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ひろとしもね
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1 五十嵐研雑誌会 No /11/17 M1 山崎翔子酢酸菌の酢酸耐性はじめに酢酸菌は酸耐性をもつ偏性好気性菌でありアルコール脱水素酵素 (ADH) とアルデヒド脱水素酵素 (ALDH) を用いてエタノールを酢酸に部分酸化する能力をもつ酸耐性菌の多くは膜不透過の酸にのみ耐性を示す ( 細胞内の酸性化を防いでいる ) が酢酸菌は膜透過性である酢酸やエタノール存在下でも生育可能である例えば大多数の菌では酢酸濃度 0.5% で生育阻害が起こるが Acetobacter aceti の場合 6% まで生育可能であり細胞内 ph が 3~4 に低下しても生育を続けることができるまた Gluconacetobacter europaeus のように 10% の酢酸にも耐性を示すものも存在する酢酸への耐性機構については多くの研究がなされているが未解明の部分も多い以下に主に Acetobacter に関してこれまでに報告のあったものについて紹介する < 細胞内の酢酸の同化分解 > 酢酸酸化期の主なシステム? 1. TCA サイクルによる酢酸の同化分解 citrate synthase(aara) aconitase succinyl-coenzyme A (CoA): acetate CoA - transferase (aarc) が特に寄与している酢酸をアセチル CoA に変換する酵素の活性も酢酸酸化期に上昇する 2. 酸耐性酵素 3. 高活性酢酸耐性の PQQ ADH( 膜結合型 ADH) < 酢酸の排出 / 取り込み> エタノール酸化期の主なシステム? 4. プロトン駆動力依存排出ポンプ [A. pasteurianus] 5. putative ABC トランスポーター (AatA) < 酢酸の細胞内への侵入に対する防御 > 6. ペリクル形成 [A. pasteurianus] 7. 膜脂質細胞形態の変化 [A. pasteurianus, Ga. europaeus] 酢酸により phospholipids glycolipids PC PG PE CL 酢酸の透過性を下げる <ダメージ修復 > 8. 酸で誘導されるタンパク質群 SOS 応答ヒートショックプロテイン分子シャペロン等 1

2 このうち Succinyl-Coenzyme A (CoA): Acetate CoA-Transferase (AarC) と排出ポンプについての報告を取り上げる 1 報目 A Specialized Citric Acid Cycle Requiring Succinyl-Coenzyme A (CoA): Acetate CoA-Transferase (AarC) Confers Acetic Acid Resistance on the Acidophile Acetobacter aceti Elwood A Mullins, Julie A. Francois, and T. Joseph Kappock JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 190, No. 14, p (2008) A. aceti strain 1023 において酢酸耐性に関与する aarc が succinyl-coa synthase(scs) を代替する Succinyl-Coenzyme A (CoA): Acetate CoA-Transferase (SCACT) をコードしていることを示した論文 A. aceti strain 1023 の TCA サイクルは succinyl-coa synthetase とグリオキシル酸経路を持たず A. pasteurianus NBRC 3283 と同型であるこれはオーソドックスな TCA 回路に加えて succinyl-coa synthetase とグリオキシル酸経路を持つ A. aceti NBRC 14818( 本研究室で用いている A. aceti ) とは異なることを先に述べておく BACKGROUND A. aceti 1023 は酢酸濃度 50 mm 以上での生育に酢酸耐性遺伝子 aarabc を必要とする aara は NADH 非感受性の酸耐性 citrate synthase (CS) をコードしており aarb は細菌で広く用いられる情報受容伝達系であるホスホヒスチジンリン酸リレー系に関連する転写制御因子をコードしている AarC はいくつかの acyl-coa:carboxylate CoA transferase に類似しており酢酸同化に必要であることが分かっていた RESULTS 1-1. 本菌における ( 推察される ) 酢酸代謝の特徴 (fig. 1) ドラフトゲノム配列から A. aceti 1023 は TCA サイクルの 8 つの酵素のうち 6 つを所持し SCS と malate dehydrogenase(mdh) グリオキシル酸経路を持たないことが分かった Mdh を代替する膜結合型 malate:quinine oxidoreductase(mqo) が存在しており酢酸をアセチル CoA に変換する酵素 acetyl-coa synthetase(acs) acetate kinase(acka) phosphotransacetylase (Pta) も所持していたゲノム配列中には 5 つの CoA-transferase が含まれており aarc とアサインされなかった ucta~d であった 2

