化学発光酵素免疫測定法を原理とした新システム「AIAⓇ-CLシステム」について

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きよたつこうじょう
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1 特集 : 検査機器試薬技術の新たな展開 ( 第 26 回年次学術集会より ) 化学発光酵素免疫測定法を原理とした新システム AIA R -CL システムについて丸尾直子 Introduction of a new fully automated chemiluminescence enzyme immunoassay system called AIA-CL R system Naoko Maruo Summary This advanced chemiluminescence enzyme immunoassay system, AIA-CL system, has been developed with an innovative chemiluminescent substrate DIFURAT for use on a large model analyzer, AIA-CL2400, with single-use lyophilized reagents designated as the CL AIA- PACK. DIFURAT has high thermal stability, even in an aqueous solution, and enables sensitive measurement on the AIA-CL2400. Using DIFURAT and magnetic microparticles as immunoassay carriers, a more rapid and more sensitive assay for TSH has been constructed with less volume of specimen required as compared to the current AIA assay. Moreover, it has been confirmed that both TRAb and BNP assays on the AIA-CL2400 have better performance and therefore improve the clinical utility. The adjuster set and sample diluting reagent are supplied as a unique stable single-use lyophilized cup. These lyophilized cups are automatically reconstituted on the analyzer and free from operational errors. The AIA-CL system will provide a more useful and easy-to-use testing system for clinical laboratories. Key words: DIFURAT, CLEIA, AIA-CL, CL AIA-PACK, Lyophilized cup Ⅰ. はじめに近年超高齢社会にともない病院やクリニックの外来患者数が増加しており検査の感度精度はもちろんのこと迅速性や検体量低減経済性など検査室へ多種多様な要望がよせられている迅速検査というとかつては心疾患など緊急性の高い疾患の入院判断や術中検査負荷試験などが対象としてあげられていたしかし現在では外来迅速検体検査加算導入もあってホルモン検査や腫瘍マーカー検査にも迅速性が求められてきている自動測定装置の進歩に伴う検査時間の短縮化は多くの施設で院内診療前検査を可能にし患者が検査結果を持って医師の問診を受けることが可能となった実際に各種検査結果報告までのおおよその所要時間を患者向けに案内している施設も見られるまた臨床現場ではデッドボリュームを含めて0.3 ml 程度で複数項目の測定ができることが要望されている従って必要検体量の低減も大きな課題であるさらに測定項目によっては専門外来のある日に検体数が増えるなど検体数が曜日によって変動することがあるが必要時に必要数だ東ソー株式会社バイオサイエンス事業部東京都港区芝 TOSOH Corporation, Bioscience Division 3-8-2, Shiba, Minato-ku, Tokyo, , Japan

2 Vol. 39, No 4 (2016) け試薬を消費できるシステムはオーダー数の変動に対して対応しやすくコストの低減にも寄与できる可能性がある東ソー ( 株 ) は 1988 年にモノテスト包装凍結乾燥試薬を用いる全自動酵素免疫測定装置 AIA -1200と専用試薬 Eテスト TOSOH 試薬を上市し以来装置については処理能力を増やした大型機デスクトップ型中型機狭い検査スペースに対応する小型機をラインアップするとともに試薬項目ラインアップを拡充してきた現在使用されているEテスト TOSOH Ⅱ 試薬はモノテスト包装で反応に必要な成分が1つのカップ内に凍結乾燥状態で封入されており使用直前まで溶解されないため比較的試薬が安定で分注誤差が生じにくい仕様であったただし使用している標識用酵素アルカリ性ホスファターゼの検出に蛍光基質 (4 メチルウンベリフェリルりん酸 ) を用いていたこと及び1ステップ型の反応原理であったところから測定範囲が狭い感度が化学発光法に及ばない項目があるなどの課題があったこのたびモノテスト凍結乾燥試薬の形は継承したうえで検出方法を蛍光法から化学発光法とし磁性微粒子を用い多くの項目で2ステップ法を採用した試薬を搭載できるAIA -CL システムが新たに開発され感度精度迅速性の向上と測定範囲の拡大や使用検体量の低減をはかることが可能となったさらに使いやすさ経済性なども考慮した設計を行ったので以下報告するを原理としており標識酵素としては従来の AIAシステムと同様にアルカリ性ホスファターゼを使用している今回アルカリ性ホスファターゼを検出する新しい化学発光基質として安定性の高いジオキセタン化合物である DIFURAT (3-(5-tert-ブチル-4,4-ジメチル-2,6,7- トリオキサビシクロ [3,2,0] ヘプト-1-イル ) フェニルリン酸エステルジナトリウム塩 ) が開発された DIFURAT の構造式とアルカリ性ホスファターゼによる分解反応を図 1に示すジオキセタン構造はゆがんだ四員環であり O-O 結合がねじれて切れやすいため安定性の維持が難しい DIFURATはジオキセタンにフラン環を導入し加えてかさ高い置換基の立体反発を利用することでねじれを緩和し構造を安定に保つことが可能となっており 1),2) 結果として溶液での供給が可能となった溶液での安定性を40 の加速劣化試験と10 での長期安定性試験で確認したところ図 2に示すように40 で30 日間 10 で12 ヶ月間まで安定であることが確認されたさらに発光条件の最適化を行うことで市販発光基質と比較して発光 Ⅱ. AIA-CL システムについて AIA-CL システムは化学発光酵素免疫測定法図 1 DIFURAT 構造式 ( 上 ) とアルカリ性ホスファターゼ (ALP) による基質分解反応 ( 下 ) 図 2 DIFURAT の 40 における安定性 ( 左 ) と 10 における長期安定性結果 ( 右 )

