HILIC 分析法開発のための実践的なアプローチ ~ 極性化合物保持に向けて ~ 日本ウォーターズ株式会社ソリューションセンターケミストリーテクノロジー 2012 年 2 月 2012 Nihon Waters K.K. 1 アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検

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かげたつももき
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1 HILIC 分析法開発のための実践的なアプローチ ~ 極性化合物保持に向けて ~ 日本ウォーターズ株式会社ソリューションセンターケミストリーテクノロジー 0 年月 0 Nihon Waters K.K. アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検討事項 HILIC 分析法開発ストラテジー結論 0 Nihon Waters K.K.

2 アウトライン HILIC の概要 HILIC とは HILICの利点どんな時にHILICを使用するか保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検討事項 HILIC 分析法開発ストラテジー結論 0 Nihon Waters K.K. HILIC とは? HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography ( 親水性相互作用クロマトグラフィー ) 順相と区別するために 990 年に新たに作られた造語 * HILIC 順相クロマトグラフィーの一種だがヘキサン等の水と混和しない溶媒は使用しない逆逆相または水系順相クロマトグラフィー固定相は高極性シリカ, ハイブリッド, シアノ, アミノ, ジオール, アミド高比率の有機溶媒 (> 80%) と低比率の水を含む移動相水 ( または極性溶媒 ) が溶出力の強い溶媒となる *Alpert, A. J. J.Chromatogr. 99 (990) Nihon Waters K.K.

HILIC の利点逆相では保持されない高極性化合物の保持極性の低いマトリックス成分の妨害が少ない逆相と相補的な選択性極性の代謝物 / 不純物 / 分解物が親化合物よりも強く保持するマススペクトロメトリーでの感度向上有機溶媒混合比の高い移動相 (> 80% アセトニトリル ) により ESI-MS の感度向上除タンパク (PPT) 上清を希釈なしにそのまま注入可能

3 HILIC の利点逆相では保持されない高極性化合物の保持極性の低いマトリックス成分の妨害が少ない逆相と相補的な選択性極性の代謝物 / 不純物 / 分解物が親化合物よりも強く保持するマススペクトロメトリーでの感度向上有機溶媒混合比の高い移動相 (> 80% アセトニトリル ) により ESI-MS の感度向上除タンパク (PPT) 上清を希釈なしにそのまま注入可能微量サンプルの分析が容易にサンプル前処理のスループット向上エバポレート / 再溶解のステップを省いて有機溶媒混合比が高い前処理 (PPT LLE SPE) 溶液をそのまま注入可能 0 Nihon Waters K.K. どんな時に HILIC を使用するか ESI MS Response nt excelle poor HILIC Normal phase Reversed phase どんな時にHILIC を使用するか : 親水性またはイオン性化合物の保持を向上させたい時極性またはイオン性化合物の MS 感度を向上させたい時有機溶媒抽出液の分析におけるサンプル前処理のスループットを向上させたい時 polar Compound Index non polar 0 Nihon Waters K.K. 6

4 アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴保持メカニズム保持 & 選択性マトリックス o 有機溶媒 o 固定相 o 移動相 ph 実際の分析時の検討事項 HILIC 分析法開発ストラテジー結論 0 Nihon Waters K.K. 7 HILIC の複合型保持メカニズム分配イオン交換水素結合の複合極性化合物は主に移動相一部水和相に分配されるチャージした化合物はシラノールおよび / または官能基と相互作用しイオン交換する極性化合物と固定相表面のシラノールが水素結合する D.V. McCalley, U. D. Neue, J. Chromatogr. A 9 (008) -9 E.S. Grumbach, D.M. Diehl, U.D. Neue, J. Sep. Sci. (008), -8 A. Méndez, E. Bosch, M. Rosés, U. D. Neue, J. Chromatogr. A 986 (00), - 0 Nihon Waters K.K. 8

5 保持 & 選択性マトリックス固定相 HILIC 保持 & 選択性移動相 ph 有機溶媒 0 Nihon Waters K.K. 9 アセトニトリル混合比の保持への影響 Retention Factor Silica Particle A Nicotinic acid Nortriptyline Cytosine Methacrylic acid % Acetonitrile アセトニトリル混合比 90% 以上で保持が急激に増大する N H Nicotinic Acid pka =.,.8 8 Nortriptyline pka = 0 H C H N N NH Cytosine pka =. CH H CH NH Methacrylic Acid pka.8 0 Nihon Waters K.K. 0

溶媒の選択性と溶出力の強さ Weakest Acetone Acetonitrile Primary 弱溶媒 [Weak] Solvents

極性化合物の保持を強めるために極性の低い溶媒を使用する 0 Nihon Waters K.

