Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製 サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析 レーザーによる固相中でのイオン化

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1 合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI MS の応用例 2. GPC/ API MS の応用例 27 Nihon Waters K.K. GPC/MALDI MS Matrixassisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は 複雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの 1 つであり bulk polymer の MS 分析に有用 応用分野 : (i) 平均分子量の測定 (ii) 末端官能基や繰返しユニットの測定 ( ユニットは重合体の性能の特性に重要 ) (iii) 生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター (iv)polymerisation 重合度の測定 27 Nihon Waters K.K. 2 1

2 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) サンプル調製 サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,1 to 1,1) Major advantage= ease of sample prep!! 質量分析 レーザーによる固相中でのイオン化 ソフトなイオン化 一般に 不揮発性高分子の(準) 分子イオン [MH] が最小のフラグ メンテーションで生成 o Proteins o Peptides o Oligonucleotides o Polysaccharides o Synthetic polymers 正 負双方のイオン化が可能 27 Nihon Waters K.K Nihon Waters K.K. 4 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) ショートレーザーパルス (12 ns) がターゲット に照射 窒素レーザーが一般的 337 nm 照射サイズ: ~11 mm レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され サンプ ルに穏やかに移行 ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが 直接 蒸発 イオン化 2

3 ポリマー分析における MALDI 法の制約 However, ダイナミックレンジ 高い多分散度がある重合体の正確な質量分布等 MALDITOF MS のテクニックには 制限あり 1.3 以上の多分散度のサンプル ( ほとんどの商品ポリマー ) では 紛らわしい平均分子量データとなる Detector response vs m/z 多分散サンプルにおける最適 matrix/sample ratio 設定の困難さ Multimer 形成と多価イオンによるシグナルの損失 単分散のサンプルの分析はこれらの制限を受けない 27 Nihon Waters K.K. 5 アプローチ 解決策は単分散フラクションに分画するために MALDI MS の前でサンプルを GPC (SEC) を使用してクロマト分離する MALDI MS の為のサンプルの GPC (SEC) 分離と溶離液分取 / 定着システムの開発 27 Nihon Waters K.K. 6 3

4 一般的手順 GPC (SEC) による単分散フラクションの分離により より簡便に MALDI MS 分析が可能 GPC 分離後 フラクションを分取 サンプルは precoated MALDI target プレート又は適当なマトリクス溶液を伴った mixed postcolumn に連続的に供与される レーザーが連続的に供与されるサンプルに照射され, 各部位のマススペクトルを取得 ソフトウェアは GPC 分画後の個々のスペクトルを結合し 分画前の元の多分散サンプルの分子量分布に補正 換算 27 Nihon Waters K.K. 7 Waters GPC/MALDI TYOF MS system for polymer characterisation Waters Micromass MALDI micro high performance MALDITOF mass spectrometer 27 Nihon Waters K.K. 8 4

5 GPC/MALDI MS 分析例 (Polylactide glycolide) 27 Nihon Waters K.K. 9 イントロダクション Poly(DLLactidecoglycolide) (PLG) はドラッグ デリバリーに使用される生物学的適合性と生物分解性ポリエステル 分子量データは性能の特性に関連するため重要 PLG polymers 通常は highly polydisperse (Pd>1.5) 分散型 PLG. への GPC 分画 / MALDIMS の応用 27 Nihon Waters K.K. 1 5

6 イントロダクション O O [ O CH C ] m [ O CH 2 C ] n CH 3 Figure. Poly(DLLactidecoglycolide) (PLG) PLG is a copolymer of lactide and glycolide. オリゴマーも分子量の複雑な混合物として存在 27 Nihon Waters K.K. 11 MALDI (No GPC) スペクトルが共重合体の組成情報を提供している間 正確な分子量分布が得られない Lactide Glycolide Copolymer MW: acid MW: mer Lactic acid: C 3 O 3 H Glycolic acid: C 2 O 3 H m / z PLG GPC 分画前の PLG の MALDI MS スペクトル 27 Nihon Waters K.K. 12 6

7 プロトコール Gel Permeation Chromatography (GPC) Column: Waters Styragel HR2 4.6 x 3 mm at 25 C HPLC Pump: Waters 616 pump with 6S controller Detector: Waters 41 Refractive index detector and 996 Photodiode array detector (PDA) Flow rate: Isocratic gradient of tetrahydrofuran (THF) at.3 ml/min for 6 min Injection volume: 2 ml LCMALDIprep Sample Collection Conditions Sample concentration: 1 mg/ml Sheath gas temperature: 125 C Nebulizer gas flow: 25 Foil: Dithranol 1 Time /with sodium salt Stage speed: 5 mm/min 27 Nihon Waters K.K. 13 PDA Arbitrary Y / Arbitrary X File # 1 : BASELINE GPC UV Chromatogram of PLG (Lactel) absorbance at 254 nm Overlay YZoom CURSOR Res=None GPC PDA chromatogram of the selected PLG copolymer at UV wavelength of 254 nm 27 Nihon Waters K.K. 14 7