効率を高くすることが可能となった 3) AIA-CLシステムの大型機種である全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA -CL2400( 図 3) は最大 240テスト / 時の処理能力を有している試薬及び基質の保冷機能分注水及び洗浄水の自動調製機能を有しており分注水洗浄水は濃縮液を装置内に設置すれば装置内で分注水洗浄水が自動調製されるため工数削減とともに一定品質の分注水

3 効率を高くすることが可能となった 3) AIA-CLシステムの大型機種である全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA -CL2400( 図 3) は最大 240テスト / 時の処理能力を有している試薬及び基質の保冷機能分注水及び洗浄水の自動調製機能を有しており分注水洗浄水は濃縮液を装置内に設置すれば装置内で分注水洗浄水が自動調製されるため工数削減とともに一定品質の分注水洗浄水を装置に供給することができるという利点がある基質のバックグラウンド測定及び分注水洗浄水の品質確認は日常点検時に行うがこの日常点検は予約実行が可能であり測定の少ない時間帯に予約することで効率的に終了させることができる本システムの測定モードとして 2ステップ法 ( 第一反応 5 分第二反応 3 分 ) ディレイ1ステップ法 ( 第一反応 6 分第二反応 3 分 ) およびこれらの第一反応が15 分 ( ディレイ1ステップ法では16 分 ) に延長されるロング法が搭載さ図 3 全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA-CL2400 れている測定に用いる専用の反応試薬については 2 つのセルからなるマイクロツインカップを用いた新たな試薬形態を採用している図 4にAIA- パックCL TSHの測定原理図を示す反応試薬の試薬カップには2つのセル ( セル (1) セル(2)) がありセル (1) には磁性微粒子に固定化された抗 TSHマウスモノクローナル抗体を含む凍結乾燥体がセル (2) には酵素としてアルカリ性ホスファターゼが標識された抗 TSHマウスモノクローナル抗体の凍結乾燥体が封入されており封入シールにはQRコードが印刷されている試薬カップのセル (1) に分注水と検体をセル (2) には分注水を加えそれぞれ凍結乾燥試薬を溶解し検体が注入されたセル (1) においては凍結乾燥試薬が溶解すると同時に第一反応が開始する一定時間一定温度でインキュベートした後洗浄水で洗浄することにより未反応の検体成分を除去する (B/F 分離 ) B/F 分離後セル (2) の内容物を一定量セル (1) に移すことにより第二反応が開始し一定時間一定温度でインキュベートした後洗浄水で洗浄することにより未反応の酵素標識抗体を除去する (B/F 分離 ) B/F 分離後磁性微粒子に結合した酵素活性を測定するために基質としてDIFURATを添加し酵素による分解で得られる発光強度を測定することにより検体中のTSH 濃度を算出する反応固相に磁性微粒子を用いたため抗原抗体反応の速度が上昇しており AIA-パックCL TSHの場合第一反応 5 分第二反応 3 分で測定可能十分量の抗原抗体複合物が生成されるアルカリ性ホスファターゼ反応による基質分解で生成する発光測定は 4 分であり B/F 分離時間を含め測定開始からの図 4 AIA- パック CL TSH 測定原理図