:EtH 90:: ACN:H :IPA 0 mm ammonium acetate with 0.

6 溶媒の選択性と溶出力の強さ Weakest Acetone Acetonitrile Primary 弱溶媒 [Weak] Solvents Isopropanol Strongest Ethanol Methanol Water Elution [Strong] 強溶媒 Solvents 極性化合物の保持を強めるために極性の低い溶媒を使用する 0 Nihon Waters K.K. 極性溶媒の保持および選択性への影響 90:0 ACN:H 90:: ACN:H :MeH 溶媒の極性を下げると保持が強くなる 90:: ACN:H :EtH 90:: ACN:H :IPA 0 mm ammonium acetate with 0.0% acetic acid Analytes: : methacrylic acid : cytosine : nortriptyline : nicotinic acid Waters K.K. Nihon 6

ACQUITY UPLC BEH Amide XBridge Amide ACQUITY UPLC BEH HILIC

7 保持 & 選択性マトリックス固定相 HILIC 保持 & 選択性移動相 ph 有機溶媒 0 Nihon Waters K.K. HILIC 分離のための固定相 Hybrid HILIC カラム (HILIC: ph 9 / Amide: ph- ) ACQUITY UPLC BEH Amide XBridge Amide ACQUITY UPLC BEH HILIC XBridge HILIC Silica HILIC カラム (ph ) Atlantis HILIC Silica 0 Nihon Waters K.K. 7

8 固定相の保持への影響 ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 0 mm,.7 µm シラノール活性の低い非修飾型ハイブリッド ACQUITY UPLC BEH Amide. x 0 mm,.7 µm 修飾型ハイブリッド Atlantis HILIC Silica. x 0 mm, µm シラノール活性の高い非修飾型シリカ 0 () acenaphthene () thymine () fluoroorotic acid () adenine () cytosine; UV nm 0 Nihon Waters K.K. 固定相の選択性への影響 N H C H H N N H Nicotinic Acid pka =.,.8 CH Methacrylic Acid pka.8 Nortriptyline pka = 0 CH NH NH Cytosine pka =. ACQUITY UPLC BEH HILIC ACQUITY UPLC BEH Amide nicotinic acid nicotinic acid Retention Factor 0 0 methacrylic acid nortriptyline cytosine Retention Factor 0 0 methacrylic acid nortriptyline cytosine % Acetonitrile % Acetonitrile 固定相の官能基が選択性に影響 0 Nihon Waters K.K. 6 8

保持 & 選択性マトリックス固定相 HILIC 保持 & 選択性移動相 ph 有機溶媒 0 Nihon

x 0 mm,.7 µm N ph 化合物. Methacrylic acid. Nortriptyline.

8 8 Nortriptyline pka = 0 H N N CH NH NH Cytosine pka =.

9 保持 & 選択性マトリックス固定相 HILIC 保持 & 選択性移動相 ph 有機溶媒 0 Nihon Waters K.K. 7 移動相 ph の保持および選択性への影響 ACQUITY UPLC BEH Amide,. x 0 mm,.7 µm N ph 化合物. Methacrylic acid. Nortriptyline. Nicotinic acid. cytosine ph 9 H Nicotinic Acid pka =.,.8 8 Nortriptyline pka = 0 H N N CH NH NH Cytosine pka =. H C H CH Methacrylic Acid pka.8 0 Nihon Waters K.K. 8 9

10 移動相 ph の保持および選択性への影響.0.0 一般的に化合物が解離した状態の方が保持が強い BEH Amide. x 0 mm,.7 µm r = 0.77 r = ln k (ph 9) r = r = Acids Bases rganophosphonates ther Fountain, et al., J. Sep. Sci. accepted. ln k (ph ) 0 Nihon Waters K.K. 9 移動相 phの MS シグナル強度への影響 ES+ ES Morphine Procainamide Thiamine Nortriptyline Diphenhydramine h i acyclovir Adenine fluorocytosine Cytosine Benzylamine IBMPA CMPA PMPA IMPA EMPA naphthalenesulfonic acid aminosalicylic acid salicylic acid fluorouracil Thymine Nicotinic acid Uracil ph 9 ph.00e+0.00e+06.00e+07.00e+08.00e+09.00e+0 Ion counts 0 Nihon Waters K.K. 0 0