3 1-2. 酵素活性測定 (table 1) ゲノム配列から予測された通り TCA サイクルの酵素のうち 6 つの酵素と Mqo Succinyl-Coenzyme A (CoA): Acetate CoA-Transferase(SCACT) の活性が検出された SCS Mdh グリオキシル酸経路の酵素(isocitrate lyase と malate synthase) の酵素活性は検出されなかった (data not shown) 2. SCACT をコードする遺伝子候補の発現と活性スクリーニング SCACT の候補である ucta~d と aarc を E. coli 中で過剰発現させた (fig. 2) ところ UcdD もしくは AarC を産生する細胞のみに活性があった AarC は 5 つの CoA-transferase の中でもっとも可溶性が低いにも関わらず SCACT 特異的な活性は ucta~d よりも aarc を発現している細胞溶菌液でずっと高かった以上より SCACT は aarc 遺伝子単独からつくられていると思われた 3. AarCH6 の精製と性質 C 末端にヘキサヒスチジンを含むタンパク (His-tag) を融合させた AarC(AarCH6) はタグをつける前に比べてやや可溶性が低いものの活性はほぼ同じであった ESI-MS を用いた分析の結果 AarCH6 は 513 残基のタンパク質であったまた活性部位の配列より AarC はクラスⅠ CoA-transferase であると予測されたクラスⅠ CoA-transferase はまずアシル CoA 基質と結合してカルボン酸塩生成物と酵素 CoA 中間体を形成し次に CoA をもう一方のカルボン酸塩基質に転移するという反応機構をもつ 4. AarCH6 の動力学的解析各種基質における AarCH6 の動力学的解析を行った (table 2) CoA を添加した LCR アッセイ (TCA サイクルから見て逆向き反応の活性測定 ) より CoA は acetyl-coa の効果的な競合的阻害剤であることが示された速度 -acetyl-coa 濃度のプロットは剰余 CoA による阻害を考慮すると適当な結果であった (fig. 3B) CoA が競合的阻害剤であることは AarCH6 が予測通りの反応機構をもつことを支持するまた二重逆数プロットからも AarCH6 の反応はピンポン機構であることが確認された 5. 酢酸に関する動力学的パラメーターの ph 依存性ここでは acetate = 酢酸イオン acetic acid = 酢酸と表記する SCACT の真の基質は酢酸イオンであると予想される酢酸の pka 値 4.76 を下回る範囲では ph が下がるにつれて酢酸イオンのモル分率も減少する LCF アッセイで求められた kcat Km Ki, acetate の値はそれぞれ ph 8.0 のとき 280 s -1 70±20 mm 1600±780 mm ph6.0 のとき 147 s -1 51±11 mm 1100±310 mm ph5.0 のとき 49 s -1 29±8 mm 3

4 500±130 mm であった低 ph において基質阻害が強くなったのは酢酸のモル分率が多くなるためと考えられる (fig. 3A) DISCUSSION A. aceti は完全なしかしオーソドックスではない TCA サイクルを所持しており酢酸耐性タンパク質 AarC(SCACT) によってスクシニル CoA と酢酸をコハク酸とアセチル CoA に変換することが示されたこのバイパスは代謝を活性化し酢酸酸化を促進するまたある条件で必須な解毒化経路すなわち酢酸濃度が高く低 ph での生育には必須であるがたとえ低 ph であっても酢酸濃度が低いときの生育には必須でないを構成している SCACT を使用することで反応のはじめの酢酸のリン酸化やアデニル化が不必要となり遊離の CoA に対する要求性も減少する (fig. 1) したがって不可逆的酸化による酢酸の解毒が有利に進められると考えられる酢酸の異化について SCACT を含む TCA サイクルでは 1 分子の酢酸が 2 分子の CO2 に分解されると 8e - 分酸化されたことになる NAD + 等の補助因子の再酸化の速度が遅くなると還元力が余剰になり酢酸の TCA サイクルによる分解が抑制されるためたちまち細胞内に酢酸が蓄積してしまう補助因子の酸化には酸素が必要であるため高濃度の酢酸存在下での A. aceti の培養には積極的な酸素供給が必要であるまた多くのグラム陰性菌の CS は NADH や succinyl-coa に対するアロステリック酵素であり Mdh は生成物阻害に敏感である A. aceti は NADH 非感受性の CS(AarA) を持ち Mdh が Mqo で置き換えられているユビキノンを還元する Mqo は Mdh に比べ NADH /NAD + の影響を受けない A. aceti においてこれらの適応は酢酸ストレス下での酢酸異化の抑制を回避するためかもしれない動力学的特徴について A. aceti の野生株は 0.5 M 以上の酢酸中で生育可能であるが aar 破壊株は 50 mm でも生育不可能である酢酸の膜透過性に違いはないと考えられるので ~10-2 Mで酢酸の細胞質内酸化による除去が追い付かず致命的になると考えられる測定で得られた酢酸の Km 値はまさしくこの範囲であった Km 値付近では SCACT の速度は細胞質内の酢酸濃度と直線関係にあり酢酸が枯渇するにつれ減少した CONCLUSION A. aceti 1023 の aarc による生産物は SCACT であった SCACT は SCS をバイパスしており基質レベルのリン酸化を介さずに酢酸を取り込み CO2 として除去することを可能にしているまた CS(AarA) と Mqo と合わせて変則的な TCA サイクルと構成しておりこれは酢酸耐性と酢酸の同化分解に有利であると考えられた 4