4 Vol. 39, No 4 (2016) 結果報告時間は15 分となっている本装置はマスターキャリブレーション対応である測定者は較正試薬を用いてマスターカーブを補正し検量線を作成する AIA-パック CL TSHの場合較正試薬セットは2 濃度からなり較正有効期間は90 日となっている較正試薬も凍結乾燥カップ形状になっており反応試薬といっしょに装置の試薬ソーター内にセットすることができる較正実施時には装置内で必要量の較正試薬が分注水により溶解され較正溶液となり使用される検体希釈試薬も同様に検体希釈に必要な成分がマイクロツインカップ内に凍結乾燥体で封入されており必要時に分注水で溶解されて装置内で検体希釈液が調製される続いてあらかじめ設定された希釈倍率に従って必要量の検体が分注され希釈検体が装置内にて調製される検体希釈試薬は複数項目で共通の設計となっており希釈倍率としては4 ~ 625 倍の間で設定が可能であるこのような較正試薬検体希釈試薬の装置内自動調製は手作業による誤調製取り違えなどの人為的ミスを防ぐことができまた必要量だけを調製するため試薬のムダを少なくすることができる凍結乾燥試薬形態での較正試薬検体希釈試薬は溶液の蒸発やコンタミネーションの不安がなく未開封であれば13 ヶ月開封後装置に設置してからも180 日間使用可能と安定性に優れているさらに較正試薬と検体希釈試薬はどちらも分割トレイを採用しており共通トレイ上に異なる項目の較正試薬や検体希釈試薬の試薬ストリップを組み合わせて設置することが可能であり試薬ソーター内の試薬設置スペースを減らす工夫がなされている反応試薬較正試薬検体希釈試薬は試薬トレイだけでなく試薬ストリップ及び個々のカップのシールにもQRコードが印刷されており装置上の各カップの位置認識に役立つだけでなく項目名やロット有効期限オンボード日数などの情報を使用前にコントローラー画面上で確認することが可能であるさらに測定後のデータから測定に用いた試薬ロットなどの情報をレビューすることも可能でありトレーサビリティを確保した設計となっている Ⅲ. 試薬性能の紹介 AIA-パックCL 試薬項目の中から以下の3 項目について性能を紹介する 1.TSH( 甲状腺刺激ホルモン ) AIA-パックCL TSHは必要検体量 50μL 結果報告時間 15 分の測定試薬であり基本性能についてはすでに既報にて報告されている 4),5) 社内で取得したプレシジョンプロファイルを図 5に示すが CV 20% を与える濃度は従来試薬 Eテスト TOSOH Ⅱ(TSH) で0.0080μIU/mL 今回開発されたAIA-パックCL TSHでは μiu/mlとなり両者とも第三世代の感度を有していたが AIA-パックCL TSHはさらに高感度化されていることが示されたまた AIA- パックCL 試薬においては TSH FT3( 検体必要量 20μL) FT4( 検体必要量 5μL) の3 項目を測定するに必要な総検体量は75μLであり従来試薬 Eテスト TOSOH Ⅱ(TSH) の1 項目分の必要検体量 (100μL) を下回ることが可能となった高齢者や乳幼児患者の検査においては採血が容易でなく十分な検体量が確保できないことはよく経験されることであり検体量の低減は臨床現場で有益であると考えられる甲状腺疾患別のTSH 濃度分布図を図 6に示す健常人 (n=25) に比べ甲状腺機能低下症 (n=30) ではTSHが上昇しており他方甲状腺中毒症であるバセドウ病 ( 未治療 )(n=26) 及び無痛性甲状腺炎 (n=22) 亜急性甲状腺炎 (n=21) では値が低下していることが確認されたさらに図 5 AIA- パック CL TSH 定量限界