11 保持および選択性まとめ移動相 ph 固定相 HILIC 保持 & 選択性有機溶媒溶媒の極性を下げると保持が強くなる保持と選択性変更を最大化するために複数のカラムでスクリーニング化合物が解離している場合 [ 酸性化合物は高 ph 移動相塩基性化合物は低 ph 移動相 ] に保持が強まる 0 Nihon Waters K.K. アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検討事項一般的なバッファおよび添加剤移動相調製カラム平衡化サンプル溶解溶媒 HILIC 分析法開発ストラテジー結論 0 Nihon Waters K.K.

12 分析を始める前に : 一般的な HILIC 移動相一般的なバッファ / 添加剤 * ギ酸アンモニウム酢酸アンモニウムギ酸水酸化アンモニウム酢酸有機溶媒混合比の高い移動相では析出する可能性があるためリン酸塩バッファの使用は避けた方が良い ( リン酸は問題無し ) 推奨バッファ濃度 : 0 mm 推奨添加剤濃度 : 0% 0.% * 移動相の有機溶媒混合比が高いため実際の移動相 ph は ph ユニット中性に近くなる可能性がある Canals, I.; umada, F. Z.; Roses, M.; Bosch, E. J. Chromatogr. A. 9 (00) 9 0. Espinosa, S.; Bosch, E.; Roses, M. Anal. Chem. 7 (000) Nihon Waters K.K. バッファ濃度の影響 : ph All contain 90:0 MeCN:H N AU , 0 mm ammonium acetate H Nicotinic Acid pka =.,.8 AU AU AU AU. Methacrylic acid. Nicotinic acid. Nortriptyline. Cytosine. mm ammonium acetate.0 mm ammonium acetate 0 mm ammonium acetate 0 mm ammonium acetate Nortriptyline pka = 0 Methacrylic Acid 0.00 pka Nihon Waters K.K. H C H N N NH Cytosine pka =. CH H CH NH

13 添加剤 vs. バッファ, 0.% ammonium hydroxide ph 9 ph 9 0 mm ammonium acetate ph 9 酸性化合物はバッファを使用しないと保持しない塩基性化合物の選択性は変わる % formic acid ph. Methacrylic acid. Nicotinic i acid. Nortriptyline. Cytosine 0 mm ammonium formate ph ph バッファを使用しない場合塩基性化合物はピーク形状が悪く保持しにくい酸性化合物の選択性は変わる All contain 90:0 MeCN:H 0 Nihon Waters K.K. 分析を始める前に : カラム平衡化および洗浄溶媒ニードル洗浄溶媒強洗浄溶媒 : 9: アセトニトリル : 水弱洗浄溶媒 / パージ溶媒 : 初期組成移動相 ( 塩添加剤バッファは添加しない ) 購入後カラムの初回使用時 0mM バッファまたは 0.% 添加剤を含むアセトニトリル / 水 0:0(BEH Amide の場合はアセトニトリル / 水 60:0 または初期組成移動相 ) を 0 カラムボリューム ( カラム容積の 0 倍 ) 流すカラム平衡化最初の組成の移動相を 0カラムボリュームム ( カラム容積の 0 倍 ) 流して平衡化するグラジエント分析時 8-0 カラムボリューム ( カラム容積の 8-0 倍 ) で再平衡化平衡化が充分でない場合保持時間の変動が起こることがある 0 Nihon Waters K.K. 6