5 2 報目 Putative ABC Transporter Responsible for Acetic Acid Resistance in Acetobacter aceti Shigeru Nakano, Masahiro Fukaya, and Sueharu Horinouchi APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 72, No. 1, p (2006) A. aceti 10-8S2 において酢酸によって誘導される ATP 結合カセット (ABC) トランスポーターと推定されるタンパク質 AatA が酢酸排出ポンプの機能を担う可能性と酢酸生産酢酸耐性に効くことを示した論文 RESULTS 1. A. aceti における酢酸によるタンパク質プロファイルの変化酢酸存在下 / 非存在下における A. aceti 10-8S2 の対数期 / 定常期の膜画分を二次元電気泳動で分析した (fig. 4) いくつかのタンパク質が酢酸によって誘導されいくつかはほぼ消失した酢酸により大いに誘導された見かけの分子量 60 kda のタンパク質を選んでさらなるキャラクタリゼーションを行った 2. aata のクローニングと塩基配列得られた ORF から計算された分子量は 65.5 kda であり二次元電気泳動の結果とよく一致していたこの ORF を以下に示す理由から aata(for acetic acid transporter) と名付けたコンピューターを用いたホモロジー検索により AatA は ABC トランスポーターに属すると予測されたなぜならば Walker A B や ABC signaturesⅠ Ⅱといった ABC トランスポーターによく保存された配列を含んでいたからである (fig. 5) アミノ酸配列アラインメントには排出ポンプやトランスポゾン切除に関係するタンパク質等のマクロライド耐性決定因子が含まれていたさらに AatA のハイドロパシー ( 疎水性親水性指標 ) は薬物トランスポーターと類似しており既知の膜貫通領域をもっていないことが示された (fig. 6) 以上より AatA は ABC スーパーファミリーに共通の構造を持つことが示された 3. aata 変異株の生理学的特徴 AatA の機能を解明するためクロムソーム上の aata を破壊した株 (m60k-1) を作製した AatA のアミノ酸配列はこのタンパク質は薬剤排出ポンプやトランスポゾン切除タンパク質とは違う機能を持つことを示唆していたなぜならばアミノ酸配列の相同性が非常に低かった ( それぞれ 18.7% と 35.4%) からである予測通り m60k-1 の種々の薬剤耐性は親株と同じであった (table 3) 次に ph を HCl で調整して m60k-1 の生育を調べた ph 3 ~6 において 24 時間の培養後の m60k-1 の生育は親株と変わらなかったしかし培地中の酢酸濃度が高くなるにつれ m60k-1 の生育は親株よりも抑制された (fig. 7) このこと 5