5 図 6 健常人及び各種甲状腺疾患における TSH 値今回検討症例数は少ないものの破壊性甲状腺炎に比べてバセドウ病ではTSHの値がより低い 6) 傾向が認められた森田らの報告において破壊性甲状腺炎における測定感度以上のTSH 測定値の割合がバセドウ病の場合より著しく高いことが示されておりこの理由として破壊性甲状腺炎ではバセドウ病に比べ急激なホルモン増加に対する下垂体の反応が遅れTSH 抑制が不完全であるとの考察がなされている他方現在市販されているTSH 測定試薬 6キットを評 7) 価した報告ではバセドウ病亜急性甲状腺炎無痛性甲状腺炎の間でTSH 値分布に明確な傾向が認められず甲状腺中毒症の鑑別診断の補助としてTSHの抑制の程度を用いることは困難であると報告されている AIA-パックCL TSHで得られた結果は症例数こそ少ないが森田らの報告と同様にバセドウ病に比べ破壊性甲状腺炎のTSH 値が高い分布傾向となっており測定法の感度が向上したことにより破壊性甲状腺炎のTSHを精度よく測定できた結果バセドウ病との測定値分布の違いが生じた可能性が考えられたこの点については今後症例数を増やした詳細検討が必要と考える 2.TRAb( 抗 TSH レセプター抗体 ) AIA-パックCL TRAbは検体量 40μL 結果報告時間 25 分 ( 第一反応 15 分第二反応 3 分のロング法を採用 ) の測定試薬であり抗 TSHレセプターヒトモノクローナル抗体 (M22) を用いた2ステップ競合法を測定原理としている本試薬の基本性能については AIA-パックCL TPOAb AIA-パックCL TgAbとともに既報にて報告されている 8) 測定に必要なTSHレセプターは磁性微粒子に固定化されマイクロツインカップ内に凍結乾燥状態で封入されており測定直前まで溶解されないため安定であるそのため本試薬においても較正有効期間を90 日とすることが可能となった甲状腺疾患別のTRAb 測定結果を図 7に示す甲状腺ホルモン正常エコー正常である健常人 94 例ではすべて値が0.9 IU/L 未満であったがバセドウ病では高値を呈しており鑑別診断におけるTRAbの有用性が示されたまたバセドウ病 77 例と無痛性甲状腺炎 22 例の鑑別につき ROC 分析を行ったところ TRAb 0.7 IU/Lにおいて感度 100% 特異度 95.5% で最も高い診断効率を示し特異度 100% となる値はTRAb 1.2 IU/L( 感度 94.8%) であったただし今回の検討における症例数が少ないことからカットオフ値については今後さらに症例数を増やした研究の成果で決められるべきであると考える日本甲状腺学会が作成している甲状腺疾患診断ガイドラインの中にバセドウ病の診断ガイドラインがありこの中の検査所見の項にお

6 Vol. 39, No 4 (2016) 図 7 健常人及び各種甲状腺疾患における TRAb 値いては甲状腺関連ホルモンに加え抗 TSH 受容体抗体 (TRAb, TBII) 陽性または刺激抗体 (TSAb) 陽性の場合確からしいバセドウ病と判断し治療を開始しても良いとされている以前から甲状腺関連ホルモン項目に比べTRAb は測定に時間を要する項目でありどちらかというと事後確認の位置づけの検査であったが自動測定系の進歩で院内測定が可能なレベルまで測定時間が短縮されてきた TRAb 値が来院当日中に得られることで確からしいバセドウ病として治療を開始できることあるいは TRAb 値を見ながら抗甲状腺薬の投薬量を調節できることは患者にとっても医療側にとってもメリットが大きいさらに本試薬のように結果報告時間 25 分であれば診療前検査としての TRAb 測定も実施可能であり患者の来院回数待ち時間を減らし患者の症状や病態にあった的確な処方につながるため甲状腺診療への貢献が期待できる 3. BNP( 脳性ナトリウム利尿ペプチド B-タイプナトリウム利尿ペプチド ) AIA-パックCL BNPは検体量 10μL 結果報告時間 15 分の測定試薬である表 1に示す通り 2ステップ法を採用したこと磁性微粒子を用いることで従来試薬であるEテスト TOSOH Ⅱ(BNP) の測定時間 19 分に比して測定時間の短縮化がはかられ測定範囲の拡大がなされている較正有効期間はAIA-パックCL TSH 同様 90 日である表 1 BNP 測定試薬比較表