14 分析を始める前に : サンプル溶解溶媒の影響サンプル溶解溶媒は試料溶解性とピーク形状に大きく影響する ( 逆相の場合と同様 ) サンプル溶解溶媒は少なくともアセトニトリル混合比 7% またはできるだけ初期組成の移動相に近い溶媒ただし極性化合物は有機溶媒中では溶解性が低いことが多い汎用のHILIC 溶解溶媒 7: アセトニトリル : メタノールはほとんどの極性化合物で使用可能試料溶解性とピーク形状の両方のバランスに優れている分析対象化合物によって調整 ( 溶解性を向上するために0.% ギ酸添加 ) % メタノールは溶解溶媒として極性が高すぎる場合もある 0 Nihon Waters K.K. 7 サンプル溶解溶媒の影響極性溶媒として水を使用 AU AU % H S ACN: 0 H S ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 00 mm,.7 µm Analytes. Methacrylic acid. Cytosine. Nortriptyline. Nicotinic acid サンプル溶解溶媒中のアセトニトリル混合比が高くなるとピーク形状が改善する AU ACN: H S 他の極性溶媒を使用した場合はどうでしょうか? Nihon Waters K.K. 8

15 サンプル溶解溶媒の影響極性溶媒としてメタノールを使用 AU AU 0.60 S 00% MeH ACN: 0 MeH S ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 00 mm,.7 µm Analytes. Methacrylic acid. Cytosine. Nortriptyline. Nicotinic acid 水をメタノールに換えることでピーク形状と試料溶解性が改善 AU ACN: MeH S サンプル溶解溶媒中のアセトニトリル混合比が高くなるとピーク形状が改善する Nihon K.K. Waters 9 アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検討事項 HILIC 分析法開発ストラテジー分析法開発スクリーニングアプローチアプローチの実践 : 実例最適化ステップ結論 0 Nihon Waters K.K. 0

16 適化ACQUITY UPLC BEH Waters HILIC スクリーニングストラテジー ph ph 9 ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 0 mm,.7 7 µm 最Amide. x 0 mm,.7 µm Atlantis HILIC Silica. x 0 mm, µm どこから始めるか? 最初のスカウティンググラジエントではアセトニトリル濃度を 9-0% ( 分 ) に設定少なくとも % の極性溶媒 ( 水またはエタノールなど ) 0 Nihon Waters K.K. 自動スクリーニング条件装置 :ACQUITY UPLC system with ACQUITY PDA and ACQUITY SQD カラム :ACQUITY UPLC BEH Amide,. x 0 mm,.7 µm ACQUITY UPLC BEH HILIC,. x 0 mm,.7 µm Atlantis HILIC Silica,. x 0 mm, µm 移動相 A:0/0 ACN/H with 0 mm HCNH and 0.% HCH, ph.0* 移動相 B:9/ ACN/H with 0 mm HCNH and 0.% HCH, ph.0* 移動相 A:0/0 ACN/H with 0 mm CH CNH and 0.0% NH H, ph 9.0* 移動相 B:9/ ACN/H with 0 mm CH CNH and 0.0% NH H, ph 9.0* グラジエント 99.9% B to 0.% B in min, reset (total run time = 6 min) 流速 : 0. ml/min 注入量 : µl サンプル溶解溶媒 :7/ ACN/MeH ( 溶解性のために0.% HCH 添加が必要な場合がある ) カラム温度.: 0 C 強洗浄溶媒 :9/ ACN/H サンプリングレート :0 points/sec 時定数 : 0. *00mM 水溶液のストックバッファの ph 0 Nihon Waters K.K. 6

17 分析法開発アプローチの説明各分離データを検討する際最適な ph 有機溶媒カラム選択のために下記質問を心に留めておく全てのピークを分離する必要があるかそれとも主要成分のみ分離すればいいのか? どのくらいの分離が必要か? どのくらいの保持が必要かまた保持のプロファイルは? テーリングファクターは? グラジエントがいいかそれともアイソクラティックか? Step : データを評価して ph を選択 Step : データを評価してカラムを選択 Step : 分離の最適化 / 微調整 0 Nihon Waters K.K. アプローチの実践 : 例 : 有機ホスホン酸 H C P H C H H C P H CH H P CH H C H C HC CH Cyclohexyl methylphosphonic acid (CMPA) isobutyl hydrogen methylphosphonate (IBMPA) Pinacolyl methylphosphonic acid (PMPA) C H P H H C CH H C P H CH Isopropyl methylphosphonic acid (IMPA) Ethyl methylphosphonic acid (EMPA) 0 Nihon Waters K.K. 7