8 GPC 分離による多分散 ( 分子量分布 ) の軽減 PLG copolymers GPC フラクションの溶出時間に伴う MS スペクトル m/z 各フラクションの分子量を結合することによって 未分画サンプル ( オリジナル ) の分子量分布を換算 27 Nihon Waters K.K. 15 MALDIMS MS data The polymer distribution is centered at about m/z=2, (MP) m /z MALDI target plate にスポットされたある GPC フラクションの MS スペクトルの 1 例 27 Nihon Waters K.K. 16 8

9 Isotopic clusters m /z 先のスペクトルの拡大. アイソトピック クラスター間の 14Da の差異は Lactide [OCH(CH 3 )C(O)] と Glycolide [OCH 2 C(O)] モノマーに起因 27 Nihon Waters K.K. 17 MALDI technology の利便性 MALDI 分析による the Poly(DLlactidecoglycolide) (PLG) polymer の GPC 分離の確認 GPC 分画を行う事で MALDIMS の弱点である多分散度のサンプルの問題を克服 27 Nihon Waters K.K. 18 9

10 GPC/ API MS API 大気圧イオン化法 (ESI, APCI) は 最も一般的な LC/MS イオン化法であり 比較的極性を有する低分子領域化合物の MS 分析に非常に適しています 応用分野 : (i) ポリマー添加剤の分子量測定 (ii) 末端官能基や繰返しユニットの測定 ( ユニットは重合体の性能の特性に重要 ) (iii) 生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター (iv) 極性ポリマーや低分子領域の重合度の測定 27 Nihon Waters K.K. 19 LC(RP)/UV & APcI chromatograms of polymer additives std_1 1 std_ : Diode Array e5 1. Tinuvin P 2. Irganox Tinuvin Tinuvin Tinuvin Irganox Irganox Irganox Irgafos 168 1: Scan AP BPI 1.13e Time 27 Nihon Waters K.K. 2 1

11 GPC/ API MS 分析例 ( Poly methyl methacrylate, PMMA ) CH 3 * C * H n 2 COOCH 3 27 Nihon Waters K.K. 21 Normal GPC (THF) SEC_PMMA1uv 1.e : Diode Array Range: SEC_PMMA1uv TIC e e2 6.e2 4.e2 2.e Time 27 Nihon Waters K.K

12 Scheme of MakeUp solvent Flow for API HPLC (GFC) Mobile phase: for SEC e.g.,thf, CHCl3 HPLC SEC Column(s) UV/PDA.31. ml /min. Make up pump (bilt in syringe pump etc.) T joint Make up sol.:for poler solution e.g., CH3CN, MeOH.3mL/min. MS (Qp singlems, ESI/APcI) 27 Nihon Waters K.K. 23 GPC/ API MS Mn776 8.e : Diode Array Range: e2 4.e e BPI 1.3e Time 27 Nihon Waters K.K

13 ESI at Low MW range Mn776 6.e2 4.e2 2.e : Diode Array Range: 6.814e2 Mn (7.795) (7.418) (7.21) e7 9.52e7 1.1e BPI e (6.966) (6.778) (6.628) e7 4.97e7 1.85e Time 317 (6.496) e m/z Nihon Waters K.K. 25 ESI mass chromatograms Mn776 5.e e e Time : Diode Array Range: 6.814e e e e6 Mn776 3: Diode Array Range: e e e e e7 Time 27 Nihon Waters K.K

14 ESI mass spectra 分子量分布 SEC_PMMA4_MS 3: Diode Array SEC_PMMA4_MS 244 (5.12) 5.46 Range: 1.857e e e e SEC_PMMA3_MS 3: Diode Array SEC_PMMA3_MS 39 (6.347) 5.67 Range: 1.469e e e SEC_PMMA2_MS 3: Diode Array SEC_PMMA2_MS 327 (6.687) 5.96 Range: 9.755e : Diode Array 346 (7.41) 6.49;215 Range: 6.814e e2 5.e2 2.5e Time e5 1.32e6 5.18e6 2.1e7 m/z 27 Nihon Waters K.K. 27 GPC elution (PDA/ESI, Map) 27 Nihon Waters K.K

15 GPC elution (ESI, Map) 27 Nihon Waters K.K. 29 質量分析計イオン化 (ESI( ESI&APCI) の原理 ESI キャピラリ 4 kv APCI 加熱 脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇 帯電液滴の生成イオン蒸発 コロナ放電により試薬イオンが生成 x xh M xh x M M x x x x Waters ESCi ESI/APCI の同時取込 キャピラリ コロナニードル 試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成 ( プロトン転移またはチャージ転移 ) M: サンプル分子 X:H2O や NH3 などの溶媒分子 27 Nihon Waters K.K. 3 15

16 GPC with ESCi (ESIAPcI) SEC_PMMA1_ESCi 8.e2 6.e2 4.e2 2.e : Diode Array Range: 3.34e SEC_PMMA1_ESCi ;426 TIC e SEC_PMMA1_ESCi 2: Scan AP BPI e7 SEC_PMMA1_ESCi 19 (7.481) SEC_PMMA1_ESCi 191 (7.538) e : Scan AP 1.87e Time m/z 27 Nihon Waters K.K. 31 まとめ GPC/MS を用いる事で 従来の溶出時間情報 ( クロマトグラム ) に加え 1. マススペクトルからの質量情報やフラグメント情報 2. 低分子領域における高感度化 3. 共重合体 (copolymer) におけるより正確な解析 等が可能となった 27 Nihon Waters K.K

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