7 本試薬の性能データとしてプレシジョンプロファイルを図 8に示すが 10% CVとなる濃度は0.85 pg/mlと従来試薬の3.0 pg/mlと比して高感度化が達成されているまた図 9に示すように従来試薬との相関が良好であることが確認されている 9) 測定範囲上限の5,000 pg/mlへの拡大は検査現場において再検数の低減へつながることが期待されるまた本試薬では測定範囲下限も従来の4.0 pg/mlから2.0 pg/mlになり上述のように低濃度域の精度が向上している BNP 及びNT-proBNPの血中濃度は Body Mass Index (BMI) と逆相関することが以前より報告されていたが 10) 近年になって血中遊離脂肪酸濃度と心臓のBNP 産生量の間に逆相関関係が報告され肥満さらにインスリン抵抗性との関連についても考察されている 11) 加えて男性では低 BNP 濃度が安定虚血性疾患のリスク因子となっていることも報告されており 12) 今後メタボリックシンドロームとの関連において低濃度 BNP 値の臨床的有用性について研究が進展することが予想される臨床現場での心不全の診断病態把握経過観察や予後予測への貢献はもちろんのこと循環器分野での臨床研究における BNP 測定にも高感度化したAIA-パックCL BNPが貢献できる可能性があると考えられる Ⅳ. まとめ AIA-CLシステムは化学発光基質 DIFURAT を用いた化学発光酵素免疫測定法を原理とし専用試薬として磁性微粒子を用いたモノテスト凍結乾燥試薬であるAIA-パックCL 試薬を使用することで従来よりも高感度化使用検体量の低減測定時間の短縮化などを達成することができたさらに凍結乾燥技術をベースに反応試薬だけでなく較正試薬検体希釈試薬の凍結乾燥カップ形態での製品化を実現し各試薬の保存安定性を高め有効期限切れによる廃棄量の削減など経済性も考慮した設計を実施した今後はさまざまな現場のニーズに対応し外来患者の院内診療前検査や入院患者の病態管理に適応できるように測定項目の拡充とさらなる性能向上に努めていきたいと考えている謝辞図 8 AIA- パック CL BNP 定量限界 AIA-パックCL TSH AIA-パックCL TRAbなどの甲状腺関連測定試薬開発においてご指導いただきました岡本甲状腺クリニック岡本泰之先生浜田昇先生に深く感謝いたします図 9 BNP 従来試薬との相関参考文献 1) 松本正勝 :CIEEL 型高効率化学発光基質の設計と合成. 有機合成化学協会誌, 61: , ) 松本正勝, 渡辺信子, 小林久子ほか : 特許公報第号, ) 山田雅士 : 公開特許公報 , ) 早川明子, 山口ひろ子, 水本好美ほか : 全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA-CL2400を用いた TSH FT4 FT3 測定の基礎的検討. 日本臨床検査自動化学会会誌, 40 : , ) 井上直哉, 畑伸顕, 兒嶋嵩ほか : 全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA-CL2400によるTSH

8 Vol. 39, No 4 (2016) FT3 FT4 測定試薬の基本性能評価. 医療と検査機器試薬, 39 : 47-56, ) 森田新二, 河合岳郎, 池田直子ほか : 全自動化学発光免疫測定システムによる血中 FT4, FT3, TSH 測定の基礎的および臨床的検討. 日本臨床検査自動化学会会誌, 32 : , ) 古田島伸雄, 中嶋清美, 町田哲男ほか : 甲状腺関連ホルモン測定における測定機種間差の検討. 日本臨床検査自動化学会会誌, 39 : , ) 井上直哉, 畑伸顕, 小杉暉恵ほか : 全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA-CL2400によるTgAb TPOAbおよびTRAb 測定試薬の性能評価. 医療と検査機器試薬, 39 : , ) 飛田明子, 下坂浩則, 奥山恵理子ほか : AIA- CL2400によるBNP 測定試薬の基本的性能評価. 日本臨床検査自動化学会会誌, 40 : 468, )Taylor JA, Christensen RH, Rao K, et al. : B-Type natriuretic peptide and N-terminal pro B-type natriuretic peptide are depressed in obesity despite higher left ventricular end diastolic pressures. Am Heart J, 152 : , )Mizuno Y, Harada E, Katoh D, et al. : Cardiac production of B-type natriuretic peptide is inversely related to the plasma level of free fatty acids in obese individuals possible involvement of the insulin resistance. Endocrine J, 60 : 87-95, )Minai K, Ogawa T, Kawai M, et al. : The plasma B- type natriuretic peptide levels are low in males with stable ischemic heart disease (IHD) compared to those observed in patients with non-ihd. PLoS One, 9 : e108983,

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研究報告59通し.indd 技術報告 41 全自動化学発光酵素免疫測定装置 AIA CL2400 の開発バイオサイエンス事業部開発部システムグループ蔦永曉男山岸茂夫高橋実吉田聖史 1. はじめに免疫診断検査用の AIA システムは 1986 年にビジネスを開始して以降市場のニーズに応じた装置試薬項目を上市することで販売を伸ばしている AIA システム装置は大型 / 中型 / 小型の 3 機種のラインナップからなり蛍光法でありながら化学発光法に迫る高感度