18 低 ph での固定相選択性 : 有機ホスホン酸 BEH Amide, : SIR of Channels ES.e ph Atlantis ti HILIC Silica で最も保持が強い BEH HILIC,, : SIR of Channels ES.e6 BEH Amide と Atlantis HILIC Silica では同様の選択性が得られる Atlantis HILIC Silica, : SIR of Channels ES.e6 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 00 ng/ml each Nihon Waters K.K. 移動相 ph 選択性 : 有機ホスホン酸 ph, : SIR of Channels ES.e6 BEH Amide ph 9 でより高い感度が得られる ph によらず選択性は同様 ph 9, : SIR of Channels ES.e6 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 00 ng/ml each Nihon Waters K.K. 6 8

19 高 ph での固定相選択性 : 有機ホスホン酸 BEH HILIC, : SIR of Channels ES.e6 ph 9 BEH Amide でより高い分離度 BEH Amide : SIR of Channels ES,.e6 ピークとが分離していない更なる最適化が必要 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 00 ng/ml each Nihon Waters K.K. 7 分析法最適化ステップグラジエント勾配の調整カラム温度の調整カラム長と流速の調整グラジエントの代わりにアイソクラティックモードの使用 9: ACN:H with 0mM バッファまたは0% 0.% 添加剤移動相中の水の一部を極性の低い溶媒 ( メタノールエタノール IPA など ) に置換各ステップごとに結果を評価分析の成功基準に達したところでステップ終了ピーク形状 / 分離に問題がある場合は注入溶媒 ( サンプル溶解溶媒 ) を検討する 0 Nihon Waters K.K. 8 9

20 最適化ステップ : グラジエント勾配の調整, 99.9% to 0.% B in min SIR of Channels ES.e6 BEH Amide, ph , 99.9% to 0% B in min SIR of Channels ES.8e6 グラジエント勾配が緩やかになると分離が向上 % to 90% B in min SIR of Channels ES.e6 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 00 ng/ml each Nihon Waters K.K. 9 最適化ステップ : カラム温度 0 C SIR of Channels ES.e C SIR of Channels ES.08e6 BEH Amide, ph 9 緩やかな勾配のグラジエント温度が上昇すると分離が向上 C Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 0 Nihon Waters K.K. 0 SIR of Channels ES.0e6 00 ng/ml each 0

21 最適化ステップ : カラム長. x 0 mm SIR of Channels ES x. 00 mm SIR of Channels ES BEH Amide, ph 9 緩やかな勾配のグラジエント, 6 o C 00 mm カラムでは分離が向上 0 mm カラムでは分析時間が短い分析法の基準にあう結果を選択 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA ng/ml each 0 Nihon Waters K.K. 最終分析法 : 有機ホスホン酸 Compounds. PMPA. CMPA. IBMPA. IMPA. EMPA 00 ng/ml each Nihon Waters K.K.

22 迅速 HILIC 分析法開発スクリーニングアプローチ時間 c カラムコンディショニング * 0 minutes カラム phでのスクリーニング 0 minutes 最適化カラムコンディショニング [ 温度平衡化 ] グラジエント勾配および温度 0 minutes 0 minutes トータル分析法開発時間 Hours * 各 ph において平衡化およびブランク回注入 0 Nihon Waters K.K. 結論 HILIC の保持および選択性のために : HILICではACNを主溶媒 ( 弱溶媒 ) として使用水メタノールエタノール IPAが強溶媒固定相のチャージと結合相が保持と選択性に影響するイオン性分析種は解離した状態でより強く保持する ( 酸性化合物は高 ph 塩基性化合物は低 ph) 実際の分析時の検討事項 : 移動相 AおよびBには最低 0 mm バッファまたは0.% 添加剤の添加が推奨溶解性およびピーク形状のためにサンプル溶解溶媒は少なくともアセトニトリル混合比 7% 弱洗浄溶媒 ( ニードル洗浄 ) は高混合比の有機溶媒を含有 (90 9% ACN) 系統的なスクリーニングプロトコルによる効果的かつ効率的な HILIC 分析法開発種類のカラムの選択性種類の移動相 ph ACQUITY UPLC システムを用いた迅速自動分析法開発トータル分析法開発時間 : 時間 0 Nihon Waters K.K.

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untitled HILIC ILIC BEH BEH 009 9 0 5 009 ihon Waters K.K. HILIC HILIC HILIC MS Sub-µm 009 ihon Waters K.K. HILIC? HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography 990 * HILIC (> 80%) *Alpert A. J. J.Chromatogr.