation (n=3). * HPLC column used: Inertsil ODS-3 (3 μm, 4.6 mm); Shim-pack CLC-ODS(M) ( μm, 4.6 mm). 6

8 インドネシアで流通している複合ビタミン B シロップ製剤中のビタミン B 群のイオンペアクロマトグラフィー分析 6 (BPOMおよび地方支所) においてバリデーションを行うこととなった. その際, 分析条件 #3については, カラム温度や流速などの調整によりVB 3,VB,VB 2 の分離の改善を試みて, 最終的な分析条件を決定する予定である. 参考文献 1)InertSearchTM for LC, Inertsil Applications, Data No. LA28-2) nocobalamin&source=fp

本品約2g を精密に量り、試験液に水900mLを用い、溶出試験法第2法により、毎分50回転で試験を行う

本品約2g を精密に量り、試験液に水900mLを用い、溶出試験法第2法により、毎分50回転で試験を行うベンフォチアミン 138.3mg/g ピリドキシン塩酸塩 100mg/g シアノコバラミン 1mg/g 散 Benfotiamine 138.3mg/g Pyridoxine Hydrochloride 100mg/g and Cyanocobalamin 1mg/g Powder 溶出性 6.10 本品約 0.5g を精密に量り, 試験液に水 900mL を用い, パドル法により, 毎分 50 回転で試験を行う.