6 は AatA が酢酸耐性におそらく酢酸のトランスポーターとして関係していることを示している次に aata を挿入したプラスミド (pabc101) による m60k-1 の aata 相補株を作製したところ親株のレベルまで酢酸耐性が回復した A. aceti は酢酸を同化するため主な炭素源として酢酸を含む培地中での m60k-1 と親株の生育を比較した fig. 8 に示すようにほとんど同じ増殖率であり生育の上限も同じであったこのことにより AatA によって付与される酢酸耐性はおそらく酢酸同化の促進ではなく排出ポンプの機能によるものであると示唆された 4. aata の E. coli における発現 aata を E. coli で発現させた形質転換体 (E. coli(pabc101)) の酢酸耐性を調べた (fig. 9) コントロール株 (E. coli(pmv24): 元のベクターのみを導入 ) は酢酸濃度 0.5 g/l 以下でないと生育しないが形質転換体では 1.5 g/l まで生育可能であった一方で HCl を用いて ph を調整したときは A. aceti と同様に形質転換体とコントロール株の生育に差がなかった (data not shown) これらの結果によって AatA は A. aceti のみならず E. coli においても酢酸耐性を付与することがはっきりと示された 5. A. aceti による酢酸発酵への aata の過剰発現の影響 aata の過剰発現により高い酢酸濃度でも生育可能となり酢酸の収量が向上することが期待された pabc101 を A. aceti に導入して酢酸耐性を比較した期待された通り形質転換体は 20 g/l の酢酸存在下で生育可能でありコントロール株 (pmv24 のみ導入 ) は 15 g/l までであった次に両株の酢酸発酵のプロファイルを比較した形質転換体はわずかに生育が遅れたが増殖率はほとんど同じであった酢酸生成率 (acetic acid/liter/h) もほぼ同じであったがコントロール株が培地中の酢酸濃度 73.4±2.2 g/l で増殖が止まったのに対し形質転換体は 80.4±3.8 g/l でも増殖を続けていた形質転換体の酢酸の最終収量は 111.7±3.3 g/l とコントロール株の 103.7±1.8 g/l より高かった DISCUSSION AatA はタイプ B ABC トランスポーターに分類される既知のモノカルボン酸トランスポーターは ABC モチーフをもたずプロトン結合型の反応であると考えられておりまた 2005 年には A. aceti の別の株で酢酸排出ポンプの存在が報告されたがトランスポーター活性が ATP ではなく ph 依存であること脱共役剤感受性であることから筆者らはこのポンプはプロトン駆動力依存性であると結論付けているしたがって AatA はこれら既知のトランスポーターとは異なると考えられる酢酸耐性には少なくとも 2 つのメカニズムが関与している ;1 つは citrate synthase や aconitase のような酵素による酢酸の同化もう 1 つはトランスポーターによる酢酸の排出である酢酸同化の酵素活性を増強することはより多くの ATP を生産することにつなが 6

7 りその ATP が ABC トランスポーターの機能に使われるこのように 2 つのメカニズムは密接に関係しており酢酸応答に協調的にはたらいていると考えられる酢酸耐性メカニズムの全容を解明するためには二次元電気泳動で検出された酢酸で誘導される別のタンパク質の同定も必要である CONCLUSION aata 変異株は酢酸耐性が低くなり相補によって耐性が回復したまた aata を導入したプラスミドは E. coli に酢酸耐性を付与したさらに A. aceti に aata を過剰発現させることにより酢酸の最終収量が増加した以上より AatA は宿主に酢酸耐性を付与し酢酸排出機能をもつ ABC トランスポーターであると推定された感想自分のテーマに近い内容ということで酢酸菌の酢酸耐性について調べてみた感じたのは酢酸によっての発現量が増加した / が誘導されたやを壊したら酢酸耐性が減少したは入り口にすぎなくて何がどのように効いているのかの出口まで解明するのはなかなか難しそうだということちょっとした環境の変化にも多くの物質の様々な機能が絡み合って適応して生きているのだなと考えさせられました参考文献 : Cloning of Genes Responsible for Acetic Acid Resistance in Acetobacter aceti M. Fukaya et al J. BACTERIOL 1990, 172, 4, Structure of a NADH-Insensitive Hexameric Citrate Synthase tha Resists Acid Inactivation Julie A. Francois et. al BIOCHEMISTRY 2006, 45, Analysis of proteins responsive to acetic acid in Acetobacter: Molecular mechanisms conferring acetic acid resistance in acetic acid bacteria S. Nakano et al International Journal of Food Microbiology 2008, 125,

8 Fig. 3. Schematic representation of molecular machineries that confer acetic acid resistance in Acetobacter and Gluconacetobacter. Acetate, which penetrates the cytoplasm, is assumed to be metabolized through the TCA cycle or possibly pumped out by a putative ABC transporter and proton motive force-dependent efflux pump; this results in reduction in the intracellular acetate concentration. ADH and ALDH might serve to produce energy that is used for the function of the putative ABC transporter, as the enzymes in the TCA cycle do. Intracellular cytosolic enzymes are

PowerPoint プレゼンテーション

PowerPoint プレゼンテーション酵素 : タンパク質の触媒タンパク質 Protein 酵素 Enzyme 触媒 Catalyst 触媒 Cataylst: 特定の化学反応の反応速度を速める物質自身は反応の前後で変化しない酵素 Enzyme: タンパク質の触媒触媒作用を持つタンパク質第 3 回 : タンパク質はアミノ酸からなるポリペプチドである第 4 回 : タンパク質は様々な立体構造を持つ第 5 回 : タンパク質の立体構造と酵素活性の関係